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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
贺涵 阳习鹏 赵婉欣 邵雪花 杨凤玺 刘传和
【目的】研究菠萝叶基原生质体的高效分离方法,并对制备的原生质体进行瞬时转化,为利用菠萝原生质体进行菠萝基因功能研究提供技术支持。【方法】以‘巴厘’菠萝(Ananas comosus,‘Comtede Paris’)幼嫩叶片的叶基为材料,采用3因素3水平正交试验L9(33)分析纤维素酶质量浓度(6,12,20 g/L)、离析酶质量浓度(3,6,9g/L)和甘露醇浓度(0.4,0.5,0.6 mol/L)对分离原生质体产量与活力的影响;同时,利用单因素试验(设置酶解时间2,4,6 h)筛选制备原生质体的最适酶解时间,确定分离菠萝叶基原生质体的最适条件;在最适条件下制备原生质体,采用聚乙二醇(PEG)介导法转化质粒,建立菠萝原生质体瞬时转化体系。【结果】L_9(3~3)正交试验结果显示,不同处理分离的原生质体产量为1.01×10~6～1.93×10~6 g~(-1),纤维素酶质量浓度是决定原生质体产量的关键因素;原生质体活力为65.55%～87.00%,甘露醇浓度对原生质体活力的贡献最大。最适酶解条件为:菠萝叶基在含12 g/L纤维素酶、6 g/L离析酶、0.6 mol/L甘露醇的酶液中避光酶解4 h,产量可达1.96×10~6 g~(-1),活力为85.54%。菠萝叶基原生质体通过PEG介导法转化p AN580-WRKY75质粒后,可在激光共聚焦显微镜下观察到核内的绿色荧光信号。【结论】确定了菠萝叶基原生质体的最适分离条件与瞬时转化方法,建立了适用于菠萝基因功能分析的原生质体瞬时表达体系。
[期刊] 林业科学
[作者]
谷战英 杨若楠 陈昊
【目的】探索油桐叶肉细胞原生质体分离的最适条件,建立油桐原生质体的遗传转化体系,使在油桐体内研究自身基因的功能成为可能。【方法】以油桐成熟叶片和组培苗幼叶为材料,通过酶解法成功分离得到油桐叶肉细胞的原生质体并确定最适分离条件。在此基础上,以获得的原生质体为受体系统,建立PEG介导的油桐原生质体基因转化方法。【结果】原生质体分离结果表明,酶解时间对原生质体产量和活性的影响最大,其次是纤维素酶浓度,而离析酶浓度和甘露醇浓度对原生质体产量和活性的影响较小。以成熟叶片为材料分离原生质体的最适条件为纤维素酶浓度1.
关键词：
油桐 原生质体制备 遗传转化 亚细胞定位
[期刊] 华北农学报
[作者]
王飞 钟雄辉 陈登辉 李海龙 康俊根 颉建明
为研究甘露醇浓度、酶解时间、离心力大小和不同外植体对原生质体产量和活力的影响,采用正交试验方案对甘蓝原生质体制备体系进行了优化,并建立了甘蓝原生质体的瞬时转化体系,同时利用该体系对甘蓝CRISPR/Cas9基因编辑系统进行了初步研究。结果表明:以下胚轴为材料,酶液组成为1%纤维素酶+0.5%离析酶+0.6 mol/L甘露醇+10 mmol/L MES+1 mmol/L CaCl_2+0.1%BSA+5 mmol/Lβ-巯基乙醇,26℃,60 r/min,黑暗酶解6 h后,用2 115 r/min离心5 min收集细胞,可获得高质量的原生质体,原生质体产量约为3.0×10~6个/g,活力约为90.9%;另外,在20%PEG4000介导下,将带有绿色荧光蛋白的载体(PYBA 1132)分别转入从甘蓝下胚轴、子叶、叶球分离获得的原生质体中,在荧光显微镜下观察到GFP绿色荧光信号,转化效率分别为43%,35%,19%,表明下胚轴分离获得的原生质体最适于瞬时转化。同时以下胚轴分离获得的原生质体为受体,分别转化线粒体特异表达载体COX和质体特异表达载体969,也观察到了荧光信号,成功建立了甘蓝原生质体瞬时转化体系,为甘蓝功能基因定位与功能分析提供了技术平台。最后,利用该体系对CRISPR/Cas9基因编辑载体(PBSE401-BoPDS)中sgRNA的靶向编辑能力进行了检测,结果显示,靶点1和靶点2附近的序列中有碱基替换和插入,表明该体系能够应用于甘蓝瞬时基因编辑,为甘蓝基因功能研究以及新种质的创制建立了重要的技术平台。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘洁茹 冯露 林启芳 周杨 池秀凤 蔡明 程堂仁 王佳 张启翔 潘会堂
[目的]研究紫薇叶片原生质体的分离方法,并对制备的原生质体进行瞬时转化,为紫薇本源物种的基因功能分析提供技术支持。[方法]以F_1株系S047(以屋久岛紫薇(L.fauriei)为母本、紫薇品种‘Pocomoke’为父本杂交获得)及‘Ebony Embers’和‘Pocomoke’3个紫薇品种幼嫩叶片为材料,对其进行酶解,筛选最适紫薇品种,在此基础上,采用单因素试验初步筛选纤维素酶、离析酶质量浓度(5,10,15,20,25,30 g/L)及甘露醇浓度(0.4,0.6,0.8mol/L),之后采用3因素3水平正交试验筛选纤维素酶(10,20,30 g/L)、离析酶(3,5,7 g/L)和果胶酶(2,4,6 g/L)的最适质量浓度,确定分离紫薇原生质体的最优条件。用聚乙二醇(PEG)介导法将质粒pSuper1300::GFP转化紫薇原生质体。[结果]分离原生质体的最适紫薇品种为S047株系,其在酶解过程中无褐化现象,分离液呈明亮绿色,可得到完整的原生质体;其他2个品种未分离到原生质体。单因素试验结果显示,最适的纤维素酶质量浓度为15～20 g/L,离析酶质量浓度为5～10 g/L,甘露醇浓度为0.6 mol/L。正交试验结果表明,10 g/L纤维素酶、5 g/L离析酶、4 g/L果胶酶和0.6 mol/L甘露醇混合液为最佳酶解溶液,在黑暗条件下酶解紫薇幼嫩叶片5 h,可成功分离出紫薇原生质体,其产量达28×10~5 g~(-1),破损率为14%。将纯化的原生质体进行PEG介导的转化后,在激光共聚焦荧光显微镜下观察到绿色荧光信号,表明基因转化成功。[结论]获得了紫薇叶片原生质体分离体系,并成功进行了基因瞬时转化。
关键词：
紫薇 酶解法 叶片原生质体 瞬时转化
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李青 鱼海鹏 张子豪 孙正文 张艳 张冬梅 王省芬 马峙英 阎媛媛
【目的】真叶细胞能模拟植物内源条件,建立基于棉花真叶原生质体的高效瞬时表达体系,为快速有效研究棉花基因功能提供方法。【方法】以陆地棉TM-1真叶为材料,采用常用的纤维素酶和离析酶组合分离原生质体,探究影响原生质体分离的叶龄、渗透压、酶解液成分和酶解时间,及渗透压和酶解时间对原生质体活力的影响,并分析渗透压、PEG浓度和培养液种类对原生质体瞬时转化的影响,进而优化棉花真叶原生质体瞬时表达体系。构建GhLTP-GFP表达载体,对比融合蛋白在拟南芥、棉花原生质体和烟草表皮细胞中的亚细胞定位,验证该体系。【结果】不同于棉花子叶,酶解液中高浓度CaCl_2会显著抑制真叶细胞壁的酶解,含10 mmol·L~(-1) CaCl_2的酶解液能有效分离棉花真叶原生质体。甘露醇显著影响原生质体得率,含0.5 mol·L~(-1)甘露醇的酶解液分离原生质体得率最高,且细胞形态维持较好,而0.4 mol·L~(-1)甘露醇条件下原生质体活力降低一倍,表明0.5 mol·L~(-1)甘露醇能较好维持棉花真叶原生质体渗透压。陆地棉刚展平的真叶分离所得原生质体大小合适,而展平后的嫩叶分离得到的原生质体细胞较大,得率降低一倍。酶解处理7 h前,原生质体游离缓慢,酶解9 h原生质体产量达到高峰,继续酶解原生质体将破裂,得率降低。在等渗条件下用40%PEG4000转化所得原生质体,转化效率最高,而普遍采用的低渗条件不利于棉花真叶原生质体的转化。转化后,用WI溶液继续培养原生质体,会引起原生质体的大量破裂,用含0.5 mol·L~(-1)甘露醇的W5溶液继续培养,有利于原生质体形态的维持,转化率提高到90%。表达载体35S:GhLTP-GFP分别转入棉花、拟南芥原生质体和烟草表皮细胞,GFP信号在细胞中的定位结果一致。【结论】建立的棉花真叶原生质体瞬时表达体系,可获得8.10×10~6个/mL活力在95%以上的高质量原生质体,原生质体得率提高8倍,转化效率达到90%,可用于亚细胞定位、蛋白互作,以及代谢调控网络研究等。
关键词：
棉花 TM-1 原生质体分离 瞬时表达
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
张娅 刘晓烽 张婧 何弦 袁媛 吕美玲 黄晨星 郑祥梓 缪颖 伍炳华
探索了茉莉花原生质体瞬时转化的方法,发现室外种植盛开的茉莉花花瓣更适于分离有活力的原生质体,在15 g·L~(-1)纤维素酶、8 g·L~(-1)果胶酶和4 g·L~(-1)离析酶共同作用下,于25℃黑暗条件酶解5 h,所获得的原生质体产量和活性最佳.当细胞浓度为4×10~5个·mL~(-1),外源质粒DNA含量为75μg·mL~(-1)原生质体时,在200 g·L~(-1)的PEG-4000介导转化2～10 min,可获得较高的转化效率.利用本研究建立的茉莉花原生质体瞬时转化体系成功鉴定了3个茉莉花来源蛋白的亚细胞定位,为高通量开展茉莉花关键基因的功能研究提供了技术支持.
关键词：
茉莉花 原生质体 亚细胞定位
[期刊] 林业科学研究
[作者]
邢俊霞 臧巧路 叶查龙 张陈谊 程冬霞 齐力旺 杨玲 李万峰
[目的]优化农杆菌介导的日本落叶松胚性愈伤组织瞬时转化体系。[方法]以液体增殖培养7 d的日本落叶松胚性愈伤组织为受体材料，利用携带β-葡糖醛酸酶基因（GUS）的pCAMBIA1305.1载体进行瞬时转化，根据GUS的表达量及酶活性，筛选最佳侵染液浓度、侵染时间和共培养时间。并利用筛选出的转化体系，分析落叶松scarecrow-like 6(LaSCL6)启动子的活性。[结果]瞬时转化后，GUS表达明显。当侵染液浓度OD_(600)为0.2，侵染5 min，共培养72 h时，GUS的表达量最高，△C_T值为-2.274 2；当侵染液浓度OD_(600)为0.05，侵染5 min，共培养72 h时，GUS酶活性最高，为25.728 6 U·L~(-1)。LaSCL6启动子的活性是CaMV35S启动子的1.55倍。[结论]综合考虑GUS的表达量和酶活性，当侵染液浓度OD_(600)为0.05，侵染5 min，共培养24 h时，GUS的表达量和酶活性较高，这一条件可以用来进行日本落叶松胚性愈伤组织的高效转化。
[期刊] 华北农学报
[作者]
陈云 于一帆 潘淑芬 周研 葛会敏 刘立军
为建立甘蓝型油菜异三聚体Ｇ蛋白各组分原生质体瞬时表达体系，以油菜叶片为试材，从试材选取、平摇时间和聚乙二醇浓度方面优化了油菜原生质体制备条件和转化条件。结果表明，选取３０ ｄ苗龄叶片、平摇１０ ｍｉｎ时原生质体游离状态最佳，产量为１０．７３×１０～６／ｍ Ｌ，活力可达９６．４％。采用３０％ＰＥＧ转化原生质体时，目的蛋白表达量最高。ＷＥｓｔＥｒｎ ＢｏＬｔ的检测分析表明，异三聚体Ｇ蛋白各组分均参与了甘蓝型油菜对ＡＢＡ的应答反应，当ＡＢＡ浓度分别为１００，１５０，１００，５０ ｍｍｏＬ／Ｌ时，Ｂｎ ＧＡ１、Ｂｎ ＧＢ１、Ｂｎ ＧＧ２和ＢｎｒＧｓ１蛋白的表达量最高。
关键词：
油菜 原生质体瞬时表达 异三聚体G蛋白
[期刊] 华北农学报
[作者]
杜晓敏 王均 安子玄 裴丹 王华忠
为建立一套稳定高效的小麦叶肉细胞原生质体制备技术流程，以小麦幼苗叶片为材料，采用正交和随机设计试验分析了影响小麦叶肉细胞原生质体产量的制备因素。结果发现，酶解条件相关因素对制备原生质体产量的影响由大到小依次为酶解液甘露醇浓度、纤维素酶浓度、酶解时间和离析酶浓度；甘露醇浓度和纤维素酶浓度对原生质体产量的增长表现相互促进模式，延长酶解时间情况下低纤维素酶浓度产出的原生质体较高纤维素酶浓度破碎情况少，峰值过后的产量下降慢。研究还发现取材幼苗苗龄、光照条件和取材叶位等因素对原生质体产量也有影响。综合以上结果确定了一套优化的参数组合：以黑暗培养条件下的１０ ｄ苗龄小麦幼苗第２片真叶为材料，酶解液中的纤维．．．
关键词：
小麦 原生质体 基因转化 瞬时表达
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
邓叶 阳淑金 杜新平 董彬 任丽萍 房伟民 陈发棣 蒋甲福
[目的]本试验的目的是通过瞬时转化解决菊花转基因中存在的两大难题:转化效率低和表达水平低。[方法]通过农杆菌注射渗透法将含有GUS基因(编码β-葡糖苷酸酶)的表达载体pORE R1-2×35S∷GUS转入菊花‘优香’叶片中,进行瞬时表达,并组织培养转化后的叶片,利用GUS化学染色法和RT-PCR进行转化植株鉴定。[结果]菊花‘优香’瞬时表达的转化效率高达76.7%,外源基因(GUS)的表达水平也较理想,尤以第4和第5片完全展开叶(从形态学上端向形态学下端数)表现最佳。经过34个月的组织培养和抗性筛选,瞬时
关键词：
菊花 农杆菌侵染 瞬时表达 GUS 再生
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
刘艳丽 姚家玲
以盾叶薯蓣叶片、种子愈伤为材料,探讨了不同的酶浓度、酶解时间及渗透压对原生质体分离的影响。结果表明:生长5~10 d的叶片置于0.6%纤维素酶、0.5%果胶酶、0.9 mol/L甘露醇的酶液中、黑暗处理21 h,其原生质体产量和活力最高;悬浮培养5~10 d的愈伤组织在2.0%纤维素酶、1.0%果胶酶0、.7 mol/L甘露醇的混合酶液中黑暗处理6~8 h原生质体产量和活力最高。
关键词：
盾叶薯蓣 原生质体 分离
[期刊] 林业科学研究
[作者]
诸葛强 阙国宁
山杉木(Cunninghamia lanccolata Hook.)成熟种子胚在含有2.0mg/l 2,4-D、0.2mg/l KT的MS培养基上诱导愈伤组织,通过筛选继代培养,得到了生长旺盛、质地松散的愈伤组织细胞系。继代初期适当降低蔗糖浓度有助于减少愈伤组织的褐化。将5个月龄的愈伤组织转移至含1.5～2.0 mg/l 2,4-D、0.1～0.2mg/l KT、200 mg/l CH的MS液体培养基振荡培养,建立了增殖快、分散性良好的杉木悬浮细胞系。从4个月龄的悬浮细胞酶解(2％纤维素酶、0.25％果胶酶和13％甘露醇),游离得到大量的杉木原生质体,产量为9.3×10~5个/g FWW,活力...
关键词：
杉木 悬浮细胞系 原生质体的分离
[期刊] 林业科学研究
[作者]
张守英 阙国宁
Callus was induced by embryos from mature seeds of Pinus serotina with MS medium contained 0.2 mg?L -1 of KT and 2.5 mg?L -1 of 2,4 D.After successive subculture and selection,six month old callus were transferred to a liquid medium with 0.2 mg?L -1 of KT and 0 5.0 mg?L -...
关键词：
晚松 悬浮细胞系 原生质体分离
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘晓彬 刘娜 李福宽 吴立柱 张洁 王冬梅
【目的】病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术已在植物基因功能研究领域得到广泛应用。建立以TRV为载体介导的大豆基因瞬时沉默体系,为将烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介导的基因沉默技术在大豆与大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)互作体系中对大豆基因功能进行研究提供基础。【方法】从大豆品种冀豆7号(J7)叶片中特异性扩增八氢番茄红素脱氢酶基因(Gm PDS)的部分片段,并将该基因片段插入质粒p TRV﹕RNA2中;向J7的第一位真叶注射携带有TRV或TRV﹕Gm PDS的农杆菌,注射...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
陈越 王玲仙 付坚 陈玲 肖素勤 柯学 钟巧芳 赵才美 余腾琼 王波 张敦宇 殷富有 程在全
【目的】为云南疣粒野生稻原生质体的培养、细胞融合、细胞再分化成植株奠定基础。【方法】测定不同酶解组合及浓度、酶解时间、渗透压稳定剂浓度下云南疣粒野生稻原生质体的产量和活力,同时筛选云南疣粒野生稻原生质体分离和培养的较优条件。【结果】优化后建立云南疣粒野生稻胚性悬浮细胞系的周期可缩短至45～60 d;在纤维素酶1.5%+果胶酶0.3%+甘露醇0.6 M+MES 5 mM+CaCl_(2 ) 5 mM条件下酶解2 h,云南疣粒野生稻原生质的产量为1.45×10~(6 )个/g·FW,活力达到90.17%,制备出的原生质体在固液培养下得到云南疣粒野生稻原生质体再生植株。【结论】建立了一套快速高效分离培养云南疣粒野生稻原生质体的体系,对研究重要植物资源、种质创新和发掘其优良基因具有重要意义。
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