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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘林丽 王跃进
应用基因重组技术,将从华东葡萄白河-35-1中分离出的长1179 bp芪合酶(stilbene synthase,STS)基因的cDNA片段克隆入大肠杆菌-酵母菌穿梭型诱导表达载体pYES6/CT上,构建重组酵母真核表达质粒pYES6/CT-STS,转化酿酒酵母菌株INVSc1,用Blasticidin(bsd)筛选出阳性克隆转化子,经半乳糖诱导表达后进行5个时间段菌体全蛋白SDS-PAGE电泳和Western-blot分析。结果发现,诱导4 h后开始有目标带(48 ku)出现,诱导16 h开始大量且稳定表达。证明目的基因片段可以在酿酒酵母中表达,为后续基因功能的验证奠定了基础。
关键词：
芪合酶 酵母表达载体 载体构建 诱导表达
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘延琳 李华
【目的】进行中国自行筛选的专利菌种酒酒球菌SD-2a(Oenococcus oeni SD-2a)的苹果酸-乳酸酶基因在酿酒酵母中的整合型表达,使葡萄酒生产过程中的酒精发酵和苹果酸-乳酸发酵(malolactic fermentation,MLF)同时进行。【方法】克隆Oenococcus oeni SD-2a的苹果酸-乳酸酶基因mleA,以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件,以酵母整合型质粒YIp5为载体,构建重组表达质粒pYILmleA,并转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YS59,经筛选鉴定获得酵母转化子YS59/pYILmleA。进行转化子的营养缺...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
付永平 李博 王丕武 高玮 夏海丰 张卓
【目的】克隆绿色木霉β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因,并在粟酒裂殖酵母细胞中进行表达分析。【方法】利用PCR技术,从绿色木霉中克隆纤维素酶β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因的DNA序列,再通过XhoⅠ和NotⅠ2个酶切位点与粟酒裂殖酵母表达载体pREP5N连接,构建酵母真核表达载体,利用电转化方法转化粟酒裂殖酵母SP-Q01细胞,并在SP-Q01中进行表达分析,最后采用DNS法测定表达产物的酶学活性。【结果】PCR扩增得到2 380bp的bglⅠ基因序列,包括完整的CDS序列和信号肽序列,编码序列与已报道的里氏木霉纤维素酶基因序列相似性为100%;对酵母转化子进行诱导培养后,SDS-PAGE电泳检测得到大小...
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘加爱 陈蕾 林元山 张小鹃 邹洪彬 张学文
为了以酿酒酵母S78为宿主菌异源高效表达糖化酶基因,进一步扩大糖化酶基因在工业生产上的应用。运用RT-PCR法从黑曲霉中克隆得到糖化酶基因(glaA)cDNA,去除其信号肽编码区后的序列重组到酵母表达载体pVT102U/αADH1强启动子下游,并与α因子分泌肽信号序列融合。用PEG/LiAc法将构建的重组表达载体转入酿酒酵母S78菌株,筛选出的转化菌点种到可溶性淀粉平板上培养,用碘染法鉴定重组基因的表达情况。鉴定出了典型水解圈的酵母转化子,转化子接种到YPD培养基中摇瓶培养后,取发酵上清液经SDS-PAG
关键词：
黑曲霉 糖化酶 酿酒酵母 异源表达
[期刊] 水产学报
[作者]
胡澄溪 刘伟 毕燕会 周志刚
三酰甘油（TAG）合成缺陷型酿酒酵母突变株H1246常用于其他生物二酰基甘油酰基转移酶（DGAT）的基因功能鉴定。为了解外源DGAT的基因表达对酵母细胞脂质及生长的影响，实验将缺刻缘绿藻1个I型和3个II型的DGAT分别转化H1246菌株，经筛选获得tDGAT1、tDGAT2A、tDGAT2B及tDGAT2C等4株转目的基因酵母。通过显微观察、分光光度法、重量法、棒状色谱分析、气相色谱-质谱分析对酿酒酵母的形态和脂滴、细胞密度、生物量、总脂、总脂肪酸以及TAG含量进行检测。稳定生长期时的显微观察结果显示，这4个外源基因均能使H1246菌株恢复TAG的合成和贮存能力进而在细胞中出现油滴；油脂分析结果表明，tDGAT1菌株的TAG及脂肪酸含量最高，且显著高于野生型Scy62及其他3株转目的基因菌株的水平；生长性能的数据显示，4个外源基因均能使H1246菌株的细胞密度达到Scy62的水平，这可能是由于TAG的合成消耗了游离脂肪酸，以减轻其对细胞产生的伤害而致；但tDGAT1菌株的生长迟滞期明显延长，以致其生长速率最低。本研究结果表明，将缺刻缘绿藻不同类型的外源DGAT转化酿酒酵母后，使后者的生长性能及脂质含量产生不同的变化。该结果为利用基因工程改造酵母菌株以生产人类所需要的目的油脂研究奠定了基础。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
涂珺 朱平 程克棣
天然产物紫杉醇是一种重要的抗癌药。其天然来源的匮乏和缺少商业上可行的化学全合成促进了对紫杉醇生物来源的深入研究。紫杉醇的生物合成是一个复杂的多步过程,主要包括四环骨架的构建和加入各种羟基和酰基基团,其中羟基的加入由细胞色素P450氧化酶催化。我们从中国红豆杉愈伤组织细胞mRNA构建的cDNA文库中克隆得到几个P450 cDNA片段。其中一个长1 494 bp的cDNA片段,编码497个氨基酸,推断蛋白分子量为56470 Da,等电点为9.42。序列比较显示,这个推断蛋白包含多个细胞色素P450氧化酶的保守区,具有典型的细胞色素P450氧化酶的特征,进一步的比较发现其与已鉴定的东北红豆杉紫杉烷-...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张梁 石贵阳 王正祥 章克昌
采用基因敲除技术,在工业酿酒酵母染色体DNA上的甘油代谢途径关键酶基因GD P 1中,整合入来源于里氏木霉的β-葡萄糖苷酶基因bgⅡl,通过提高G 418浓度筛选得到多拷贝整合子。结果表明,整合子利用纤维二糖的能力得到提高,产甘油能力下降,外源基因表达稳定;引入外源基因后,其对酵母增殖能力没有大的影响,仅形态发生变化;在以微晶纤维素为原料,结合纤维素酶发酵时,与亲代工业酿酒酵母相比,发酵液乙醇浓度最高增加69%。
[期刊] 浙江林学院学报
[作者]
杨晔 蒋晶 乔桂荣 周婧 陈银 何正权 李海营 卓仁英
为了研究旱柳Salix matsudana高耐盐无性系I-32的耐盐机制,分离其耐盐相关基因,实验以筛选出的高耐盐旱柳无性系I-32为材料,盐胁迫后提取总核糖核酸(RNA),纯化mRNA,利用改良SMART(switching mechanism at 5’end of RNA transcript)技术合成了全长cDNA,回收500bp以上cDNA大片段克隆到大肠杆菌Escherichia coli和酵母穿梭载体pYES2.1中,建成旱柳全长cDNA文库,对随机挑取的阳性克隆进行聚合酶链式反应(PCR)鉴定,插入片断平均值为1000bp左右,说明所构建的文库达到了用于目的基因分离筛选和表达的...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
黄鹭强 张丽萍 雷秀清 林志钦 郑宝东
以粟酒裂殖酵母基因组DNA为模版,逆转录获得cDNA;以cDNA为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增,得到苹果酸通透酶(mae1)基因,将其与pMD-18T连接并测序.结果表明cDNA全长为1316 bp,编码438氨基酸,分子质量49ku,与已报道的mae1基因序列的同源性达到99%.mae1与整合型表达质粒pSH47连接后,用重组的表达质粒转化产朊假丝酵母,经PCR验证筛选阳性克隆子.通过对转化子的摇瓶筛选,发现重组子的降酸幅度均大于原始菌株,培养40 h降解了48.6%的L-苹果酸,降解率比原始菌株提高了9.8%.
[期刊] 华北农学报
[作者]
张慧荣 赵萍萍 冯杰 王迎春 郑琳琳
黄烷酮-3-羟基转移酶(F3H)是植物黄酮合成途径上游的一个关键酶,它催化黄烷酮C3位羟化,形成二氢黄酮醇。构建长叶红砂Rt F3H3基因酵母表达载体,为进一步研究Rt F3H3基因功能奠定基础。基于高通量转录组测序结果,利用RT-PCR技术克隆获得长叶红砂F3H3(Rt F3H3,GenBank登录号LC055546)基因,其开放阅读框长1 014 bp,编码338个氨基酸,推测蛋白分子量为38.46 k Da,理论等电点为5.7。通过定量RT-PCR研究发现,Rt F3H3在茎中表达量较高,在根和叶中表达量较低。不同程度Na Cl(100,300,500 mmol/L)和不同时间UV(12...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
李雯 陶妍
从鲤鱼鳃组织中分离克隆到一种新的g型溶菌酶同工型基因(CLYG).该基因的全长cDNA为558 bp,除去终止密码子,编码185个氨基酸,推断的氨基酸序列没有信号肽,含3个催化位点(谷氨酸73、脯氨酸86和天冬氨酸97),具有鱼类g型溶菌酶的基本特征.通过PCR方法在CLYG基因的5'和3'端分别引入XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点.扩增到的目的片段与表达载体pPICZαA连接构建重组表达载体pPICZαA-CLYG后,电转至毕赤酵母X-33,筛选得到的阳性转化子在1.0%甲醇、29℃、pH 6.0的条件下诱导
关键词：
鲤鱼 g型溶菌酶 毕赤酵母 重组表达
[期刊] 中国农业科学
[作者]
杜君 李海兰 李慧 战吉宬 黄卫东
【目的】明确铜离子胁迫对模拟葡萄汁培养基和真实酿酒葡萄汁培养基中酵母发酵行为的影响及其差异性。【方法】以模拟葡萄汁和赤霞珠葡萄汁为发酵培养基,分别添加CuSO4以设置0.05mmol·L-1和0.50mmol·L-1两个不同的Cu2+浓度,研究铜胁迫对两种培养基中酿酒酵母生长和发酵过程的影响。【结果】铜胁迫能够降低两种培养基中酵母的存活率。0.05mmol·L-1Cu2+严重抑制了模拟葡萄汁的发酵过程,其产生CO2和酒精的量分别为对照组的26.47%和30.76%,残糖量显著增多。而0.05mmol·L-1Cu2+对赤霞珠葡萄汁发酵过程基本没有影响。0.50mmol·L-1Cu2+几乎完全抑制...
关键词：
铜 模拟葡萄汁 赤霞珠葡萄汁 发酵
[期刊] 中国农业科学
[作者]
孔彩琳 许引虎 黄杰 冯林 严忻怡 陶永胜
【目的】研究酿酒酵母多糖对葡萄酒果香酯类物质水解呈香的表观基质效应，探究酿酒酵母多糖在稳定产品果香、延长货架期方面的应用潜力。【方法】以酿酒酵母为材料，利用热水浸提法、碱法提取得到酵母多糖，并通过紫外分光光度计、气相色谱以及高效液相色谱解析酿酒酵母多糖的基本组分。配置含有果香酯类物质常规浓度的模拟葡萄酒溶液，并作酵母多糖处理，多糖浓度在0—2.0 g·L~(-1)范围作梯度设置。酵母多糖对果香酯类物质挥发性的影响采用静态顶空方法分析，随后不同处理模拟酒在4℃下贮藏6个月，定期取样监测果香酯类物质的含量变化。最后通过感官分析评价6个月后不同处理模拟酒的香气特征。【结果】通过仪器分析得到酿酒酵母多糖总多糖含量占比为（72.61±3.29）%，蛋白质含量占比为（11.20±0.02）%，其主要单糖组成为甘露糖和葡萄糖，二者的摩尔比1.790∶1；该多糖的高分子量组分为18、163和21 819 kD，低分子量组分为576 Da。静态顶空分析方法表明，多糖处理可以降低模拟酒中乙酸酯的挥发性，以0.8 g·L~(-1)的多糖处理效果最好；而多糖处理可以提高模拟酒中乙醇酯的挥发性。定期采样数据结果发现，在模拟葡萄酒贮藏6个月期间，乙醇酯的水解速率显著高于乙酸酯；相比于对照组，0.4—0.8 g·L~(-1)多糖处理可以分别将乙酸酯和乙醇酯的水解率降低10%—40%和3.7%—26.7%。感官分析结果显示，在贮藏6个月后，多糖处理的模拟酒中温带酸果、温带甜果、蜜饯类和花香香气特征值会显著高于对照组。【结论】经模拟体系研究得出，在葡萄酒贮藏期间添加0.4—0.8 g.L~(-1)酿酒酵母多糖可以减缓果香酯类物质的水解，稳定葡萄酒的果香，对延长产品货架期有潜在的应用价值。
关键词：
酵母多糖 果香酯类物质 水解 基质效应
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王春晓 俞俊竹 周文亚 许引虎
葡萄皮上天然存在着非酿酒酵母属酵母（non-Saccharomyces），主要在葡萄酒浸渍和发酵初期发挥作用，近年来非酿酒酵母属酵母在葡萄酒发酵中的应用受到越来越多的关注。相对于酿酒酵母，非酿酒酵母属酵母在酒精发酵中具有较弱的发酵力，可将还原糖转化为乙醇及其他代谢副产物，是生产复杂风味和低酒度葡萄酒的潜在优良酵母。不同非酿酒酵母属酵母菌种在葡萄酒发酵应用中具有不同的代谢特征，选择具有一定特征的优良非酿酒酵母属酵母应用于发酵中，可以提高葡萄酒的特色化品质。本研究在总结商业化非酿酒酵母属酵母的种类、酿造特点和应用方式的基础上，重点综述了不同非酿酒酵母属酵母对葡萄酒颜色、香气、口感和安全健康4个方面的积极作用、代谢机理和研究热点：具有高产酸、多糖、胞外丙酮酸及低吸附性等特性的非酿酒酵母属酵母可通过不同代谢机理促进葡萄酒颜色的稳定；不同非酿酒酵母属酵母通过低产乙醇、乙醛、降低挥发性酚类，高产乙酸乙酯、乙酸酯类化合物、乙酯类化合物、高级醇、与萜烯或硫醇释放相关的酶类等途径促进葡萄酒果味香气的提升，增加香气复杂性；非酿酒酵母属酵母通过高产甘油、多糖和乳酸，降解苹果酸等方式调节葡萄酒的口感特征；非酿酒酵母属酵母作为生物防治剂可以降低葡萄酒酿造中二氧化硫的用量，通过代谢降解作用减少有毒化合物，提升葡萄酒的安全质量。本文进一步解析了非酿酒酵母属酵母的基因组和微卫星位点分析研究现状，探讨了目前非酿酒酵母属酵母葡萄酒发酵应用研究的主要接种策略，提出了未来研究仍需关注的热点方向，为非酿酒酵母属酵母在葡萄酒酒精发酵中的应用研究提供理论参考。
[期刊] 华北农学报
[作者]
皇甫海燕 燕孟娇 宋培玲 郝丽芬 皇甫九茹 贾晓清 李子钦
为探讨ＰＧＩＰ蛋白与ＰＧ的互作及ＰＧＩＰ基因在油菜抗黑胫菌病中的作用，根据Ｇｅｎ Ｂａｎｋ中油菜ＰＧＩＰ９、ＰＧＩＰ１５ＣＤＳ序列设计引物，并去掉信号肽序列，以接种黑胫病病原菌ＬｅＰｔｏＳＰｈａｅｒＩａ ＢＩＧＬｏＢｏＳａ（菌株ｎＭ－１）７ Ｄ后油菜叶片总ｒｎａ反转录的Ｃ Ｄｎａ为模板，ＰＣｒ扩增出ＰＧＩＰ９、ＰＧＩＰ１５除信号肽以外的编码区片段，并克隆到巴斯德毕赤酵母表达载体Ｐ ＰＩＣＺαａ中构建重组质粒Ｐ ＰＩＣＺαａ－ＰＧＩＰ９、Ｐ ＰＩＣＺαａ－ＰＧＩＰ１５。重组质粒经单、双酶切、菌落ＰＣｒ筛选鉴定后热激化法转化酵母细胞ＰＭａＤ１６，再经ＺｅｏＣＩｎｔＭ的ＹＰＤ平板和菌落ＰＣｒ筛选鉴定．．．
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