[目的]本文旨在研究苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)、4-香豆酸-辅酶连接酶基因(4CL)和肉桂醇脱氧酶基因(CAD)在葡萄(Vitis vinifera L.)‘白罗莎’核木质素合成过程中的作用,进而探究其在应答赤霉素(GA)调控果实发育尤其在种子发育过程中的潜在作用,分析其在诱导果实无核过程中的作用。[方法]采用生物信息学分析、基因芯片和RT-qPCR等方法,对葡萄VvPAL、Vv4CL和VvCAD基因定位、结构和启动子作用元件分析,对其编码蛋白相似性、结构域以及互作蛋白进行分析,并鉴定其应答GA在果实不同组织不同时期的表达模式。[结果]葡萄VvPAL、Vv4CL和VvCAD与其他物种同源分析比对发现,其内含子与外显子数量及其分布相似。基因启动子分析表明,3个基因均含有胚乳发育相关组织特异性元件,且Vv4CL基因含有GA响应元件。3个基因所编码蛋白进化保守性较强,与其他物种比对后发现它们含有相同的蛋白功能结构域并且作用元件相似。亚细胞定位预测显示其主要集中在细胞质和细胞膜中表达,其互作蛋白主要是肉桂酸-4-羟化酶(C4H)、咖啡酸氧甲基转移酶(OMT)等木质素合成过程中的关键酶。葡萄芯片电子表达谱发现,VvPAL和Vv4CL基因在根、茎等木质化程度相对较高的组织中高表达,而VvCAD基因则只在种子中相对高表达。RT-qPCR结果显示,GA在种子某些特定时期极显著下调VvPAL、Vv4CL、VvCAD基因的表达。[结论]VvPAL、Vv4CL和VvCAD基因参与葡萄果实发育过程的调控,且GA可能通过下调这3个基因的表达从而抑制葡萄核发育。

[目的]本文旨在研究VvAGL11和VvAGL15在应答赤霉素(GA3)信号诱导葡萄无核果实发育过程中的作用。[方法]以‘巨峰’葡萄为试材,鉴定了VvAGL11和VvAGL15的c DNA全长序列,并通过分析基因的启动子顺式作用元件预测其潜在功能,同时运用RT-qPCR方法检测对照和GA3处理组葡萄VvAGL11和VvAGL15的时空表达水平。[结果]GA3处理能够诱导葡萄果实无核化,使葡萄果粒和果穗显著伸长,穗轴增粗。同时,鉴定到VvAGL11(MG581423)和VvAGL15(MG581424)的c DNA全长序列。VvAGL11和VvAGL15蛋白序列与可可和棉花的亲缘关系较近;二者均含有MADS-MEF2-like和K-box家族保守结构域,属于MADS-box转录因子家族;其主要二级结构元件为α-螺旋和无规则卷曲,且主要定位于细胞核中,蛋白结构具有保守性。启动子顺式作用元件分析显示:二者均含有响应赤霉素和胚乳发育相关的motifs。RT-qPCR分析显示,在果实硬核期和转色期的种子中,VvAGL11和VvAGL15的表达量较高,而GA3处理能够显著抑制其在种子中的表达。[结论]鉴定到MADS-box基因家族中的2个成员,分别为VvAGL11和VvAGL15。GA3处理可抑制VvAGL11和VvAGL15在种子区的表达,影响种胚的正常发育,从而形成无核果实。

【目的】明确DELLA蛋白基因在葡萄基因组数据库中的数量、结构和组织表达差异,探究DELLA蛋白在葡萄赤霉素(GA)信号传导及葡萄无核果实发育机理中的作用机制。【方法】基于拟南芥、水稻等植物中的DELLA蛋白基因,利用HMMER程序和NCBI的CDD程序鉴定葡萄基因组中的DELLA蛋白基因;以‘白罗莎里奥’葡萄品种为试材,采用PCR技术克隆3个DELLA蛋白基因的c DNA全长序列;通过启动子作用元件分析预测其潜在功能;利用生物信息学软件对其染色体定位、基因结构、系统进化、理化特性、亚细胞定位及蛋白互作等进行分析;利用农杆菌介导的烟草瞬时表达技术分析DELLA蛋白的亚细胞定位情况;采用q RT-PCR方法检测葡萄DELLA蛋白基因应答GA在果皮、果肉、种子(或种子区)的时空表达特征。【结果】鉴定得到3个葡萄DELLA蛋白基因,克隆并验证其精确序列,分别命名为Vv GAI1(VIT_201s0011g05260)、Vv RGA(VIT_214s0006g00640)及Vv SLR1(VIT_211s0016g04630),其染色体定位、开放阅读框(ORF)大小、编码氨基酸数量分别为:Chr1、1 773 bp、590个;Chr14、1 710 bp、569个;Chr11、1 599 bp、532个。基因结构分析表明其DNA序列均无内含子,只有1个外显子,基因结构高度保守。进化分析显示Vv GAI1与Vv RGA亲缘关系较近,被聚类为一组,而Vv SLR1为另一组。3个基因的启动子均含有响应赤霉素和胚乳发育相关的作用元件,表明它们可能参与响应GA信号传导和胚乳发育过程。亚细胞定位结果显示3个DELLA蛋白均定位于细胞核。q RT-PCR结果显示除果皮中Vv SLR1在近成熟期具有表达高峰外,其余均在幼果期高表达,且外源GA处理均不同程度降低了3个DELLA蛋白基因在葡萄果皮、果肉和种子区的表达,尤以种子区下调水平最为显著。蛋白互作分析表明3个DELLA蛋白均为葡萄GA信号传导的核心作用元件,均可能与GIDI1和SLY1互作参与葡萄GA信号传导。【结论】葡萄基因组中含有3个DELLA蛋白基因家族成员;不同物种间DELLA蛋白结构高度保守;GA可能通过负调控这3个成员参与葡萄果皮、果肉和种子区的发育,且3个成员均可能通过应答GA信号调控葡萄无核果实的发育。

为了对四川地区巨峰葡萄无核化栽培提供一定的科学指导,本实验以巨峰葡萄为试材,分别在初花期和盛花后12 d进行2次处理,研究不同浓度赤霉素(GA3)和链霉素(SM)对巨峰葡萄无核率和果实发育的影响。结果表明:各处理都能使巨峰葡萄的无核率大幅度提高,GA3和SM混合处理产生的无核效应明显大于单独使用GA3;GA350 mg/L、GA3100 mg/L与SM 100 mg/L、SM200 mg/L搭配的2个组合均实现了完全无核化。从无核果实综合性状来看,两次处理的最佳方案为GA3100 mg/L+SM 200 mg/L。

为了探明‘峰后’葡萄赤霉素(GA3)处理后促使果粒变长的原因和VvSEP3基因在果实早期发育中的作用,在开花前利用0.1mg/g GA3处理花序并通过原位杂交分析了VvSEP3基因的表达。结果显示:GA3处理提高了峰后葡萄的坐果,增加了果形指数,从开花后14d开始到开花后56d,GA3处理后的果实纵径始终大于同时期的对照果实,解剖学结构研究表明,中果皮的细胞膨大从开花后7d开始明显大于同时期发育的对照果粒。VvSEP3基因在开花期的柱头、花柱、横膈膜以及胚珠的珠心组织中有表达,开花后主要在子房壁中表达,当幼胚发育时在维管束组织和胚乳组织中有所表达。本研究显示GA3处理后明显增加峰后葡萄的果形指...

【目的】鉴定葡萄miR164s(VvmiR164a/b/c/d)及其靶基因，明确VvmiR164s及其靶基因应答外源赤霉素在葡萄单性结实过程中的调控作用。【方法】以‘魏可’葡萄（Vitis vinifera L. Wink）为试材，利用miR-RACE、PCR、RLM-RACE与PPM-RACE、qRT-PCR及生物信息学等技术，分析VvmiR164s-VvNAC100模块应答外源赤霉素在葡萄单性结实过程中的时空表达特征及其潜在功能。【结果】赤霉素在花前处理‘魏可’葡萄，可诱导其单性结实，导致葡萄的无核。克隆鉴定了VvmiR164a/b/c/d的精确序列，预测到其4条靶基因VvNAC100-1、VvNAC100-2、VvNAC098、VvNAC021，结合匹配程度与前期数据，在此重点分析靶基因VvNAC100-2，并将其命名为VvNAC100。克隆鉴定靶基因VvNAC100，验证其裂解位点，并对其开展蛋白进化、染色体定位及结构分析。VvNAC100裂解位点位于miRNA 5′端的第9位与第11位，裂解频度为17/20与11/20，定位于葡萄的Chr14上，编码363个氨基酸，含有一个NAM结构域，且其定位于细胞核。VvNAC100蛋白与其他物种氨基酸序列保守性较高，功能相似，其中与辣椒、烟草等物种亲缘关系较近。VvMIR164a/b/c/d的启动子与其靶基因VvNAC100的启动子均包含多种激素作用元件，表明其可能通过响应不同的激素来参与葡萄生长发育的调控。RT-qPCR结果显示，随着葡萄子房的发育，VvmiR164b的表达水平呈下降趋势，其靶基因VvNAC100在子房发育前期呈上升的表达趋势，具有一定的负相关，而VvmiR164a/c/d与VvNAC100表达模式相似，呈现一定的正相关；GA处理后，VvmiR164a/c/d在葡萄子房单性结实过程中的表达极显著地上升，进而也显著抑制了VvNAC100在这一时期的表达，从而促进了VvmiR164a/c/d-VvNAC100表达水平的负相关；但VvmiR164b在GA处理后表现出下降的趋势，且其与VvNAC100的表达水平呈现一定的正相关，表明GA处理增强了VvmiR164a/c/d对VvNAC100的负调控，减弱了VvmiR164b对VvNAC100的负调控作用。【结论】VvNAC100是VvmiR164家族VvmiR164a/b/c/d的真实靶基因；在葡萄单性结实过程中，赤霉素诱导了VvmiR164a/c/d对靶基因VvNAC100的负调控作用，抑制了VvmiR164b对靶基因VvNAC100的负调控作用，VvmiR164a/c/d是VvmiR164家族参与赤霉素诱导葡萄单性结实的主效因子。

【目的】4CL是木质素生物合成途径中的关键合成酶,通过对4CL基因的遗传进化分析,为其研究和利用提供理论依据。【方法】利用生物信息学手段,对4CL基因完整cDNA和编码氨基酸序列进行数据挖掘,利用Mega软件、ExPASy的Prosite数据库、NCBI的Conserved Domains数据库,进行4CL基因核酸和蛋白质水平上的遗传进化分析。【结果】构建了4CL基因的系统发生树,揭示出植物中的4CL基因聚类与植物分类大体一致,主要以基因家族的形式存在,但基因家族中部分基因存在着结构和功能的分化,4CL基因中存在着GC含量偏高和偏低两大类基因。4CL基因编码的氨基酸序列保守区高度相似,但是在单...

【目的】早熟、具有玫瑰香味的鲜食葡萄具有较广阔的市场前景,了解各类香气组分及相关代谢途径在果实发育过程中的变化规律,把握香气组分形成的关键时期,为早熟葡萄品种品质调控技术的提出提供理论依据。【方法】以‘贝达’嫁接的4年生早熟葡萄品种‘瑞都香玉’为试材,使用顶空固相微萃取结合气相色谱与质谱联用技术,测定在幼果发育期(花后第3周)至过熟期(花后第12周)果实中挥发性组分的变化。根据各组分的变化探究相关代谢途径的更替,并利用主成分分析确定发育阶段与各类香气组分间的关系。【结果】根据可溶性固形物及可滴定酸含量的变化可以确定‘瑞都香玉’葡萄在花后第5周即可进入果实转色/软化期,花后第9周进入果实成熟期。...

【目的】分离和克隆‘藤稔’葡萄内根-贝壳杉烯氧化酶基因(VvKO)、GA2-氧化酶基因(VvGA2ox2和VvGA2ox4)、GA3β-羟化酶基因(VvGA3ox4)和GA20-氧化酶基因(VvGA20ox1)等5个重要赤霉素合成相关基因的ORF序列,并对其进行亚细胞定位与表达分析。【方法】采用电子克隆方法克隆相关基因,构建亚细胞定位表达载体,基因枪转化洋葱表皮细胞后激光共聚焦显微镜下观察。并用半定量和荧光定量RT-PCR方法研究各基因的时空表达。【结果】成功克隆了5个基因的完整ORF序列,对上述基因在葡萄不同组织器官中的表达水平进行分析发现,它们在组织器官间的表达有强弱差异。其中,VvGA2...

【目的】克隆鸭梨苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)序列,并分析其在果实发育阶段和机械伤害时的表达模式,为研究鸭梨褐变机制提供理论依据。【方法】采用同源克隆方法,获得鸭梨PAL全长序列;利用在线生物信息学软件对其进行分析;采用MEGA 5.1软件构建PAL蛋白系统进化树;利用实时荧光定量PCR技术分析PAL在鸭梨果实发育阶段及受机械伤害过程中的表达。【结果】在鸭梨中获得了2个含完整CDS区的PAL,分别命名为PbPAL1和PbPAL2。PbPAL1 cDNA序列全长为2 232 bp,含2 160 bp完整开放阅读框、60 bp的5′非翻译区及12 bp的3′非翻译区,GenBank登录号为GU906...

【目的】阐明葡萄果实发育过程中,植株接受UV-C照射对果实中黄烷醇类多酚积累的作用。【方法】以5年生赤霞珠葡萄为试材,定期对植株进行UV-C照射,分别采用分光光度计法、Western Blot和Real time PCR法对黄烷醇类多酚积累及其生物合成关键酶LAR表达进行分析,从底物、酶活性、蛋白质含量及基因转录水平阐明UV-C对Vv lar1、lar2基因表达的影响。【结果】葡萄果实发育过程中,UV-C照射并未改变果实中黄烷醇类多酚的积累规律,但诱导黄烷醇类多酚积累,特别是在幼果期,UV-C照射明显诱导果实中黄烷醇类多酚的积累。UV-C照射诱导葡萄果实LAR酶活性升高,LAR1、LAR2蛋白...

为探明‘峰后’葡萄在赤霉素(GA3)处理促使葡萄座果率增加原因和VvAG基因在葡萄坐果过程中的作用,在开花前10d用0.02mg/g的GA3和赤霉素合成抑制剂PAC处理葡萄花序并通过石蜡切片观察葡萄早期果实发育结构的变化,通过RT-PCR分析了VvAG基因的表达。结果显示:GA3处理提高了葡萄座果率,PAC处理则降低座果率,而PAC+GA3处理可以恢复葡萄正常坐果。GA3处理在开花后0~10d幼果纵横径大于对照,而PAC处理则小于对照。进一步分析发现,GA3处理后中果皮细胞明显大于对照,而PAC处理则小于对照,说明GA3处理导致开花后0~10d幼果增大的原因是由于细胞分裂和中果皮细胞增大的缘故...

为探明‘峰后’葡萄在赤霉素（ＧＡ３）处理促使葡萄座果率增加原因和ＶＶＡＧ基因在葡萄坐果过程中的作用，在开花前１０ｄ用０．０２ｍＧ／Ｇ的ＧＡ３和赤霉素合成抑制剂ＰＡＣ处理葡萄花序并通过石蜡切片观察葡萄早期果实发育结构的变化，通过ＲＴ－ＰＣＲ分析了ＶＶＡＧ基因的表达。结果显示：ＧＡ３处理提高了葡萄座果率，ＰＡＣ处理则降低座果率，而ＰＡＣ＋ＧＡ３处理可以恢复葡萄正常坐果。ＧＡ３处理在开花后０～１０ｄ幼果纵横径大于对照，而ＰＡＣ处理则小于对照。进一步分析发现，ＧＡ３处理后中果皮细胞明显大于对照，而ＰＡＣ处理则小于对照，说明ＧＡ３处理导致开花后０～１０ｄ幼果增大的原因是由于细胞分裂和中果皮细胞增大的缘故．．．

为探明赤霉素（ＧＡ３）对葡萄开花的作用，对‘峰后’葡萄进行萌芽期和开花前的赤霉素处理，测定了其对葡萄开花时间的影响。结果显示：开花前１０ｄ用３５ｍＧ／Ｌ的赤霉素处理可以提早蜂后葡萄开花，促进花序散穗和花梗生长，并且赤霉素处理后花梗纵径中的细胞数目和细胞大小都大于对照，说明赤霉素处理之所以促进花梗伸长主要是通过细胞分裂和细胞膨大来完成的。同时赤霉素处理后雌配子体发育明显快于对照，开花前４ｄ小花中的ＶＶＦＴ、ＶＶＳＯＣ、ＶＶＦＵＬ和ＶＶＡＰ１基因表达高于对照，而ＶＶＦＬＣ基因表达与对照没有差异。结果表明赤霉素促进葡萄开花是通过促进雌配子体发育和开花前成花促进基因ＶＶＦＴ、ＶＶＳＯＣ、ＶＶＦＵＬ和Ｖ．．．

葡萄果实发育后期基因表达水平的变化对果实品质形成具有重要影响,内参基因的选择是基因表达定量分析的关键影响因素。本试验以雷司令葡萄品种花后50、75和95 d的果实为材料,通过半定量RT-PCR,研究了常用持家基因Actin、Tubulin、GAPDH1、8 S rRNA的表达变化,探讨其作为葡萄果实发育后期基因表达半定量分析内参基因的可行性。结果表明:18 S rRNA的表达水平高,且最稳定,其次是Actin,而Tubulin和GADPH的相对表达水平较低;对VvTLP、GHF17 P和VvASR3个功能基因在不同果实材料中的表达水平进行半定量RT-PCR,VvTLP和VvASR的相对表达水平...