采用组织分离法,从萝卜根部中分离到的菌株YN201309。经形态,生理生化及16S rRNA基因序列鉴定为产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。平板试验表明,该菌株具有固氮功能;盆栽试验和田间试验结果表明,产酸克雷伯氏菌YN201309能明显促进白菜、油菜和玉米的生长。盆栽试验40 d后,浸种处理的白菜平均株高提高19.61%~33.00%,浇灌处理的玉米平均株高提高12.07%~20.74%。田间试验60 d后,以浓度108CFU/mL拌种油菜的株高增加了14.41%,根长增加了7.28%,以浓度108CFU/mL浇灌油菜的株高增加了8.34%,根长增加了4.28%。

从患病黄额闭壳龟(Cuora galbinifrons)肝脏中分离到一株致病菌HE01,经人工感染健康巴西龟,可复制与自然发病相同的症状,且从人工感染病龟体内再次分离到相同的病原菌。经Biolog微生物自动鉴定系统的鉴定,以及进一步的16 S rDNA基因序列和系统发育分析都表明,此致病菌为产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)。药物敏感性试验表明,该菌株对头孢噻肟、头孢曲松、头孢哌酮等10种药物高度敏感。

【目的】对1株疑似肺炎克雷伯氏菌进行分离鉴定及全基因测序分析,并对发现的新基因kp05372编码产物进行生物信息学分析。【方法】采用传统的细菌鉴定方法和分子生物学方法,分别对采自麝粪便的1株病原菌的生理生化特征及16SrRNA序列进行测定;以小鼠感染试验和半数致死量(LD50)测试该病原菌的致病性;用全基因组测序方法对病原菌基因组进行测序分析,并对发现的新基因编码产物进行生物信息学分析。【结果】经生理生化试验和16SrRNA序列分析发现,分离菌株为肺炎克雷伯氏菌,命名为GPKP,其对小鼠致死的LD50为6

为探究噬菌体作为新型生物抗菌剂防控肺炎克雷伯菌引起的奶牛乳房炎和乳制品及其加工过程污染，以及对生物被膜清除的能力，以ATCC 700603为宿主菌从某牛场水样中分离得到1株肺炎克雷伯菌噬菌体vB＿KpnM-YP11，并通过透射电镜观察噬菌体形态特征；通过双层平板法测定噬菌体宿主谱；通过最佳感染复数、一步生长曲线、温度和pH稳定性测定噬菌体生物学特性；通过全基因组测序分析基因组的结构特征、比较其进化关系；通过结晶紫染色法和平板计数法测定噬菌体对生物被膜的抑制和清除效果；通过牛奶试验分析该噬菌体对牛奶中肺炎克雷伯菌的抑菌效果。结果表明：1）从牛场水样中分离获得肺炎克雷伯菌噬菌体vB＿KpnM-YP11，能形成清晰透亮噬菌斑，透射电镜观察vB＿KpnM-YP11具有肌尾噬菌体的典型结构。2）测定噬菌体宿主谱，表明vB＿KpnM-YP11能够裂解18/34株牛源肺炎克雷伯菌。3）生物学特性结果表明vB＿KpnM-YP11最佳感染复数为0.1,vB＿KpnM-YP11感染宿主菌潜伏期为30 min，爆发期为50～90 min,110 min后进入平台期，平均裂解量为69PFU/cell，在pH(3～11)和温度（4～60℃）范围内活性稳定。4)vB＿KpnM-YP11基因组全长166 607 bp,GC含量为39.52%，注释结果显示共有276个ORF和15个tRNA，不含耐药基因及毒力基因。5)vB＿KpnM-YP11最佳感染复数为0.1时，具有显著抑制肺炎克雷伯菌生物被膜的形成能力。vB＿KpnM-YP11效价为10～8 PFU/mL,10～9 PFU/mL能有效清除肺炎克雷伯菌生物被膜。在室温条件下，12 h内vB＿KpnM-YP11使牛奶中细菌浓度下降98%。综上，本研究分离获得噬菌体vB＿KpnM-YP11潜伏期短、裂解效率高，不仅能抑制和清除生物被膜，同时对牛奶中肺炎克雷伯菌也有显著的抑菌效果，具有作为肺炎克雷伯菌生物抗菌剂的应用潜力。

从6尾患肠道胀气的病鳗腹水和肝脏病灶中分离、筛选出一株致病菌EP4,通过细菌形态学、生理生化测定及ATB Expression半自动细菌鉴定仪鉴定均符合肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)特性。以细菌16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增,得到EP4的部分16S rRNA基因序列,长约1 502 bp。将所测序列与GenBank中序列进行BLAST比对并构建系统进化树,结果表明其与肺炎克雷伯氏菌[DQ444287]的同源性最高(98.9%)。人工感染证明该菌株具有较强的致病力(致死率达70%),30种药物筛选结果显示,EP4对菌必治(头孢三嗪)、先锋V、头孢克洛、氧氟...

【目的】探讨转录因子RpoN和NtrC对变栖克雷伯氏菌菌株DX120E氮代谢和生物学特性的影响,为该菌株在生物固氮领域的广泛应用奠定基础。【方法】在DX120EΔrpoN突变株基础上,利用同源重组技术构建DX120EΔrpoNΔntrC双突变株,并对其进行鉴定。对DX120E野生型菌株、ΔrpoN突变株和ΔrpoNΔntrC双突变株的生长特性、运动能力、胞外多糖产量、生物膜形成及氨基酸代谢能力等进行比较分析。【结果】成功构建了DX120EΔrpoNΔntrC双突变株。与DX120E野生型菌株相比,DX120EΔrpoNΔntrC双突变株在以蛋白胨和尿素为氮源的培养基上生长无明显差异,但在以硝酸钾为唯一氮源的培养基中无法正常生长,DX120EΔrpoNΔntrC双突变株的硝酸盐利用能力、群集能力、胞外多糖产量和生物膜形成能力均有所减弱;DX120EΔrpoN突变株不能利用组氨酸,DX120EΔrpoNΔntrC双突变株可以利用组氨酸,但不能利用脯氨酸;DX120EΔrpoN突变株和DX120EΔrpoNΔntrC双突变株在生长特性、泳动和群集、生物膜形成及胁迫耐受能力等方面无明显差异。【结论】RpoN和NtrC影响菌株DX120E的硝酸盐利用能力、群集能力、胞外多糖产量及生物膜形成能力,RpoN对DX120E的生物学特性调控占主导地位,RpoN和NtrC共同参与调控细菌对氨基酸的摄取及利用。

【目的】研究克雷伯氏菌果胶酸裂解酶基因K-PGL的序列特征及其编码产物的理化性质、结构特征及同源性等。【方法】根据同源序列相似性设计引物,利用PCR、染色体步移等技术获得了基因序列,并对基因信号肽,疏水性和结构域等进行了分析。【结果】获得克雷伯氏菌2395 bp序列,其中K-PGL基因开放阅读框1710 bp,编码569个氨基酸,分子质量63.37 kDa,等电点7.17。编码蛋白具有信号肽酶切割位点,效率为0.864,序列中不含有半胱氨酸Cys,平均疏水指数为-0.449,为稳定存在的亲水蛋白。基因编码的蛋白具有内切聚半乳糖醛酸裂解酶基因家族特有的保守结构域,进化上与产酸克雷伯氏菌亲缘关系最近。【结论】获得了K-PGL基因序列及其特征,为进一步研究果胶酸裂解酶的生物学功能和应用提供依据。

为筛选出联合抗生素对肺炎克雷伯氏菌具有协同抗菌作用的天然产物。采用药敏纸片法测定肺炎克雷伯氏菌对8种抗生素的耐药性，采用微量肉汤稀释法测定抗生素和3种天然产物的最小抑菌浓度，应用棋盘法分别测定花青素和咖啡酸与抗生素联用对肺炎克雷伯氏菌的抗菌活性，并通过生长曲线评估咖啡酸与抗生素联用的协同抑菌作用。结果表明，肺炎克雷伯氏菌对8种抗生素均耐药，抗生素的MIC值为16->512 μg/mL。花青素和咖啡酸具有较好的抗菌活性，MIC值分别为25 μg/mL和1875 μg/mL，肉桂醛无抗菌作用，MIC>250 μg/mL。花青素与头孢他啶和克林霉素联用对肺炎克雷伯氏菌具有协同抗菌作用，2种抗生素的MIC值降低了4倍，咖啡酸与8种抗生素存在协同作用，抗生素的MIC值降低了8～>4096倍。抗生素与咖啡酸联用的协同抗菌效果优于其与花青素的组合，且咖啡酸与磺胺甲恶唑和氯霉素联合使用能持续抑菌至少24 h。本研究首次报道了咖啡酸与抗生素联用对多重耐药肺炎克雷伯氏菌具有显著协同抗菌作用，表明联合疗法是消减细菌耐药性的一种有效策略。

利用不同血清型的克雷伯氏菌Klebsiella菌株液体发酵,制备胞外多糖,并采用气相色谱和化学分析方法分析胞外多糖的化学组成。结果表明,菌株K26产胞外多糖的能力最高,培养48h和72h的产量分别为3.11mg/ml和3.89mg/ml;各实验菌株的胞外多糖的单糖组成包括甘露糖、葡萄糖和半乳糖。

【目的】筛选兼具高效溶磷和抑菌作用的微生物,检测其溶磷效果和抑菌活性,鉴定抑菌代谢产物,并分析筛选微生物对植物生长的作用,为新型多功能抑菌微生物菌肥的研发提供材料。【方法】采集信阳毛尖茶车云山茶厂百年龄茶树根际土壤,稀释后涂布难溶性无机磷或难溶性有机磷培养基表面,培养后检测溶磷活性,测定溶磷圈直径,筛选具有高效溶磷作用的微生物,进行后续溶磷效果分析。高效溶磷菌WY6-5接种于培养液和土壤中,检测不同培养时间下,可溶性磷含量的变化规律,分析菌株WY6-5的溶磷活性;玉米盆栽土壤中接种菌株WY6-5菌液,种植27 d后分析玉米植株长势,检测溶磷菌WY6-5对苗期玉米生长的影响;采用双皿对扣培养法,验证菌株WY6-5产挥发性物质的抑菌作用,检测其对不同病原真菌的广谱抑菌效果,气相色谱串接质谱(GC-MS/MS)分析挥发性代谢物质,鉴定主效抑菌成分。【结果】筛选到3个兼具有降解难溶性无机磷和有机磷作用的微生物菌株,尤以菌株WY6-5溶磷效果最优。培养基培养条件下,对难溶性无机磷的溶解直径达2.3 cm,溶磷圈直径与菌落直径比为4.6;对难溶性有机磷溶解直径3.6 cm,溶磷圈直径与菌落直径比达7.2。表型观察、生理生化鉴定和系统发育树分析表明,菌株WY6-5为乳白色细菌,16S rRNA序列与Burkholderia pyrrocinia CIP 105874和Burkholderia stabilis CIP 106845两个菌株的同源性最高,进化树中聚成独立一支。另外,WY6-5与Burkholderia pyrrocinia具有高度相同的生理生化反应结果。因此,本研究将WY6-5鉴定为吡咯伯克霍尔德菌(Burkholderia pyrrocinia)。WY6-5在液体培养和土壤中均具有较好的溶磷活性,20 d培养时间内,液体培养液中磷含量最高达520.4 mg·L~(-1),为对照组176倍;土壤试验3—20 d期间,WY6-5处理组可溶性磷含量均高于对照组,且在盆栽试验中,能高效促进苗期玉米植株的生长,处理组叶长、叶宽、叶片数、茎粗、株高、鲜重等指标显著优于对照组;同时,菌株WY6-5还可产生挥发性抑菌物质,高效广谱抑制8种重要病原真菌的生长,抑菌率最高达100%,经GC-MS/MS检测发现,挥发性物质含有一种主效抑菌物,相对丰度达97%以上,鉴定为二甲基二硫。【结论】吡咯伯克霍尔德菌(Burkholderia pyrrocinia)WY6-5分离自茶树根际土壤,在培养基、培养液和土壤环境下,均具有高效的溶磷效果,将难溶性的无机磷转化为植物可吸收的可溶性磷,并促进苗期玉米植株的生长;同时该菌还可产生挥发性抑菌物质二甲基二硫,高效抑制8种重要植物病原真菌的生长,抑制率最高达100%。菌株WY6-5兼具有提升土壤磷肥力、促进植物生长和和抑制真菌病害等多种重要作用,具有较好的生物学功能。

【目的】由于草甘膦在农业生产中的广泛使用,抗草甘膦转基因作物的研究一直是转基因作物研究的热点,其中草甘膦抗性功能新基因的挖掘是核心问题。自然界中微生物种类繁多,基因资源丰富,论文拟从广东地区农田土壤中筛选和鉴定出高抗草甘膦菌株,克隆其草甘膦靶标酶基因并进行抗性水平验证,以期获得高抗草甘膦新基因资源用于抗草甘膦转基因作物的研究。【方法】用含有浓度梯度草甘膦的选择培养基从备选土壤中筛选出具有高抗草甘膦特性的菌株;通过显微观察、革兰氏染色以及16S rDNA序列分析结果对菌株种类进行鉴定;利用RT-PCR技术克隆该菌株的草甘膦靶标酶基因aroAS001,并通过序列比对和系统发育树分析aroAS001...

从玉米东单90和郑单958健康鲜植株中分离纯化内生细菌,利用乙炔还原法测定分离物的固氮酶活性,得到2株固氮酶活性较高的菌株SD1A和SD2A,分别为3284.3C2H4.h-1·mL-1和3206.8nmolC2H4·h-1·mL-1;将SD1A和SD2A的纯培养物对植物分别进行土培和水培回接试验,结果均能从植物体内重新分离到出发菌株,表明SD1A和SD2A为内生固氮菌;通过对菌株理化特性试验,结果证明二者均为克雷伯氏菌属(Klebsiella trevisan)。用SD1A和SD2A处理的植株在水培试验中,株高分别为35.95cm和35.32cm,地上部干重分别为0.106g和0.101g,...

为了明确安徽省当涂县淡水养殖克氏原螯虾暴发性疾病的病原，取濒临死亡的病虾分离病原。从肝胰腺中分离到一株优势细菌（命名为ＸＬＸ１分离株），人工感染试验证实其具有较强的致病性；采用形态学检查、生理生化特性测定和细菌１６Ｓ ｒ ｒＮＡ基因序列分析，确定ＸＬＸ１分离株为弗氏柠檬酸杆菌。进一步对ＸＬＸ１分离株进行药物敏感性、携带黏附素基因情况和细胞黏附性进行检测。结果显示：该分离株对头孢噻肟、庆大霉素、阿米卡星、硫酸新霉素、恩诺沙星、诺氟沙星、替考拉宁和米诺环素敏感或中敏，对其他７种测试药物呈现耐药。该分离株携带黏附素基因ｃｆＡ和ｕｒｅ基因簇；序列分析发现ｕｒｅ ＡＢｃ结构基因和ｕｒｅ Ｄ关键辅助基因高．．．

【目的】探索吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007(Burkholderia pyrrocinia JK-SH007)合成生长素吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)的能力,并阐明B.pyrrocinia JK-SH007存在色氨酸依赖型的吲哚-3-乙酰胺(indole-3-acetamide, IAM)IAA合成途径。【方法】使用Salkowski比色法和酶联免疫吸附法(ELISA)进行L-色氨酸对B.pyrrocinia JK-SH007合成IAA能力影响的检测;以B.pyrrocinia JK-SH007全基因组为模板,设计特异性引物克隆iaaM和iaaH基因,并使用生物信息学方法对其蛋白质和亲缘关系进行分析;通过实时荧光定量PCR方法分析B.pyrrocinia JK-SH007中的iaaM和iaaH基因在L-色氨酸处理下的差异表达。【结果】B.pyrrocinia JK-SH007菌株能够合成15.663μg·mL~(-1)的IAA,在以L-色氨酸为前体的条件下其合成IAA的量显著增加,达到了44.404μg·mL~(-1)。iaaM和iaaH基因均含有一个完整的开放阅读框,其中iaaM基因全长1 782 bp,编码593个氨基酸,属于Amino_oxidase super family家族;iaaH基因全长1 368 bp,编码455个氨基酸,属于Amidase super family家族。在L-色氨酸的处理下,B.pyrrocinia JK-SH007中的iaaM和iaaH基因的表达量均显著增加。【结论】B.pyrrocinia JK-SH007具有合成IAA的能力,L-色氨酸对其合成IAA具有显著促进作用,且克隆得到了iaaM和iaaH基因,其在进化上具有一定的保守性,证明B.pyrrocinia JK-SH007中存在吲哚-3-乙酰胺IAA合成途径。