【目的】葡萄霜霉病是葡萄生产上重要的单年流行病害,研究旨在构建葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)的实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测体系,为葡萄霜霉病的早期诊断和预测预报提供依据。【方法】依据GenBank中葡萄霜霉病菌cox2基因序列设计1对特异性引物(F-cox-Pv/R-Pv),建立并优化常规PCR和real-time PCR反应体系,利用葡萄霜霉病菌、葡萄炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、葡萄白粉病菌(Uncinula necator)、葡萄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、葡萄白腐病菌(Coniella diplodiella)、葡萄溃疡病菌(Botryosphaeria dothidea)、白菜黑斑病菌(Alternaria brassicae)、辣椒炭疽病菌(C.capsica)、甘草根腐病菌(Fusarium solani)、西葫芦白粉病菌(Sphaerotheca fuliginea)、番茄菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、马铃薯干腐病菌(F.equiseti)、西瓜枯萎病菌(F.oxysporum)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)等14种葡萄及其他作物病原菌和拮抗菌的菌丝DNA进行常规PCR和real-time PCR特异性检测,并对灵敏度和可重复性进行评价。运用已构建的real-time PCR体系对人工接种葡萄霜霉病菌的潜育期叶片内病原菌DNA进行定量检测,利用SPSS 19.0软件分析接种时间与叶片内葡萄霜霉病菌潜伏侵染量的关系。【结果】研究设计的引物特异性高,常规PCR仅对葡萄霜霉病菌DNA有扩增条带,为139 bp;real-time PCR检测结果表明该对引物对葡萄霜霉病菌有唯一的产物吸收峰,对其他供试菌株均未检测到产物吸收峰。常规PCR检测的灵敏度为10 pg·μL~(-1),real-time PCR的灵敏度可达到0.1 pg·μL~(-1),是常规PCR检测灵敏度的100倍。以携带目的基因片段的重组质粒为标准品,构建real-time PCR循环阈值(Ct)与模板浓度的线性关系,标准曲线y=42.27-3.36x,相关系数R~2=0.997,扩增效率为98.50%,线性范围达7个数量级,在2.4×10~3—2.4×10~9 copies/μL呈现良好的线性关系。对人工接种葡萄霜霉病菌的潜育期叶片内病原菌DNA进行real-time PCR检测,结果表明叶片内病原菌潜伏侵染量随接种时间的变化呈指数关系增长,y=6.34×10~4·e~(0.084x),相关系数R~2=0.936。该real-time PCR检测体系在接种6 h后就可以检测到葡萄霜霉病菌DNA,检测量为5.68×10~4 copies/μL病原菌DNA。【结论】构建的葡萄霜霉病菌real-time PCR检测体系的灵敏度远高于常规PCR,且特异性强、重复性好,其Ct值与模板浓度呈较好的线性关系,扩增效率高,可用于定量检测葡萄霜霉病菌的潜伏侵染量。

【目的】纹枯病是小麦生产上重要的土传病害之一,早期准确定量检测病原是病害预测预报及实现有效防控的基础。传统组织分离鉴定方法费时、程序复杂,而且无法做到准确定量。为实现小麦纹枯病早期快速准确定量检测,研究旨在建立小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)的SYBR Green I实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测方法。【方法】根据小麦纹枯病菌的β-tubilin序列,设计1对特异性引物,建立并优化SYBR Green I real-time PCR反应体系,利用小麦纹枯病菌、立枯丝核菌(R.solani)、双核丝核菌AG-A和AG-F菌株、小麦全蚀病菌(Gaeum...

【目的】纹枯病是小麦生产上重要的土传病害之一，早期准确定量检测病原是病害预测预报及实现有效防控的基础。传统组织分离鉴定方法费时、程序复杂，而且无法做到准确定量。为实现小麦纹枯病早期快速准确定量检测，研究旨在建立小麦纹枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｃｅＲｅａｌｉｓ）的ｓＹＢＲ ＧＲｅｅｎ ｉ实时荧光定量ＰｃＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰｃＲ）检测方法。【方法】根据小麦纹枯病菌的β－ｔｕＢｉｌｉｎ序列，设计１对特异性引物，建立并优化ｓＹＢＲ ＧＲｅｅｎ ｉ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰｃＲ反应体系，利用小麦纹枯病菌、立枯丝核菌（Ｒ．ｓｏｌａｎｉ）、双核丝核菌ａＧ－ａ和ａＧ－Ｆ菌株、小麦全蚀病菌（Ｇａｅｕｍ．．．

【目的】十字花科作物根肿病是一种世界性病害,早期准确定量检测病原是实现有效防控的基础,研究旨在建立一种应用于水体中检测根肿菌的实时荧光定量PCR方法。【方法】采用近年已研究并发表的一对引物。建立并优化RT-PCR反应体系,利用大肠杆菌TG-1、大肠杆菌T1-1、大肠杆菌DH5α、肺炎克雷伯菌E3、枯草芽孢杆菌XF-1、解淀粉芽孢杆菌Y2、柑橘黄龙病病原菌、假单胞菌E12、成团泛菌L9、阴沟肠杆菌C6、荧光假单胞菌df等11种病原物进行RT-PCR特异性检测,并对灵敏度、可重复性进行评价。利用该体系分别检测不同接种浓度的水体中的根肿菌。【结果】得出标准曲线的回归方程为Y=-3. 452X+35. 118,其回归系数R2=0. 996,扩增曲线在1×101～1×107拷贝/μl范围内,具有较好的线性关系,扩增效率94. 833%,相邻扩增曲线间距均匀,1×101拷贝/μl为最低检测值。熔解曲线显示,所有产物具有单一峰形,有高度扩增特异性。重复性试验变异系数小于1%。在人工接种的水体中,检测下限至少为102个孢子/m L。【结论】建立的实时荧光定量PCR方法具有快速、特异、敏感和稳定等优点,为检测根肿菌在水体中的含量提供了技术方法。

为了建立一种快速检测镰孢菌属的方法。根据Fusarium翻译延伸因子(TEF-1α)基因序列,设计并筛选其特异性引物F8-1/F8-2,能从靶标基因组DNA中特异性扩增出大小为187 bp的目的片段,建立Fusarium荧光定量PCR(RT-PCR)检测体系的灵敏度比常规PCR高104倍,且特异性良好。利用该反应体系检测不同湿度环境下病残体和土壤病残体DNA含量的动态变化。结果表明:病残体及土壤病残体DNA初始拷贝数分别为6. 90×10~(11),1. 06×10~(12)拷贝数/g,经过温度27℃、80%湿度下处理30 d病残体DNA含量下降至5. 55×10~8和0拷贝数/g,而在温度27℃、20%湿度下含量分别为8. 04×10~9,1. 30×10~9拷贝数/g。因此,建立的Fusarium实时荧光定量PCR检测体系具有特异性强、灵敏度高的特点,可以快速准确地定量检测病残体DNA的含量,为瓜类根腐病的早期预防和流行监测提供了有效的技术手段。

为了快速检测出实验动物临床样品中的金黄色葡萄球菌（SA），建立了一种普通PCR方法。同时合成3对引物，用金黄色葡萄球菌的阳性核酸DNA做模板，进行引物扩增，筛选出一对能扩增出270 bp单一目的片段的引物。逐一对该引物灵敏度、重复性和特异性进行了测试。实验结果显示，该方法具有高度的特异性，除了识别金黄色葡萄球菌基因组外，对小鼠其他常见病原菌均不发生交叉反应，具有优良的敏感性和稳定性。两个不同操作人员，在两个不同时间段，利用两台不同品牌的PCR仪器，用金黄色葡萄球菌阳性样品进行测试，结果显示此方法再现性良好。用该方法检测待测样本，效果也良好。

为准确、快速、便捷检测出土壤中根肿病菌休眠孢子量,应用所建立的根肿病菌实时荧光定量聚合酶链式反应检测技术,测定了湖南湘潭县响水乡、长沙县路口镇、桃江县桃花江镇十字花科作物根肿病发生地的42份土样的休眠孢子数量。检测结果表明,40份土样的根肿病菌休眠孢子量为(2.76×104~4.37×106)个/g;休眠孢子量≥104个/g的土壤均有根肿病发生,而休眠孢子量为8.42×102、9.78×102个/g的2份土样未发生根肿病,说明当土壤中根肿病菌休眠孢子量≥104个/g时,根肿病害易发生。

研究了生防细菌SY286菌株对葡萄霜霉病菌的抑菌效果,试验结果表明:SY286菌株在代谢过程中能够产生纤维素酶、蛋白酶和嗜铁素等抑菌代谢产物;SY286的发酵液成分可导致葡萄霜霉病菌菌丝及孢子囊出现皱缩、破裂等现象;SY286振荡培养3d,抑菌效果最大,达93.18%;60%的硫酸铵饱和度下提取的抑菌粗提蛋白对葡萄霜霉病菌的抑菌效果最好,抑菌效果可达76.30%。

为克服现有小瓜虫病的显微镜检和PCR诊断等方法在该寄生虫的感染早期阶段和环境样本检测中存在的缺陷，建立特异性强、灵敏度高的多子小瓜虫PCR检测方法，实验根据多子小瓜虫线粒体COⅠ序列设计和筛选了一对引物，经过PCR程序优化、特异性、灵敏性验证以及临床和环境样品检测分析，分别建立了普通PCR和荧光定量PCR检测方法。结果显示，本研究获得的检测引物对多子小瓜虫有较高的扩增特异性，对同属纤毛虫类的草履虫、四膜虫和肠袋虫以及常见养殖鱼类宿主异育银鲫、草鱼、尼罗罗非鱼和团头鲂等样本均无扩增；扩增特异性和灵敏度都优于文献报道的方法。其中，普通PCR最低检测的样本浓度为掠食体2.67个/μL，荧光定量PCR在掠食体0.02个/μL时依然能有效检出，荧光定量PCR检测灵敏度高于普通PCR。研究表明，在临床样本和养殖水环境样本检测应用中，基于该引物的两种PCR方法表现出很高的一致性，能有效检出潜伏感染鱼体和养殖水环境中的多子小瓜虫。本研究所建立的多子小瓜虫的检测方法特异性强、灵敏度高，适用于淡水养殖中小瓜虫病的早期诊断和病原体的检测。

为筛选出葡萄霜霉病菌的拮抗放线菌,对采自辽宁省沈阳、葫芦岛、锦州、鞍山、朝阳等地区葡萄园的23份土样中的放线菌进行分离,并对获得的119株放线菌进行防效评价,得到1株拮抗放线菌菌株QH94,其田间防效可达68.83%~89.80%。采用平板对峙培养法进行抑菌谱的测定,QH94菌株对9种病原菌有抑制作用,其中对稻瘟病菌的抑制作用最强,抑菌带宽度为10.57mm。根据菌株QH94的形态特征、培养特征、生理生化特性以及16S r DNA序列分析结果 ,将其初步鉴定为细黄链霉菌[Streptomyces microflavus(Krainsky)Waksman&Herici]。

选取杀鲑气单胞菌A层A蛋白(VapA)保守序列,利用Primer Express 2.0软件设计引物和探针。以ATCC标准株10倍系列稀释,通过血球计数板计数后进行实时定量PCR,制作标准曲线。通过SDS软件获得细菌数量(X)与Ct值的关系为:Ct=-3.1574lgX+43.6841(相关系数R2=0.992)。实时定量PCR的检测限为6个细菌。建立的方法对杀鲑气单胞菌典型株和非典型株具有较好的特异性,与其他细菌没有交叉反应。杀鲑气单胞菌实时定量PCR方法的建立,对于快速口岸检疫、临床诊断和疫病监测具有重要的应用价值。

根据GenBank中蛳鱼诺卡氏菌16S-23S rRNA基因序列设计并合成一对特异性引物,经反应体系优化后建立了检测蛳鱼诺卡氏菌的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示,该方法线性关系良好,标准曲线的相关系数为0.998;溶解曲线分析显示产物为单一的特异峰;检测灵敏度可达10 6μg/μL的DNA含量,与嗜水气单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、麦氏弧菌不发生交叉反应,具有良好的特异性。应用建立的方法在蛳鱼诺卡氏菌病爆发时期,对16份鱼体组织、养殖水体、饲料等样品进行了检测,结果 7份为阳性,与细菌分离、培养检查结果 100%相符。既能检测发病鱼,又能检出未发病且已感...

葡萄霜霉病是葡萄生产中最为严重的病害,为明确我国不同地区葡萄霜霉病菌致病力及遗传多样性,采用叶盘接种法测定采自19个省(市)的69株葡萄霜霉病菌的致病力,并使用SRAP标记技术对其遗传多样性进行分析。结果表明:不同地区的菌株间存在一定致病力分化现象,供试的69株病原菌中55%属于弱致病力菌株,36%属于中等致病力菌株,经接种后,3个寄主品种病情指数范围为0.56～88.89。根据病原菌对不同寄主的致病力,将菌株划分为弱、中、强、最强致病力4类,东北、西南和西北地区的弱致病力菌株占总数比例58%以上,华北、华东和华中地区中等致病力菌株为优势病原群体,华北和华中地区未出现强致病力菌株。对供试的69株葡萄霜霉病菌进行遗传多样分析,分析结果表明:SRAP标记扩增共得到条带269条,其中多态性条带267条,多态性比率达99.19%。聚类分析结果表明:供试菌株之间存在遗传变异现象,在相似性系数0.622处,69个菌株被聚类为5个类群,但未发现遗传分化与地理分布具有明显相关性。通过对全国19个省(市)的葡萄霜霉病菌的致病性和遗传变异情况进行综合分析,发现葡萄霜霉病菌致病力与遗传变异之间的关系较为复杂,并不是互相对应的关系,有关葡萄霜霉病菌致病力与遗传分化之间的关系尚需进一步研究。

由茶麋子葡萄座腔菌Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ ｄｏｔｈｉｄｅａ引起的山核桃Ｃａｒｙａ Ｃａｔｈａｙｅｎｓｉｓ干腐病是山核桃栽培过程中的主要病害，该病菌表现明显的＂潜伏侵染＂特性。研究山核桃树体中干腐病菌的定量检测技术对山核桃干腐病的预测预报及科学防治具有重要的指导意义。根据茶麋子葡萄座腔菌的ｅＦ１α基因设计特异性引物，通过普通聚合酶链式反应（ｐＣｒ）和实时荧光定量ｐＣｒ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｐＣｒ）扩增发现引物ｅＦｒｔ－Ｆ１／ｒ１对山核桃干腐病病菌的特异性及扩增效率较高，可稳定扩增出２３０ Ｂｐ的目标条带。应用此特异性引物建立的实时荧光定量ｐＣｒ干腐病病菌检测方法能够定量检测出山核桃植株样品．．．

选择派琴虫保守的核糖体DNAITS-2区域设计引物和TaqMan探针,通过对反应体系和反应条件进行优化,建立了实时荧光定量PCR检测派琴虫的方法。所构建方法检测质粒模板DNA的动态范围为2.6×101～2.6×107拷贝,敏感度可检测到26拷贝质粒DNA,而且与包拉米原虫、隐孢子虫等其他寄生性原虫无交叉反应,也不受贝类组织DNA的干扰。利用本研究所建立的方法对来自我国山东、福建等不同沿海海域的30份贝类样品进行检测,检出阳性样品3份。研究表明,本研究所构建的派琴虫实时荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏和特异等优点,可满足国内养殖场及进出口水生动物携带派琴虫的检测需要。