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[期刊] 西南农业学报
[作者]
葛奇 顾伟卓 程志鹏 杨洁 胡慧贞 陈龙清
【目的】从荷花（Nelumbonucifera）中克隆NnTOM1基因，并进行生物信息学分析、基因表达模式分析以及烟草遗传转化，为进一步研究NnTOM1基因的功能奠定基础。【方法】通过克隆获得NnTOM1基因，对其蛋白序列进行理化性质和保守结构域预测等生物信息学分析，利用荧光定量PCR（qRT-PCR）技术分析其组织特异性表达，并利用烟草遗传转化初步验证其生物学功能。【结果】NnTOM1基因编码区（Codingsquence，CDS）长度为1191 bp，编码396个氨基酸，蛋白质分子式为C_(1918)H_(3130)N_(560)O_(589)S_(16)，二级结构主要由 α-螺旋和无规则卷曲组成，含有TOM家族保守结构域（VHS-ENTH-ANTH和GAT），定位于细胞质中，多重序列比对及系统进化树分析表明，其与澳洲坚果（Macadamia integrifolia）、蒂罗花（Telopea speciosissima）、博落回（Macleaya cordata）亲缘关系较近且序列一致性较高；qRT-PCR结果显示，NnTOM1基因在瓣化雄蕊中表达量最高，在根中表达量最低，且在重瓣型品种中表达量比单瓣型品种高；与野生型相比，NnTOM1转基因株系的花瓣颜色加深，花瓣先端变尖，花瓣间隔处加宽，花丝变长且明显长于花柱；且OE-1株系比野生型多出1片花瓣，表现出6片花瓣的表型。【结论】荷花NnTOM1基因可能参与荷花花器官的发育，为后续解析NnTOM1基因的功能提供了初步依据，为荷花新品种选育提供了新的基因资源。
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
冯佳琳 刘聪聪 戚相玉 邸泽鑫 鲁仪增 郑健
【目的】探讨热激蛋白（HSP）在花楸树响应高温胁迫过程中的作用，以期为花楸树引种低海拔地区提供理论基础。【方法】以2～4年生花楸树实生苗为研究对象，进行了花楸树SpHSP70-3基因的克隆、系统进化分析、组织特异性表达模式以及响应高温胁迫的表达机制研究，并利用农杆菌介导法转化拟南芥，对SpHSP70-3基因在高温胁迫下的响应进行了异源验证。【结果】SpHSP70-3基因开放阅读框全长为2 088 bp，编码695个氨基酸；SpHSP70-3蛋白与蔷薇科梨属的白梨PbHSP70同源性最高。内源性表达分析显示：SpHSP70-3基因在叶片中表达量最高，在花蕾、初花、盛花时表达量偏低；42℃处理花楸树后，发现前6 h SpHSP70-3基因表达量没有显著变化，12 h时表达量增至对照组的12倍，24 h时表达倍数最高，为对照组的19倍。对3个转SpHSP70-3基因拟南芥纯合株系（OE1、OE2、OE3）和野生型拟南芥（WT）进行45℃高温处理后，OE1、OE2、OE3中的丙二醛（MDA）含量均高于WT，且过氧化氢酶（CAT）活性和过氧化物酶（POD）活性结果均低于WT。此外，SpHSP70-3在转基因株系中的表达量随着处理时间的增加而上升，并且其抑制了正调节因子AtHSP70、AtHSP18.2、AtHsfA1D和AtHsfA1A的表达，同时诱导了负调节因子AtHsfB2B的上调表达。【结论】SpHSP70-3在花楸树响应高温胁迫过程中起负调控作用，初步推测SpHSP70-3是花楸树引种低海拔地区响应高温响胁迫机制中的负调控因子。
关键词：
花楸树 高温胁迫 热激蛋白70 基因克隆
[期刊] 中国农业科学
[作者]
郭鹏 邢鑫 张万筠 姜健
【目的】对紫花苜蓿(Medicago sativa L.cv.Zhongmu-1)stress-induced protein kinase gene 1(Ms SIK1)进行克隆与表达研究,了解该基因的分子机制及其应用。【方法】以紫花苜蓿叶片总RNA为模板,根据同源克隆设计简并引物,利用RT-PCR结合RACE技术,获得Ms SIK1的编码序列。利用同源性比对进行序列分析。通过SMART网站(http://smart.embl-heidelberg.de/)模拟该基因的蛋白结构。构建Ms SIK1的亚细胞定位瞬时表达载体,使用基因枪转化法将Ms SIK1与GFP在洋葱表皮细胞中融合瞬时表达并...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
姜莉 陈发棣 滕年军 陈素梅 崔娜欣 顾俊杰
以晨光、友谊牡丹莲、瑰丽、红樱桃、厦门碗莲和素馨6个荷花品种为亲本进行不完全双列杂交,共配制杂交组合26个,并对结实种子数超过10粒的13个杂交组合F1的部分性状进行统计分析。结果发现:在花色遗传上,白色的遗传潜能最低,黄色次之,红色遗传潜能最强;杂种一代的花瓣数目和叶柄高度表现出明显的遗传优势,F1代花瓣数目和叶柄高度的总平均值分别相当于中亲值的122.4%和121.1%;花冠直径和花梗长度在F1代有衰弱的趋势,F1代花冠直径和花梗长度的总平均值分别相当于中亲值的95.4%和84.7%。
关键词：
荷花 杂交 性状 遗传
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘艺平 李创 李娜 李立升 孔德政
【目的】探讨荷花(Nelumbo nucifera Gaertn.)资源的遗传多样性和亲缘关系,为荷花资源的保护利用、品种鉴定及育种效率提高提供参考。【方法】利用ISSR分子标记技术,对6份野生半野生荷花品系和27份荷花栽培品种进行遗传多态性分析,从40条引物中筛选扩增效果较好的5条引物用于试验。采用POPGEN32软件计算供试材料的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei’s基因多样度(He)和Shannon多态性信息指数(I),利用UPGMA方法进行聚类分析。【结果】用筛选出的5条引物(UBC807、UBC811、UBC836、UBC840、UBC880)分别对33份荷花材料基因...
关键词：
荷花 ISSR 遗传多样性
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
赵琳 林森 赵琬玥 胡慧贞 陈龙清
采用InDel、EST-SSR和SSR组合分子标记技术研究94份引种至昆明地区的荷花种质的遗传多样性,结果显示:筛选出的60对引物共扩增出204条条带,检测到等位基因233个。3种标记平均Shannon指数≥0.85,基因多样性指数≥0.52,多样性检出率较高。通过Mantel检测表明组合标记与各个独立标记的相关性r值均高于0.789 4。采用组合标记进行聚类分析和群体结构分析均将94份种质资源划分为5个类群,与传统分类及种源地分类存在一定关联。美洲莲与亚洲莲的遗传多样性存在明显差异,遗传组分分析结果表明不同品种的中美杂交莲也存在差异,分布于美洲莲或亚洲莲中。综上,引种至昆明地区的94份荷花资源遗传多样性丰富,组合标记在荷花种质资源的多样性检出率较高,可为后续优良品种选育提供种质资源和技术支撑。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
张杨 孙明 杨海燕 张启翔
采用同源克隆结合RACE技术从菊花脑叶片中克隆菊花脑(Chrysanthemum nankingense)热激蛋白70基因(hsp70)的cDNA序列,并通过荧光定量PCR(qRT–PCR)分析菊花脑在40℃高温下热激不同时间(0、0.5、1、2、3、6 h)后叶片中hsp70基因的表达差异。结果表明,克隆的cDNA序列全长2 224 bp,与水母雪莲花、紫茎泽兰的hsp70基因在核苷酸和氨基酸水平的同源性分别为88%、98%,表明该序列为菊花脑的hsp70基因序列(GenBank登录号,KJ561911),命名为Cnhsp70。Cnhsp70基因的开放阅读框为1 944 bp,其编码的蛋白(...
[期刊] 华北农学报
[作者]
李青 张宁 司怀军 吴家和
分析棉花盐胁迫相关的EST文库,设计特异性引物,利用RACE技术从棉花中克隆出苹果酸脱氢酶(Malatedehydrogenase,MDH)基因,命名为GhMDH。基因全长1 130 bp,最大开放阅读框1 014 bp,编码338个氨基酸,分子量为35.495 kDa,等电点pI=8.94。将该基因编码区插入到原核表达载体pET23b中,获得pET23b-GhMDH重组载体。利用IPTG诱导表达目标蛋白,发现通常条件下获得的重组蛋白以包涵体的形式存在。对诱导时间、IPTG浓度和温度等条件进行优化,结果表明,除了在28℃低温以下诱导的蛋白有少量为可溶,其他条件诱导的蛋白均以包涵体形式存在。为了...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
周敏 程华 张子昕 邢晓娟 蒋甲福 陈发棣
[目的]本文旨在通过克隆菊花中的乙烯受体基因(CmETR2),分析其表达特征并转入拟南芥中对其调控开花的功能进行研究。[方法]以菊花品种‘神马’为试验材料,克隆CmETR2全长序列,与其他物种进行同源性比对分析,利用荧光定量PCR检测该基因在不同组织中的相对表达量,以及其对外源乙烯处理后的响应变化。将CmETR2超表达转入拟南芥中,观察其对拟南芥开花时间和莲座叶片数的影响,分析转基因拟南芥中开花相关基因的表达量变化。[结果]克隆获得的CmETR2基因开放阅读框(ORF)全长为2 292 bp,编码氨基酸763个。系统进化分析表明,该基因编码的蛋白与向日葵的ETR3(XP_022030036.1)和刺菜蓟的ETR2-like(XP_024986908.1)亲缘关系最近。组织特异性定量表达分析结果表明,CmETR2在菊花营养生长期间茎和叶中表达量最高,生殖生长期间管状花和根中的表达量较高。亚细胞定位结果表明,CmETR2定位在细胞膜上。外源乙烯处理后3 h CmETR2基因表达量最高。CmETR2超表达植株的开花时间比野生型拟南芥晚3～4 d,开花时莲座叶片数比野生型拟南芥多3片左右。CmETR2超表达植株对乙烯的敏感性增强并表现出更明显的三重反应。在CmETR2超表达植株中,促进开花的基因AtGI、AtSPL3和AtFD在CmETR2超表达植株中的表达量较野生型下降,抑制开花的基因AtFLC和AtTFL在CmETR2超表达植株的表达量上调。[结论]本研究克隆得到菊花CmETR2基因具有延迟拟南芥开花的功能。
关键词：
菊花 CmETR2基因 乙烯受体 开花
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
李针针 刘兆磊 陈发棣 蒋甲福 陈素梅
［目的］本文旨在研究荷花Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ转录因子ＮＮＭＹＢ４的功能，探讨其在木质素合成过程中的作用。［方法］利用ＲＴ－ＰＣＲ技术从荷花品种‘黑龙江红莲’中克隆得到１个ＭＹＢ转录因子基因Ｃ ＤＮＡ全长开放阅读框（ＯＲＦ），命名为ＮＮＭＹＢ４。采用实时荧光定量ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）法分析ＮＮＭＹＢ４在荷花不同组织中的表达情况。构建Ｐ ＭＤＣ４３－ＮＮＭＹＢ４过表达载体转化拟南芥，采用乙酰溴法测定转基因植株的木质素含量，通过ｑＲＴ－ＰＣＲ技术对木质素合成关键酶基因的表达进行分析。［结果］ＮＮＭＹＢ４基因ＯＲＦ全长７２６ ＢＰ，编码２４１个氨基酸，属于Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ转录因子Ｇ４亚组，与拟南芥ＡＴ ．．．
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
夏朝阳 安晓晖 张中起 葛冬冬 刘康
[目的]RING(really interesting new gene) finger E3泛素连接酶在植物生长发育和抵御环境胁迫中具有重要作用。克隆棉花RING finger E3泛素连接酶基因GhRING1-like并分析其表达特征和功能,为该基因分子作用机制研究和育种应用奠定基础。[方法]根据棉花表达谱分析,选取并克隆干旱胁迫处理上调表达基因GhRING1-like,qRT-PCR分析GhRING1-like的组织表达特性及其对不同非生物胁迫和激素处理的响应模式;采用瞬时表达对GhRING1-like-GFP融合蛋白进行亚细胞定位分析;通过获得病毒介导的基因沉默(VIGS)棉花和过表达拟南芥植株,分析沉默或过表达GhRING1-like对植株生长发育及其抗旱性的影响。[结果]GhRING1-like基因序列全长996 bp,编码332个氨基酸,其C端含有RING-H_2(C3H_2C3)结构域。GhRING1-like定位于内质网上。GhRING1-like在叶片中优势表达; 200 g·L~(-1)PEG6000诱导处理1 h后瞬时显著上调表达12倍; GhRING1-like对Na Cl、ABA和SA的响应时间都在处理后3 h,上调表达均在5倍左右。干旱胁迫处理后,VIGS沉默GhRING1-like棉花叶片相对含水量和叶绿素荧光参数Fv/Fm分别较未沉默对照降低17.1%和30.6%,而电解质渗透率和丙二醛含量分别较对照提高70.8%和100%。过表达GhRING1-like显著提高了拟南芥种子萌发和幼苗期对于甘露醇引起的渗透胁迫的耐受性;可使营养生长中后期阶段的拟南芥在水分亏缺处理下的存活率提高2.4倍;转基因拟南芥叶片气孔开度降低51.2%,失水率明显降低。干旱胁迫下,过表达GhRING1-like使依赖于ABA诱导表达的At AREB1、At ERD15、AtRD29A上调表达,而对不依赖ABA的干旱胁迫诱导基因At DREB和脯氨酸合成基因At PLD没有影响。[结论]棉花GhRING1-like参与了植物非生物胁迫抗性的调控,主要通过依赖于ABA通路正向调控植物的抗旱反应。
[期刊] 华北农学报
[作者]
张晓红 许佩阳 闫绪 张贝贝 于婵婵
为探究GhFUL1基因在棉花分枝发育进程中的功能，从棉花中克隆MADS-box家族GhFUL1基因及其启动子，对该基因进行功能研究，并对其启动子进行活性分析。结果表明，棉花中GhFUL1基因开放阅读框726 bp,编码241个氨基酸。进化树分析表明，GhFUL1与其他物种中可可的TcAGL8-1亲缘关系最近。烟草亚细胞定位分析结果表明，GhFUL1定位在细胞核和细胞膜。不同组织材料qRT-PCR分析表明，GhFUL1基因在茎尖中表达量最高。构建过表达载体转化拟南芥，结果表明，转基因拟南芥阳性株系中GhFUL1基因表达量显著增加，转基因株系的开花时间、花器官形态与野生型相比无明显变化，但是开花时侧枝数增加。qRT-PCR结果表明，细胞分裂素氧化/脱氢酶基因AtCTK1和AtCTK6表达量减少，推测GhFUL1基因可能通过调控细胞分裂素合成途径影响分枝。利用启动子分析网站PlantCARE预测可知，GhFUL1启动子区域不仅有TATA-box、CAAT-box核心元件，还有参与光响应、生长素响应以及胁迫应答等顺式作用元件。将GhFUL1启动子构建到表达载体pBI121检测其启动子活性，通过对拟南芥转基因阳性株系进行GUS染色，发现GhFUL1启动子在拟南芥幼苗期的茎尖分生组织和成熟期的花器官中特异性表达。初步揭示GhFUL1基因及其启动子转化拟南芥后在其分枝发育过程中具有一定的功能。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
甘好 李菲 蒋甲福 宋爱萍 丁莲 陈发棣 陈素梅
[目的]本文旨在探究菊花CmHB15-1基因调控木质素合成的功能。[方法]通过同源克隆，以菊花‘神马’cDNA为模板克隆CmHB15-1基因，利用DNAMAN8.0软件对其进行序列分析，构建pORE-R4-CmHB15-1-GFP载体并导入烟草叶片中进行亚细胞定位分析；利用酵母杂交实验分析其转录激活活性；利用RT-qPCR技术对CmHB15-1基因进行组织特异性表达分析及潜在下游基因分析，并通过遗传转化拟南芥分析其对木质素合成的影响。[结果]CmHB15-1基因的开放阅读框为2520bp，编码839个氨基酸，预测蛋白相对分子质量为92.44×10~(3)，等电点为6.46。CmHB15-1蛋白具有Homeobox、bZIP、START、MEKHLA结构域，与除虫菊TcATHB-15亲缘关系最近。亚细胞定位显示CmHB15-1蛋白定位在细胞核上，有转录激活活性。CmHB15-1基因在茎中的表达量最高，且其表达量从茎顶端向基部节间逐渐增加，在茎基部节间表达量最高。CmHB15-1转基因拟南芥植株OE-20、OE-23木质素含量比野生型分别增加了15.98%和17.99%，且转基因拟南芥植株中木质素合成相关基因苯丙氨酸解氨酶基因(PAL1)、肉桂酸–4–羟基化酶基因(C4H)、4–香豆酰辅酶A连接酶基因(4CL1)、咖啡酰辅酶A甲基转移酶基因(CCoAOMT1)、阿魏酸–5–羟基化酶基因(F5H)表达量均显著上调。[结论] CmHB15-1基因参与调控木质素生物合成。
关键词：
菊花 CmHB15-1基因 木质素 合成
[期刊] 中国农业科学
[作者]
康俊梅 张俏燕 蒋旭 王珍 张铁军 龙瑞才 崔会婷 杨青川
【目的】鲨烯环氧酶(squalene epoxidases,SQE)是苜蓿皂甙合成途径中的一种限速酶,与苜蓿皂甙的合成密切相关。通过对苜蓿鲨烯环氧酶(MsSQE1)基因的克隆及在苜蓿中过表达,探究鲨烯环氧酶对皂甙合成的作用机制。【方法】以模式植物蒺藜苜蓿鲨烯环氧酶基因序列设计引物,同源克隆苜蓿MsSQE1。对MsSQE1进行生物信息学分析;通过基因枪轰击技术,使MsSQE1在洋葱表皮瞬时表达,进行亚细胞定位。利用qRT-PCR方法分析该基因在根、茎、叶中的表达水平,以及在紫外辐射、ABA和GA3条件下的表达模式。在茉莉酸甲酯(MeJA)的诱导下,分析MsSQE1的转录水平,及对苜蓿皂甙含量的影响。利用根癌农杆菌转化体系,获得过表达MsSQE1的阳性转基因植株,并测定转基因植株的皂甙含量。【结果】克隆了MsSQE1的cDNA序列,开放阅读框1 578 bp,编码525个氨基酸,等电点为8.59。同源性比对分析,其氨基酸序列与蒺藜苜蓿中SQE1氨基酸序列同源性为98.6%,与拟南芥的同源性为80%。亚细胞定位显示,MsSQE1可能定位于细胞膜。组织特异性表达分析显示,MsSQE1在叶中的表达量最高,茎中次之,根中的表达量最低。在紫外辐射、ABA和GA3的诱导表达显示,紫外辐射诱导24 h,叶中表达量最高;GA3(50μmol·L~(-1))和ABA(100μmol·L~(-1))处理,均为8 h叶中表达量最高;MeJA处理能诱导MsSQE1表达量上调的同时苜蓿总皂甙含量也随着MsSQE1表达的上调而增加。分析过表达MsSQE1转基因苜蓿和转空载体苜蓿株系发现,MsSQE1的表达水平和总皂甙含量均升高,其中MsSQE1的表达水平是对照的3.11—9.45倍,总皂甙含量比对照提高14.26%—28.05%,暗示MsSQE1是苜蓿皂甙合成途径中的一种关键调节酶。【结论】从豆科牧草紫花苜蓿中克隆了MsSQE1并进行功能分析。在苜蓿中过表达MsSQE1能增加苜蓿总皂甙含量,暗示MsSQE1的表达影响苜蓿皂甙的生物合成,可能对皂甙的合成有重要的调节作用。
[期刊] 华北农学报
[作者]
甄军波 刘迪 宋世佳 刘琳琳 蔡肖 张曦 李海山 迟吉娜
LEA基因以基因家族的形式在高等植物中广泛存在,在植物生长发育及逆境胁迫应答的过程中发挥重要的作用。为深入研究棉花LEA基因的作用和功能,利用RT-PCR的方法,从棉花纤维均一化cDNA文库中分离得到2个LEA家族基因,分别命名为GhLEA和GhLEAG1(登录号分别为KF906314和KF906316)。GhLEA全长948 bp,编码315个氨基酸,等电点4.4,分子质量为35 ku,GhLEAG1全长756 bp,编码251个氨基酸,等电点10.76,分子质量为27 ku。系统进化树表明,GhLEA属于LEA2亚家族,GhLEAG1属于LEA3亚家族,2个基因的保守基序组成有明显的差异。荧光实时定量PCR表明,GhLEA和GhLEAG1均在棉花纤维20DPA表达量最高,GhLEA在棉花根中表达量最高,而GhLEAG1在茎中的表达量最高。在高盐和PEG处理条件下,2个基因的表达模式差异明显,此外,2个基因还受到脱落酸(ABA)的诱导表达,基因表达量均呈现先升高后降低的趋势,推测2个基因均参与了棉花高盐、PEG等非生物胁迫应答。本研究可为进一步研究LEA蛋白在棉花中的功能提供理论依据。
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