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[期刊] 中国农业科学
[作者]
张英 原青云 任芳 胡国君 范旭东 董雅凤
【背景】葡萄浆果内坏死病毒（grapevine berry inner necrosis virus,GINV）是近年来在中国报道的一种正单链RNA病毒，该病毒发生普遍且危害严重。高灵敏的检测技术是病毒田间监测和无病毒苗木培育的关键。【目的】建立灵敏度较高的GINV逆转录实时荧光定量PCR(reverse transcription real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测体系；明确不同葡萄砧木对GINV的敏感性；明确GINV在寄主植株中的时空分布规律，为该病毒的监测预警提供技术支撑。【方法】根据GenBank已登录GINV的复制酶（replicase,RP）、移动蛋白（movement protein,MP）和外壳蛋白（coat protein,CP）基因保守序列设计6套引物，通过常规RT-PCR和RT-qPCR筛选特异性强、扩增效果好的引物。再通过对退火温度和引物浓度等反应条件的优化建立GINV的SYBR Green I染料法RT-qPCR检测体系，并进一步对该技术的灵敏度、特异性和田间适用性进行评价。将GINV接种到贝达、SO4、101-14、140R和1103P 5种葡萄砧木上进行症状观察和病毒检测，以筛选GINV敏感性较高的指示植物。基于所建立的RT-qPCR技术对接种GINV葡萄砧木的不同生长时期、不同部位样品进行GINV检测，从而明确GINV在不同葡萄砧木的时空分布规律。【结果】建立了GINV SYBR Green I染料法RT-qPCR检测技术体系，其最佳引物为GINVRPYGF2/R2，最佳引物浓度为300 nmol·L-1，最佳退火温度为58.4℃。该技术对GINV的检测特异性强，其检测灵敏度达常规RT-PCR的1 000倍。症状观察结果表明贝达感染GINV的症状最为严重，表现为叶片系统性坏死，而其他砧木叶片仅表现褪绿斑驳和环斑症状。RT-qPCR检测结果表明GINV在EL27时期（坐果期）的相对含量最高，5个品种间的病毒相对含量在EL12（花序分明期）和EL27时期间无显著差异，EL31时期（果实增大期）的贝达与SO4、101-14、140R和1103P的病毒相对含量存在显著差异；GINV的相对含量在不同组织部位存在较大差异，由高到低依次为下部叶片、上部叶片、上部茎秆、下部茎秆、根部。【结论】建立了灵敏度高、特异性强的GINV RT-qPCR检测方法，利用该方法明确了GINV在不同葡萄砧木的时空分布规律。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
张永江 辛言言 李桂芬 乾义柯
【目的】葡萄Ａ病毒（ＧｒＡｐｅｖｉｎｅ ｖｉｒｕｓ Ａ，ＧｖＡ）是葡萄皱木复合病的重要病原之一，以带毒种苗的嫁接为田间主要传播途径。使用无毒葡萄苗木进行生产是控制该病毒病害的根本措施，而简便灵敏的检测技术是筛选无毒种苗的有效保证。为此，开展针对ＧｖＡ的反转录环介导等温扩增技术（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒＡｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉＡｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍＡｌ ＡｍｐｌｉｆｉｃＡｔｉｏｎ，ｒｔ－ｌＡｍｐ）研究，旨在建立其ｒｔ－ｌＡｍｐ特异性检测方法。【方法】通过比对分析ＧｖＡ的ｃｐ（ｃｏＡｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）基因序列并经引物设计软件ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｐｌｏｒｅ ４．０设计，获得６条检测．．．
[期刊] 中国水产科学
[作者]
罗卫 李惠芳 刘荭 陈焕春 范万红 刘宗晓 田飞焱 王侃 吕建强
根据GenBank中登录的鱼类神经坏死病毒CP基因序列,选择高度保守区域设计引物和TaqMan荧光探针,通过对实时荧光RT-PCR反应条件进行优化,建立了用于检测鱼类神经坏死病毒的实时荧光RT-PCR方法。利用该方法检测鱼类神经坏死病毒及其他多种常见的水生动物RNA病毒,结果只能检测到目的病毒,表明其具有良好的特异性。灵敏性试验发现,其最低检测限可达1.2pg/μL的总RNA。与RT-PCR的灵敏度对比试验表明,其敏感度比RT-PCR高100倍。对同一样品进行检测,在组内及组间的变异系数分别为0.9%以及1.5%,证实其重复性极好,并且从抽提核酸到得出结果仅需4h。对临床500份样品进行鱼类神...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
刘淼 徐黎明 卢彤岩 赵景壮 曹永生 刘红柏 尹家胜 张金凤 冯剑
将逆转录环介导的等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)引入到鱼类的传染性造血器官坏死病病毒(infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV)检测中,建立了简单、快速、灵敏的IHNV检测方法。针对IHNV的聚合酶蛋白基因(polymerase protein,L)设计特异性引物,以IHNV基因组RNA为模板,在反转录酶和Bst DNA聚合酶的作用下进行RT-LAMP,反应产物添加SYBR Green I荧光染料后,肉眼观察阳性样本表现为荧光...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
周会玲 李嘉瑞
通过对巨峰、红地球、秋红、秋黑4个葡萄品种果实结构的比较,探讨了葡萄果实耐贮性的生物学原理。结果表明,葡萄果柄耐拉力大小与果柄、果蒂截面积以及果刷大小和维管束数量呈正相关,与单位面积果柄和果蒂上所承受的浆果自重呈负相关,而与果皮厚度、果粒质量无明显关系;葡萄浆果耐压力强弱不仅受果肉质地的影响,还与果粒细胞大小、分布、排列有一定关系,但与果皮厚度、果粒质量关系不大;葡萄浆果耐压力和果柄耐拉力之间无明显关系。
关键词：
葡萄 果实结构 耐拉力 耐压力
[期刊] 实验技术与管理
[作者]
姚继英 董文凤 杨玮 田永路 李夏莹
为了快速检测出实验动物临床样品中的金黄色葡萄球菌（SA），建立了一种普通PCR方法。同时合成3对引物，用金黄色葡萄球菌的阳性核酸DNA做模板，进行引物扩增，筛选出一对能扩增出270 bp单一目的片段的引物。逐一对该引物灵敏度、重复性和特异性进行了测试。实验结果显示，该方法具有高度的特异性，除了识别金黄色葡萄球菌基因组外，对小鼠其他常见病原菌均不发生交叉反应，具有优良的敏感性和稳定性。两个不同操作人员，在两个不同时间段，利用两台不同品牌的PCR仪器，用金黄色葡萄球菌阳性样品进行测试，结果显示此方法再现性良好。用该方法检测待测样本，效果也良好。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
杨洋 张伟 袁耀武 钟晓英 马雯
目的利用PCR技术,无需增菌,直接检测乳品中的金黄色葡萄球菌。方法通过溶剂提取的方法从人工样品中提取模板,以金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因(nuc)为靶基因,经过PCR扩增得到279bp的产物。经过DNA测序证实该产物为目的扩增产物。采用PCR方法实际检测了乳品中的金黄色葡萄球菌,同时,与国标GB4789.10—94方法及两种快速检测致病性金黄色葡萄球菌测试片PetrifilmRSA.CountPlate及Baird-parker+RPFAgar进行了比较。结果PCR方法的灵敏度高,全脂乳和脱脂乳检测的检出限为10CFU/ml,奶酪检测的检出限为55CFU/g,可在6h内完成对乳品中金黄色葡萄球...
关键词：
PCR 检测 乳品 金黄色葡萄球菌
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
梁红茹 范芷仪 蔡秀珠 付小哲 林强 刘礼辉 黄志斌 牛银杰 林蠡 李宁求
【目的】建立鳜弹状病毒(SCRV)和传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的双重PCR检测方法。【方法】分别针对SCRV N基因和ISKNV MCP基因的保守区域设计特异性引物,通过优化退火温度和引物用量(μL)比,建立SCRV和ISKNV的双重PCR检测方法,并对该方法的敏感性和特异性进行检验。应用建立的双重PCR方法对20份临床样品进行单一和双重PCR检测,比较单一和双重PCR的检测结果。【结果】成功建立了SCRV和ISKNV双重PCR方法,该法特异性较强,对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、神经坏死病毒(NNV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)、罗非鱼湖病毒(TiLV)等鱼类常见病毒无扩增;敏感性较好,对2种病毒DNA的检测下限均为0.01 ng/μL。20份临床样品的双重PCR样品检测结果显示,3份为SCRV阳性,11份为ISKNV阳性,2份为SCRV和ISKNV混合感染,结果与单一PCR检测结果一致。【结论】建立的SCRV和ISKNV双重PCR检测方法特异性较强,敏感性较好,可用于鳜鱼SCRV与ISKNV的快速鉴别诊断和分子流行病学调查。
[期刊] 水产学报
[作者]
李晨 王崇明 曲朋 黄倢
为更好地实现对养殖海区栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)的快速诊断和分子流行病学的调查,以及AVNV的疫情监测,选择AVNV全基因组序列中的保守区段,应用Accelrys gene 2.5软件设计一对巢式引物,用于AVNV的检测。结果显示,引物的扩增片段分别为979和548 bp。实验优化了PCR体系中Mg2+和dNTPs浓度及扩增程序中的退火温度,并建立了完善的AVNV巢式PCR检测技术。研究表明,该PCR检测技术具有较高的敏感性,可稳定检测出5 pg扇贝样品组织总核酸中5×10 copies的病毒粒子。
关键词：
栉孔扇贝 急性病毒性坏死病毒 巢式PCR
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
张玉满 田砚亭 罗晓芳
在建立‘藤稔’等５个葡萄品种离体培养快速繁殖体系的基础上，通过热处理和微茎尖脱毒培养获得了再生植株；并经过ＰＡＳ－ＥＬＩＳＡ和长臂光敏生物素标记ＧＦＬＶ－ＣＰ基因ｃＤＮＡ探针检测．结果表明白天３８℃夜晚３５℃处理脱除ＧＦＬＶ效果最佳；多次继代培养也有脱除ＧＦＬＶ的作用．从而首次获得了‘藤稔’、‘红地球’、‘９３０７’３个葡萄品种的脱除ＧＦＬＶ的试管苗．ＰＡＳ－ＥＬＩＳＡ与探针平行检测的结果还表明，ＰＡＳ－ＥＬＩＳＡ检测以Ｐ／Ｎ＜１作为阴性标准更为可靠
[期刊] 中国水产科学
[作者]
陈信忠 苏亚玲 龚艳清 黄丽莎 俞秀霞 苏永全
神经坏死病毒(Nervousnecrosisvirus)是导致多种海水鱼类神经性病害的致病原。发病及死亡的石斑鱼除了表现神经异常症状外,无明显的临床病症,体表及内脏组织也未发现明显病变及寄生虫感染。2003年4～8月,应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从福建南部人工养殖的5种石斑鱼即紫石斑鱼(Epinepheluslanceolatus)、马拉巴石斑鱼(E.malabaricus)、青石斑鱼(E.awoara)、赤点石斑鱼(E.akaara)和云纹石斑鱼(E.moara)中检出5个神经坏死病毒分离株。检测了76份石斑鱼样品,这些石斑鱼NNV病毒的平均感染率约为90%。对这些病毒的RT...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
惠竹梅 焦旭亮 张振文
【目的】分析山地和平地赤霞珠葡萄(Vitis viniferaL.cv Cabernet Sauvignon)的光合作用特性,为形成持续发展的葡萄与葡萄酒生产体系提供依据。【方法】采用LI-6400便携式光合测定仪,分析了陕西省耀州区山地和平地两个葡萄园中赤霞珠葡萄浆果膨大期叶片的净光合速率、蒸腾速率、胞间CO2浓度和气孔导度等生理生态指标。【结果】山地和平地赤霞珠葡萄的净光合速率日变化相似,均表现出双峰曲线,首峰出现在上午10:00,次峰小于首峰,出现在下午15:00以后;山地和平地赤霞珠葡萄叶片的净光合速率、蒸腾速率、胞间CO2浓度和叶绿素含量差异显著,水分利用效率和气孔导度差异不显著,在...
关键词：
渭北旱塬 赤霞珠 光合特性 浆果膨大期
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
任国慧 陶然 王晨 孙欣 房经贵
以避雨栽培条件下葡萄品种的‘京秀’‘巨星’‘甬优一号’和‘藤稔’为试验材料,分析了葡萄浆果着色差异的原因并进行相关分析,同时调查研究了这4个品种葡萄浆果生长发育过程中的主要性状指标以及果皮色泽的变化规律,并对花色苷合成相关重要基因的表达进行了分析。结果表明:4个品种葡萄果穗先着色的部位是果穗肩部,果粒先着色的部位是果粒尖部和中部。在葡萄成熟过程中,4个品种葡萄果面光泽明亮度(L*值)和颜色组分b*值均下降,颜色组分a*值以及红色葡萄果实颜色指数(CIRG)均增大。同时,4个品种葡萄的花色苷含量与其可溶性固形物及CIRG均呈正相关,‘京秀’‘巨星’‘藤稔’和‘甬优一号’的可溶性固形物含量与花色苷...
关键词：
葡萄 着色 UFGT MYBA 基因表达
[期刊] 海洋水产研究
[作者]
杨冰 宋晓玲 黄倢 史成银 刘莉 刘庆慧 宋微波
对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)病是国际兽疫局(OIE)划定的甲壳类其他重要疾病之一,它分布较广,危害严重,对世界对虾养殖业发展影响重大。本文根据Genbank登录的IHHNV基因序列(AF218266),设计了1对特异性引物,从纯化的IHHNV DNA和感染IHHNV凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)组织DNA中成功地扩增出产物大小为703bp的DNA片段,该对引物对IHHNV DNA的检测灵敏度为19. 85fg(8. 83×103 病毒拷贝),与健康对虾组织DNA、对虾白斑综合征病毒(WSSV) DNA及对虾肝胰腺细小病毒(HPV) DNA无交叉反应。本...
[期刊] 华北农学报
[作者]
郑燕棠 曹为玉 张福庆 金红 赵万英 朱海英
葡萄卷叶病毒(Grapevine leafroll virus)是葡萄的重要病害,罹病葡萄明显地延迟浆果成熟二周至一个月,且着色差,糖分降低6％,减产25％以上。 1988～1990年按照美国病毒学专家D.Gonsalues介绍的方法,在国内首次应用酶联法(ELISA)检测出葡萄卷叶病毒。现简报如下。 一、材料和方法 1.葡萄测试标样513份,采自天津果园等处。 2.GLRV抗血清和γ球蛋白酶结合物。
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