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[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
王克双 费菲 吕睦頔 李捷 程玉琴
为获得特异性抗血清用于批量检测葡萄苗木中的葡萄卷叶伴随病毒3号(Grapevine leafroll associatedvirus 3,GLRaV-3),本研究用含有GLRaV-3CP蛋白基因的载体pMD18-CP为模板,PCR扩增CP蛋白基因。将PCR产物定向克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选得到阳性克隆pET-G3CP。用终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE电泳分析显示,GLRaV-3CP在大肠杆菌中得到高效表达。纯化表达产物后免疫家兔制备抗血清。经分析,抗血清效价为1/214,试验结果显示,此抗血清能用于葡萄植株样品...
[期刊] 华北农学报
[作者]
岳东霞 曹为玉 郑燕棠
葡萄卷叶病毒抗血清的制备ＡｎｔｉｓｅｒｕｍＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＧｒａｐｅｖｉｎｅＬｅａｆｒｏｌＶｉｒｕｓ葡萄卷叶病毒病的诊断手段主要是通过嫁接传染和血清学方法，但由于病株的病毒含量低，且没有草本寄主，使得该病毒的研究及其抗血清的制备非常困难。本...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
刘命华 王克双 齐洪华 吕睦頔 李捷 程玉琴 范在丰
为获得葡萄卷叶伴随病毒1号(Grapevine leafroll-associated virus 1,GLRaV-1)中国分离物的分子信息,提高其检测可靠性,本研究从河北怀来和辽宁兴城地区带有明显卷叶症状的葡萄样品中提取的叶柄韧皮部总RNA,采用RT-PCR克隆了GLRaV-1的河北(GLRaV-1-HB)和辽宁分离物(GLRaV-1-LN)的外壳蛋白(coatprotein,CP)基因,并进行了序列分析。结果表明:GLRaV-1-HB和GLRaV-1-LN的CP基因核苷酸同源性为90.7%,由此推导的氨基酸同源性为93.8%;与已报道的国外3个GLRaV-1分离物的CP基因全序列相比,其核...
关键词：
葡萄卷叶病 RT-PCR 进化树
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
李捷 程玉琴
以含有葡萄卷叶伴随病毒2号(Grapevine leafroll-associated virus 2,GLRaV-2)p24蛋白基因的T载体(p-G2-p24)为模板,PCR扩增该蛋白基因的全长序列及其5′端长300bp的正反向片段。将p24蛋白基因全长序列定向克隆到表达载体pCsuper 1300+上,得到重组质粒pCsuper1300-p24。将正反向片段先后插入具内含子的中间载体pBSint上,得到重组的中间载体pBSint-p24-F-R。然后用HindⅢ和SacⅠ双酶切pBSint-p24-F-R,将切下的带内含子的正反向串联片段定向克隆到植物表达载体pCsuper 1300+上,...
[期刊] 华北农学报
[作者]
曹为玉 郑燕棠 岳东霞
葡萄卷叶病毒株系分化的研究ＡＳｔｕｄｙｏｎＤｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆＶｉｒｕｓＩｓｏｌａｔｅｓＡｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈＧＬＲＶ葡萄卷叶病毒（Ｇｒａｐｅｖｉｎｅｌｅａｆｒｏｌｖｉｒｕｓ．ＧＬＲＶ）是甜菜黄化病毒组成员，病毒粒子丝状物约１８００～...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
朱旭 兰文升 刘荭 高隆英 杜鹃 陈孝煊
应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从传染性造血器官坏死病毒(Infectious hemato-poietic necrosis virus,IHNV)感染的细胞悬液克隆病毒的糖蛋白基因,将其亚克隆至原核表达载体pCWori,转化到大肠杆菌DH5α,通过发酵大肠杆菌制备病毒糖蛋白。经SDS-PAGE分析,诱导表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在,使用Ni-NTA亲和层析柱在变性条件下进行纯化并透析复性,最终得到了较高纯度的可溶性糖蛋白,分子量约为57kDa。Western-blot分析结果显示,所表达的蛋白能够被IHNV病毒制备的兔抗IHNV血清识别。用复性后的蛋白免疫小鼠制备抗血清,E...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
郑宽瑜 董家红 尹跃艳 方琦 苏晓霞 张仲凯
用ＲＴ－ＰＣＲ从感染番茄环纹斑点病毒（ＴｏｍａＴｏ ｚｏｎａＴｅ ｓＰｏＴ ｖｉＲｕｓ，Ｔｚｓｖ）的番茄中扩增出编码病毒非结构蛋白ｎｓｓ基因，将ｎｓｓ基因构建到原核表达载体Ｐ ｅＴ－３０ ａ中，获得原核表达载体Ｐ ｅＴ－３０ａ－ｎｓｓ，转化大肠杆菌ＢＬ２１（Ｄｅ３），用ｉＰＴＧ诱导表达。ｓＤｓＰａＧｅ电泳分析显示，高效诱导表达了５７ｋ Ｄａ融合蛋白。用回收纯化的融合蛋白免疫家兔，获得多抗血清。间接ｅＬｉｓａ测定多抗血清的效价为１／８１９２。用制备好的抗血清对Ｔｚｓｖ感病病样进行ＷｅｓＴｅＲｎ ＢＬｏＴＴｉｎＧ检测，能检测到特异性条带。结果表明该抗血清可用于Ｔｚｓｖ的检测，并为进一步研究ｎｓｓ功．．．
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
江彤 杨友志 丁菲 蒋磊 李祥宇 邓竹根 谢朝阳 宋培培
PCR扩增得到了草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus,SVBV)的外壳蛋白(coat protein,cp)基因,将SVBV cp基因克隆到原核表达载体pET-32a上,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用终浓度为0.05 mmol·L-1的IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳及Western-blot分析表明,SVBV cp基因在大肠杆菌中得到了融合表达。利用Ni2+-NTA亲和树脂纯化重组融合蛋白,免疫家兔获得了重组蛋白的多抗血清。以此多抗血清建立了Dot-ELISA检测方法,结果表明,制备的特异性多抗血清可以快速检测出感病草莓样品中的SVBV。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
李婷婷 方琦 丁铭 苏晓霞 张丽珍 张仲凯
对引起云南鲜切花麝香石竹植株叶斑驳、花朵变小的病毒分离物应用酶联免疫吸附测定(ELISA)和电子显微镜技术(IEM)检测,直径大约28nm,经TAS-ELISA测定仅与CarMV标准抗体反应为阳性。鉴定为麝香石竹斑驳病毒(Carnation mottle vi-rus,CarMV)的分离株。对病株检测筛选后进行分离纯化,将提纯后的CarMV制备兔抗血清获得高效价的抗体,间接ELISA测定为1∶10240。
关键词：
麝香石竹斑驳病毒 鉴定 抗血清制备
[期刊] 西南农业学报
[作者]
郑宽瑜 董家红 尹跃艳 方琦 苏晓霞 张仲凯
用RT-PCR从感染番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus,TZSV)的番茄中扩增出编码病毒非结构蛋白NSs基因,将NSs基因构建到原核表达载体p ET-30 a中,获得原核表达载体p ET-30a-NSs,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDSPAGE电泳分析显示,高效诱导表达了57k Da融合蛋白。用回收纯化的融合蛋白免疫家兔,获得多抗血清。间接ELISA测定多抗血清的效价为1/8192。用制备好的抗血清对TZSV感病病样进行Western blotting检测,能检测到特异性条带。结果表明该抗血清可用于TZSV的检测,并为进一步研究NSs功...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
张蔚明 刘燕娟 周倩 廖晓兰
南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)p10蛋白由其基因组片段S10编码,根据SRBSD海南分离物S10序列(EU523360)设计特异性引物扩增编码p10蛋白的片段,并亚克隆至原核表达载体pET-28a+,以大肠杆菌BL21plysS为宿主菌进行高水平表达,利用纯化的p10蛋白免疫兔子,制备了p10蛋白的特异性抗血清。ELISA检测显示,p10蛋白的抗血清可与来自湖南不同地区的白背飞虱病汁液发生强烈的血清学反应,表明该抗血清适用于田间SRBSDV的快速诊断。
关键词：
南方水稻黑条矮缩病毒 原核表达 抗血清
[期刊] 华北农学报
[作者]
岳东霞 曹为玉 郑燕棠
葡萄卷叶病毒发生时间和部位的研究ＡＳｔｕｄｙｏｎＩｎｆｅｃｔｅｄＴｉｍｅＡｎｄＰａｒｔｓｏｆＧｒａｐｅｖｉｎｅＬｅａｆ－ｒｏｌＶｉｒｕｓ葡萄卷叶病毒病（ＧＬＲＶ）分布于世界上所有种植葡萄的国家。我国葡萄种植面积发展很快，但由于葡萄卷叶病毒的危害日趋严...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
刘振兴 张殿昌 苏天凤 姜巨峰 龚世园 江世贵
分别采用Sepharose-6B凝胶过滤层析、Phenyl Sepharose FF疏水作用层析和rProtein A Sepharose亲和层析技术纯化黄鳍棘鲷(Acanthopagrus latus)血清IgM,并将这3种层析纯化方法进行了比较。纯化产物进行SDS-PAGE,电泳结果扫描后经Band Scan5.0软件分析显示,单独使用Sepharose-6B凝胶过滤层析或Phenyl Sepharose FF疏水作用层析得到的IgM纯度只有56%左右;二者联合使用纯度可以达到69%,而rProtein A Sepharose亲和层析一步就可以达到89%的纯度;纯化得到的黄鳍棘鲷血清IgM...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
鄢庆枇 韩一凡 高天翔 庄峙厦 王小如
分别用饱和硫酸铵二次盐析法和蛋白A亲和层析法对健康大黄鱼(Pseudosciaena crocea)血清中的免疫球蛋白(IgM)进行分离纯化,所得产物用SDS-PAGE进行检测。结果表明,蛋白A亲和层析法可以较好地分离到高纯度的大黄鱼血清IgM,产物的电泳胶中只有重链和轻链2个条带;饱和硫酸铵二次盐析法除了有这2个条带,还有很多杂带,而且蛋白A亲和层析法更为简便、快速,因此用蛋白A亲和层析法分离纯化IgM优于饱和硫酸铵二次盐析法;大黄鱼免疫球蛋白重链的分子量在76 kD左右;轻链分子量在28 kD左右。用纯化的大黄鱼IgM免疫实验兔,获得效价高达1∶40 960的兔抗鱼IgM血清。本实验所建立...
[期刊] 华北农学报
[作者]
吉祥 宋志成 韦晓玲 杨煜 隋炯明 郭宝太
为了制备出马铃薯卷叶病毒(PLRV)与S病毒(PVS)重组双CP多克隆抗体并用于PLRV与PVS这2种病毒的间接与DAS-ELISA检测，构建了PLRV与PVS融合双CP基因的原核表达载体pET22b-LRCP/SCP,用超声破碎法代替溶菌酶法裂解重组菌BL21(pET22b-LRCP/SCP)并提取菌体蛋白，用镍离子亲和层析纯化获得了分子质量为51.2 ku的高纯度的重组双CP。用该重组双CP作抗原免疫家兔获得了高效价(1∶128 k)抗血清。纯化的重组双CP多克隆抗体与PLRV或PVS阳性标准物特异性结合，与另外4种马铃薯主要病毒(PVX、PVY、PVA与PVM)无交叉反应。间接ELISA反应中，稀释度为1∶3 200的重组双CP多克隆抗体与PLRV或PVS阳性物都呈现阳性反应；在DAS-ELISA反应中，稀释度均为1∶100的重组双CP多克隆抗体及其碱性磷酸酶标记物与PLRV或PVS的阳性标准物也分别呈现阳性反应。结果表明，制备的重组双CP抗体既可用于PLRV与PVS这2种病毒的间接ELISA检测，也可用于DAS-ELISA检测。
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