[目的]本文旨在通过克隆菊花中的乙烯受体基因(CmETR2),分析其表达特征并转入拟南芥中对其调控开花的功能进行研究。[方法]以菊花品种‘神马’为试验材料,克隆CmETR2全长序列,与其他物种进行同源性比对分析,利用荧光定量PCR检测该基因在不同组织中的相对表达量,以及其对外源乙烯处理后的响应变化。将CmETR2超表达转入拟南芥中,观察其对拟南芥开花时间和莲座叶片数的影响,分析转基因拟南芥中开花相关基因的表达量变化。[结果]克隆获得的CmETR2基因开放阅读框(ORF)全长为2 292 bp,编码氨基酸763个。系统进化分析表明,该基因编码的蛋白与向日葵的ETR3(XP_022030036.1)和刺菜蓟的ETR2-like(XP_024986908.1)亲缘关系最近。组织特异性定量表达分析结果表明,CmETR2在菊花营养生长期间茎和叶中表达量最高,生殖生长期间管状花和根中的表达量较高。亚细胞定位结果表明,CmETR2定位在细胞膜上。外源乙烯处理后3 h CmETR2基因表达量最高。CmETR2超表达植株的开花时间比野生型拟南芥晚3～4 d,开花时莲座叶片数比野生型拟南芥多3片左右。CmETR2超表达植株对乙烯的敏感性增强并表现出更明显的三重反应。在CmETR2超表达植株中,促进开花的基因AtGI、AtSPL3和AtFD在CmETR2超表达植株中的表达量较野生型下降,抑制开花的基因AtFLC和AtTFL在CmETR2超表达植株的表达量上调。[结论]本研究克隆得到菊花CmETR2基因具有延迟拟南芥开花的功能。

【目的】从菊花中分离克隆AINTEGUMENTA,分析其序列特征和在菊花中的时空表达特性,通过基因沉默研究其对菊花花序发育的影响,分析可能的调控方式和潜在机理,为菊花花序大小的调控奠定理论基础。【方法】使用RACE方法从菊花中克隆AINTEGUMENTA全长,通过DNAMAN等软件对其序列进行分析。采用荧光定量的方式检测其在菊花不同器官和发育时期的表达。构建35S::CmANT-GFP融合蛋白载体进行亚细胞定位,构建TRV2-CmANT沉默表达载体侵染菊花。使用SPSS软件统计分析CmANT沉默系菊花表型变化,通过光学显微镜观察舌状花花瓣表皮细胞变化,使用荧光定量方式检测CmANT相关基因在沉默系中的表达。【结果】从菊花中克隆了CmANT全长,其编码的氨基酸序列长度为540,理论等电点为7.39,蛋白质的理论分子量为60.4 k D,含有两个AP2保守功能区域和VYL修饰位点。在与其他物种的ANT蛋白构建的系统进化树中,CmANT与At ANT聚在一起。荧光定量结果表明:(1)CmANT在花蕾中的表达量最高,其次是根>茎>叶。(2)在花序不同部位的比较中,舌状花中的表达量最高,其次是筒状花,在花萼中的表达量最低。(3)CmANT在舌状花中的表达随着发育时期的延续而降低。(4)CmANT在2,4-D诱导下的3—6 h内表达量持续上升。Wo LF PSORT软件预测和35S::CmANT-GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞中的定位结果显示,CmANT蛋白定位在植物细胞核中。TRV-CmANT-1和TRV-CmANT-2沉默系的平均花径相比对照分别减小18.93%和27.47%,舌状花的数目分别减少11.39%和14.66%,其中TRV-CmANT-2与对照差异显著(P<0.05),筒状花数目分别减少14.55%和36.56%。顶端花序的舌状花平均长度分别减少34.17%和54.68%,舌状花的宽度分别比对照减小24.05%和10.13%。叶片平均鲜重分别比对照组减小13.19%和21.98%,叶片鲜重与筒状花数目显著相关(P<0.05)。舌状花花瓣表皮细胞显微观察发现,沉默系舌状花花瓣表皮细胞长度和宽度与对照差异不明显。CmLAX3在两沉默系中的表达明显上升,在小花原基分化期时分别是对照中的1.8和1.78倍,同期CmCYCD3的表达分别下降了32.28%和38.19%,CmXTH4和CmEXPA1的表达量在多个时期也明显降低。【结论】根据沉默系表型与相关基因的表达,推测CmANT的沉默可能解除了对CmLAX3抑制,促进了生长素的转运和过量积累,间接抑制了CmCYCD3的活性,限制了细胞的分裂增殖,引发细胞数目变少,导致沉默系器官变小。

[目的]本文旨在探究菊花CmHB15-1基因调控木质素合成的功能。[方法]通过同源克隆，以菊花‘神马’cDNA为模板克隆CmHB15-1基因，利用DNAMAN8.0软件对其进行序列分析，构建pORE-R4-CmHB15-1-GFP载体并导入烟草叶片中进行亚细胞定位分析；利用酵母杂交实验分析其转录激活活性；利用RT-qPCR技术对CmHB15-1基因进行组织特异性表达分析及潜在下游基因分析，并通过遗传转化拟南芥分析其对木质素合成的影响。[结果]CmHB15-1基因的开放阅读框为2520bp，编码839个氨基酸，预测蛋白相对分子质量为92.44×10~(3)，等电点为6.46。CmHB15-1蛋白具有Homeobox、bZIP、START、MEKHLA结构域，与除虫菊TcATHB-15亲缘关系最近。亚细胞定位显示CmHB15-1蛋白定位在细胞核上，有转录激活活性。CmHB15-1基因在茎中的表达量最高，且其表达量从茎顶端向基部节间逐渐增加，在茎基部节间表达量最高。CmHB15-1转基因拟南芥植株OE-20、OE-23木质素含量比野生型分别增加了15.98%和17.99%，且转基因拟南芥植株中木质素合成相关基因苯丙氨酸解氨酶基因(PAL1)、肉桂酸–4–羟基化酶基因(C4H)、4–香豆酰辅酶A连接酶基因(4CL1)、咖啡酰辅酶A甲基转移酶基因(CCoAOMT1)、阿魏酸–5–羟基化酶基因(F5H)表达量均显著上调。[结论] CmHB15-1基因参与调控木质素生物合成。

以切花菊‘神马’（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ‘Ｊｉｎｂａ’）为材料，利用ｒａＣｅ技术与同源克隆方法获得菊花ＣｍＰｉｎ１基因全长，通过ｑｒｔ－ＰＣｒ技术比较ＣｍＰｉｎ１在不同组织器官的表达，同时对ＣｍＰｉｎ１响应外施ｎａａ和去顶进行研究。结果表明：１）ＣｍＰｉｎ１基因ｏｒｆ全长１ ７６１ｂＰ，编码５８６个氨基酸，跨膜域位于蛋白ｎ端与Ｃ端；通过蛋白序列比对分析，菊花ＣｍＰｉｎ１蛋白与百日草ＺｖＰｉｎ１蛋白相似性最高；亚细胞定位结果显示ＣｍＰｉｎ１位于细胞膜；２）对ＣｍＰｉｎ１表达分析表明，该基因在菊花茎部与芽部具有相对较高的表达量，同时，在离体茎段中的ＣｍＰｉｎ１受到生长素诱．．．

[目的]本文旨在克隆‘神马’菊花（Chrysanthemum morifolium ‘Jinba’）CmERA1基因，并初步分析其表达模式，为探究其在调控菊花开花中的作用奠定基础。[方法]从夏菊品种‘优香’的转录组数据库中筛选得到菊花中编码法尼基转移酶β亚基基因，并命名为CmERA1。提取野生型‘神马’菊花叶片总RNA，以反转录后的cDNA为模板对该基因cDNA全长进行克隆。运用生物信息学方法对其亲缘关系及其编码蛋白的特性进行分析预测；利用实时荧光定量PCR对其在不同组织及不同光周期下的表达水平进行分析；利用酵母单杂交系统对其转录激活活性进行分析；以绿色荧光蛋白GFP作为标签确定其亚细胞定位情况。[结果] CmERA1基因open reading frame（ORF）全长1356 bp，编码451个氨基酸，分子质量为50.0kD，理论pI为5.12；系统进化分析显示其与青蒿中ERA1亲缘关系最近；蛋白质二级结构分析表明，CmERA1蛋白中α-螺旋和β转角含量较高；启动子元件分析表明，CmERA1基因启动子含有分生组织特征元件、光响应元件、ABA和SA响应元件；荧光定量PCR结果表明，CmERA1在营养生长时期的叶片中表达最高，根中表达最低；在生殖生长时期的根中表达最高，舌状花中表达最低；不同光周期的处理显示，CmERA1的表达能够响应光周期而呈节律性的变化；转录激活活性分析表明，CmERA1蛋白没有转录激活活性；亚细胞定位表明，CmERA1定位于细胞核中。[结论]本文克隆得到菊花CmERA1基因，表达模式分析表明其响应光周期变化。

[目的]本文旨在克隆菊花ERA1(ENHANCED RESPONSE TO ABA)基因，并分析其表达模式，为探究其在调控菊花开花中的作用奠定基础。[方法]从夏菊品种‘优香’的转录组数据库中筛选得到菊花中编码法尼基转移酶β亚基基因，并命名为CmERA1。提取野生型菊花‘神马’叶片总RNA,以反转录后的cDNA为模板，对该基因cDNA全长进行克隆。运用生物信息学方法对其亲缘关系及其编码蛋白的特性进行分析预测；利用酵母单杂交系统对其转录激活活性进行分析；以绿色荧光蛋白GFP作为标签确定其亚细胞定位情况；利用实时荧光定量PCR对其在不同组织及不同光周期下的表达水平进行分析。[结果]CmERA1基因开放阅读框(ORF)全长1 356 bp,编码451个氨基酸，相对分子质量为50.0×10~3,理论pI为5.12。系统进化分析显示其与青蒿中ERA1亲缘关系最近。蛋白质二级结构分析表明，CmERA1蛋白中α-螺旋含量最高。转录激活活性分析表明，CmERA1蛋白没有转录激活活性；亚细胞定位表明，CmERA1定位于细胞核中。CmERA1基因启动子分析表明，其含有分生组织表达元件、光响应元件、ABA和SA响应元件。荧光定量PCR结果表明，CmERA1在营养生长时期的叶片中表达最高，根中表达最低；在生殖生长时期的根中表达最高，舌状花中表达最低。CmERA1的表达能够响应光周期而呈节律性的变化。[结论]CmERA1基因的表达模式分析表明其响应光周期变化。

采用同源克隆结合RACE技术从菊花脑叶片中克隆菊花脑(Chrysanthemum nankingense)热激蛋白70基因(hsp70)的cDNA序列,并通过荧光定量PCR(qRT–PCR)分析菊花脑在40℃高温下热激不同时间(0、0.5、1、2、3、6 h)后叶片中hsp70基因的表达差异。结果表明,克隆的cDNA序列全长2 224 bp,与水母雪莲花、紫茎泽兰的hsp70基因在核苷酸和氨基酸水平的同源性分别为88%、98%,表明该序列为菊花脑的hsp70基因序列(GenBank登录号,KJ561911),命名为Cnhsp70。Cnhsp70基因的开放阅读框为1 944 bp,其编码的蛋白(...

[目的]本文旨在克隆菊花‘神马’Cm14-3-3υ基因,并初步分析其表达特征,为其功能研究奠定基础。[方法]从菊花‘优香’转录组库中获得编码拟南芥同源基因14-3-3υ序列信息,根据NCBI比对确定基因的cDNA全长并进行克隆,再利用生物信息学方法对该蛋白的功能和活性位点进行预测,同时利用实时定量PCR分析了在非生物胁迫条件下该基因的表达变化。[结果]Cm14-3-3υ的ORF序列长774 bp,编码257个氨基酸;亚细胞定位表明Cm14-3-3υ定位在细胞质和细胞核;生物信息学分析表明该蛋白有19个Se

[目的]本文旨在克隆菊花‘神马’CmCDKL9基因,并初步分析其表达模式,为探究其在调控开花方面的功能奠定基础。[方法]从夏菊品种‘优香’的转录组数据库中筛选获得编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的基因CmSTK1/CDKL9,命名为CmCDKL9;以野生型菊花‘神马’cDNA为模板对该基因的cDNA全长进行克隆,再运用生物信息学方法对蛋白的功能和特性进行分析预测,同时利用实时定量PCR分析该基因在不同光周期处理下的表达情况。[结果]CmCDKL9基因cDNA全长1 680 bp,包含1个1 671 bp开放阅读框,编码556个氨基酸,相对分子质量为62.3×10~3,理论pI为9.60。系统进化树分析显示,CmCDKL9与拟南芥等其他物种CDK类基因起源相同,而与黄花蒿中CDKL9的同源基因亲缘关系最近。亚细胞定位表明,CmCDKL9定位于细胞核与细胞膜。启动子元件分析表明,CmCDKL9基因启动子含有G-box、AE-box等多个光信号响应顺式元件。荧光定量PCR分析表明,在营养生长时期和花芽分化时期CmCDKL9基因在菊花‘神马’的根、茎、老叶和幼叶/花蕾中均有表达,在营养生长时期幼叶中的表达量最高,而老叶中的表达量最低;在花芽分化时期花蕾中的表达量最高,而根中表达量最低。不同光周期处理表明,CmCDKL9响应光周期处理,长日照条件下表达量表现出类似节律的变化。[结论]本文克隆得到菊花CmCDKL9基因,表达模式分析表明该基因响应长日照变化。

欧美杨是中纬度地区最适合的短轮伐期工业用材集约经营树种之一,然而盐渍、干旱和低温严重影响了欧美杨的生长发育和产量。本文利用RT-PCR等技术克隆出欧美杨PP2C基因并进行了序列分析。Pd PP2C基因开放阅读框为1 320 bp,编码439个氨基酸。蛋白质序列分析表明,PP2C蛋白N端保守性不强,C端有保守的蛋白磷酸酶区域。荧光定量PCR分析表明,该基因在欧美杨根、成熟叶、顶端叶和茎中都有表达且根中表达量最高。逆境胁迫分析表明,该基因受Na Cl、ABA和干旱等诱导表达。干旱和盐胁迫处理下转Pd PP2C基因拟南芥与野生型相比生长受到较少抑制,且叶绿素含量上升,丙二醛含量下降,表明Pd PP2...

【目的】克隆番茄WRKY2转录因子,为研究番茄抗病反应的分子机理和分子育种奠定基础。【方法】根据克隆出的番茄LeWRKY2基因特异片段(GenBank登录号:EU755368.1),运用cDNA末端快速扩增(rapidamplification of cNDA ends,RACE)技术克隆番茄LeWRKY2 cDNA全长,并用生物信息学的方法对其进行分析。用实时荧光定量PCR方法检测番茄经JA、番茄灰霉菌(Botrytis cinerea)、放线菌酮(cycloheximide)刺激时LeWRKY2基因的表达情况。【结果】①从番茄中克隆到一条全长为1 007 bp的cDNA序列,命名为LeWR...

【目的】NAC转录因子是植物特有的一类转录因子,N端含有一段高度保守、约150个氨基酸组成的NAC结构域,而C端为高度变异的转录调控区。NAC转录因子不仅参与植物生长发育的调控,而且在植物抗逆反应中具有重要的调控作用。作者从紫花苜蓿中克隆了一个NAC类转录因子基因Ms NAC2,期望通过分析其DNA和氨基酸序列特征,阐明其在紫花苜蓿中响应非生物胁迫的表达模式,通过在烟草中过量表达鉴定其生物学功能,为进一步了解Ms NAC2在紫花苜蓿中的耐逆调控机理提供试验基础,并为通过转基因技术改善紫花苜蓿抗逆力和提高其品质奠定研究基础。【方法】应用RT-PCR和RACE技术获得紫花苜蓿Ms NAC2全长序列...

【目的】棉花是重要的纤维作物，其生长常遭受非生物逆境危害，严重影响棉花的生长和产量。Ｔｒｉｈｅｌｉｘ转录因子在植物抵御各种逆境胁迫中扮演重要作用。克隆棉花Ｔｒｉｈｅｌｉｘ转录因子基因并分析其表达特性和功能，为最终利用转基因手段改良棉花抗逆性奠定基础。【方法】通过ＢｌＡＳＴ分析比对，从棉花ｅＳＴ数据库中获得１个高度同源基因，通过基因序列分析，发现其属于Ｔｒｉｈｅｌｉｘ转录因子ＧＴ－２亚家族，命名为ＧｈＧＴ－２。以棉花叶片总ｒＮＡ为模板，根据ｅＳＴ序列设计引物，利用ｒＴ－ＰＣｒ结合ｒＡＣｅ技术，获得ＧｈＧＴ－２的编码序列。使用ＭｅＧＡ５对蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析，并构建同源物种间系统．．．

【目的】为了研究翻译起始因子4E在菊花中的表达特性及功能,克隆菊花翻译起始因子4E(CmeIF4E)基因,分析其表达特性并初步筛选得到菊花CmeIF4E的互作蛋白。【方法】根据已报道植物的eIF4E序列设计引物,采用RT-PCR和RACE技术克隆菊花eIF4E基因,荧光定量PCR及亚细胞定位分析菊花CmeIF4E的表达特性,并用酵母双杂交系统筛选其互作蛋白。【结果】克隆获得菊花eIF4E基因全长914 bp,其开放阅读框(ORF)654 bp,编码1条包含218个氨基酸残基的多肽,将该基因名为CmeIF4E,GenBank登录号为JQ904591。氨基酸序列比对和系统进化分析表明,菊花CmeI...

【目的】克隆菊花节律钟输出基因GIGANTEA的cDNA全长序列,进行序列信息学分析,研究其mRNA的相对定量表达。【方法】利用多聚酶链式反应(PCR)结合5′RACE、3′RACE技术,克隆节律钟输出基因GIGANTEA的cDNA全长序列,应用生物信息学软件对获得的基因核苷酸序列及编码的蛋白质序列进行分析;通过在线建模软件对蛋白质的三维结构进行建模预测;利用实时荧光定量PCR技术,用2-△△Ct法进行GIGANTEA的mRNA相对定量表达分析。【结果】从菊花品种‘Jinba’中克隆得到节律钟输出基因GIGANTEA的cDNA全长序列,核苷酸序列长度3 461 bp,开放阅读框3 453 bp...