【目的】实现荷斯坦牛中性粒细胞防御素BNBD12基因在大肠杆菌中的高效表达,并分析重组BNBD12的抗菌活性。【方法】RT-PCR扩增荷斯坦牛中性粒细胞BNBD12基因,序列分析后人工合成了适于在大肠杆菌中表达的BNBD12成熟肽,构建原核表达载体pET32a(+)/BNBD12,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。通过琼脂扩散法分别确定重组蛋白对牛源乳腺炎主要致病菌革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抗菌效果,应用扫描电镜观察重组蛋白的杀菌效应。【结果】测序结果表明扩增片段长度为180bp,可编码含60个氨基酸的成熟蛋白。SDS-PAGE和Western blotting分析显示人工合成的BN...

【目的】克隆和表达新疆荷斯坦牛中性粒细胞防御素5(BNBD5)基因,对BNBD5蛋白进行纯化并分析其抗菌活性。【方法】利用RT-PCR方法扩增新疆荷斯坦奶牛BNBD5的cDNA序列,将BNBD5 cDNA克隆到原核表达载体pGEX-4T-2,测序分析后转化大肠埃希菌BL21(DE3)。经IPTG诱导后,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting分析;利用GST亲和柱纯化BNBD5蛋白,并进行体外抑菌试验。【结果】通过PCR扩增获得了218bp的牛BNBD5全长cDNA序列,经IPTG诱导,获得了约33 ku的牛BNBD5蛋白。牛BNBD5蛋白在15~25℃培养时的可溶性较...

【目的】从鸭组织中克隆鸭β-防御素9(AvBD9)基因,在原核表达重组鸭AvBD9蛋白;研究重组鸭AvBD9蛋白的体外抗菌活性与理化特性。【方法】采用RT-PCR法,从鸭肝脏组织中扩增鸭AvBD9基因,测定该基因在鸭各组织器官中的分布;将鸭AvBD9基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1上,构建重组表达质粒pGEX-duckAvBD9,将重组质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导表达;亲和层析纯化蛋白,利用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法测定重组鸭AvBD9蛋白的体外抗菌活性与理化特性。【结果】从鸭肝脏组织中克隆得到鸭AvBD9基因,序列分析表明该基因大小为204bp,前体肽包括67个氨基...

利用PCR技术从雄性中国荷斯坦牛的基因组DNA中克隆了Y染色体性别决定基因(Sex-deter-m in ing R eg ion on the Y Chrom osom e,SRY)的编码区全长序列,构建了表达载体pET-28a/SRY,并将其在大肠杆菌(E.coli)中进行了诱导表达,对表达产物进行了检测。结果表明,SRY基因编码区长687 bp,编码229个氨基酸;表达载体pET-28a/SRY构建成功;表达产物中含有相对分子质量为33 ku的SRY蛋白。

【目的】克隆与表达牦牛β-防御素5(BNBD5)基因,检测其重组蛋白的体外抗菌活性。【方法】采用RT-PCR方法从牦牛肺组织中扩增BNBD5基因成熟肽编码区,根据已发现的哺乳动物β-防御素5和部分禽β-防御素5的序列构建遗传进化树。将BNBD5基因亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)的BamHⅠ和XhoⅠ双酶切位点上,构建重组表达质粒pET32a-BNBD5。将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG于37℃进行诱导表达,SDSPAGE检测融合蛋白的表达情况,并对该重组蛋白进行纯化,测定其体外抑菌活性。【结果】克隆得到了BNBD5基因成熟肽编码片段,其长度为138bp,编码45个氨基酸...

【目的】克隆和表达鸡β-防御素3(Gal-3)基因,并对其抑菌活性进行研究,为寻找替代抗生素的抗菌肽提供试验依据。【方法】利用RT-PCR方法,从鸡心脏中分离并克隆了鸡Gal-3基因,将其与分子伴侣基因SUMO相融合,再将该融合基因与原核表达载体pET-20b连接后转化至BL21(DE3)宿主细胞中,经IPTG诱导后,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析;最后,对Gal-3融合蛋白进行纯化,并对表达产物进行体外抑菌试验。【结果】通过RT-PCR扩增获得了约240bp的鸡Gal-3基因,经IPTG诱导获得约26ku的蛋白。IPTG在终浓度为0.6mmol/L,33℃诱导4...

【目的】构建黄沙鳖β-防御素1(Hs-BD1)原核表达并分析其抗菌活性，为深入分析Hs-BD1的生理功能及开发新型黄沙鳖抗菌药物提供理论依据。【方法】构建Hs-BD1成熟肽序列的重组表达载体pCold-TF-Hs-BD1，采用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白rHs-BD1表达，以十二硫酸酯钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Western blotting)检测重组蛋白rHs-BD1的表达情况。采用Ni柱亲和层析法对重组蛋白rHs-BD1进行纯化，分析其对几种革兰氏阳性和阴性菌的抑菌活性、溶血性和抗氧化能力。【结果】SDS-PAGE检测结果显示，重组蛋白rHs-BD1在电泳凝胶约58.1 kDa处出现特异性条带，其分子量大小与预测值相符。经Western blotting检测，重组蛋白rHs-BD1可与Anti-6×His Tag抗体发生特异性反应，表明Hs-BD1基因在原核表达系统成功表达，经纯化的重组蛋白rHs-BD1含量为400.0 μg/mL。对已纯化的重组蛋白rHs-BD1进行体外抗菌活性检测，结果显示其对无乳链球菌(Streptococcus agalactiae) HPG1和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)HPN1的最小抑菌浓度(MIC)为40.00 μg/mL，对大肠杆菌(Escherichia coli)YLG1、类志贺邻单胞菌( Plesiomons shigelloides)DAL1和迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)FCH1的MIC为20.00 μg/mL，表明重组蛋白rHs-BD1对一些革兰氏阳性和阴性菌具有较强的抗菌活性。20.0、40.0、60.0和80.0 μg/mL重组蛋白rHs-BD1对新鲜黄沙鳖血细胞的溶血率分别为1.5%、2.7%、3.3%和4.2%，20.0、40.0、80.0和120.0 μg/mL重组蛋白rHs-BD1对1，1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)自由基的清除率分别为2.6%、5.2%、11.6%和17.0%。【结论】经原核表达获得的Hs-BD1重组蛋白rHs-BD1具有一定的广谱抗菌活性和抗氧化能力，且溶血作用较弱，对黄沙鳖机体毒副作用较低，可用于新型黄沙鳖抗菌药物开发。

利用反转录PCR(RT-PCR)和末端快速扩增(RACE)技术从三龄黏虫体内获得新型抗菌肽Diapausin基因的全长序列，利用生物信息学软件对该序列进行分析，并用原核表达体系对其进行诱导表达，为探究该基因的结构和功能提供理论参考。结果表明，成功克隆到了黏虫新型抗菌肽Diapausin基因，命名为Mysdiap(GenBank登录号：AZJ51075)。该基因全长537 bp,其中5′端和3′端非编码区分别为63,279 bp,开放阅读框全长195 bp,编码64个氨基酸残基，预测蛋白质分子质量为7.13 ku,等电点为5.59。Mysdiap的N端前24个氨基酸残基为信号肽序列。多重联配结果表明，Mysdiap氨基酸序列中具有高度保守区域ECCRAHG。成功构建了pET-Mysdiap重组表达质粒，并在大肠杆菌中用IPTG诱导其表达，表达的重组蛋白分子质量在20 ku左右，以包涵体和可溶性蛋白形式存在。综上，从黏虫中克隆获得了新型抗菌肽基因Mysdiap的全长序列，并在大肠杆菌中成功诱导其表达。

β-防御素是一类富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽,在脊椎动物免疫系统中发挥重要作用。本研究基于转录组Solexa测序结果,利用PCR和荧光定量PCR技术对俄罗斯鲟(Acipenser gueldenstaedti)β-防御素基因进行了克隆和表达模式分析。结果显示,俄罗斯鲟β-防御素cDNA片段长度为333 bp,包含开放阅读框(Open reading frame,ORF)213 bp,推测编码71个氨基酸;SMART分析表明,该基因包含23个氨基酸的信号肽,1个防御素-beta-2结构域,6个保守的半胱氨酸残

为了探讨重组犬溶菌酶的活性及临床应用前景,人工合成犬溶菌酶基因,构建其原核重组表达载体pPROHTa-rcLYZ,进行原核表达并对表达产物进行活性分析。结果表明,合成的犬溶菌酶基因全长396 bp,编码132 aa;构建的表达载体pPROHTa-rcLYZ含有犬溶菌基因完整的ORF;重组犬溶菌酶的相对分子质量为16 ku;重组犬溶菌酶约占全菌总蛋白32％,纯化后占全菌可溶性蛋白的95％;重组犬溶菌酶最适pH值为6．2,最适温度为38℃,对溶壁微球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌有较强的溶菌活力,对铜绿假单胞菌、链球菌、枯草杆菌等有一定的抑制作用,对白色念珠菌无抑制作用,对人工感染的犬大肠...

【目的】克隆胞内分枝杆菌肝素结合血凝素(HBHA)基因,并对其进行生物信息学分析和原核表达。【方法】应用巢式PCR克隆胞内分枝杆菌HBHA基因,利用在线分析软件对其基因序列及编码蛋白序列进行生物信息学分析。构建原核表达载体pET32a-HBHA,并进行诱导表达。【结果】胞内分枝杆菌HBHA基因完整的ORF全长618bp,编码205个氨基酸,该基因氨基酸序列与M.avium ATCC 25291有较高的相似性。HBHA蛋白为碱性、亲水性蛋白质,含12个潜在的磷酸化位点,存在抗原表位,亚细胞定位主要存在于细胞核,蛋白空间结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。构建了pET32a-HBHA原核表达载体,其可...

【目的】从鸭组织中克隆鸭β-防御素(AvBD)2基因,在大肠杆菌中高效表达,检测重组鸭AvBD2蛋白的生物学特性。【方法】应用RT-PCR技术从鸭胰腺组织中扩增鸭AvBD2基因,根据已发现的禽β-防御素和部分哺乳类动物β-防御素-2的氨基酸序列构建系统进化树,将该基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1上进行原核表达,对该重组蛋白进行纯化,测定体外抗菌活性与理化特性。【结果】鸭胰腺组织中克隆出鸭AvBD2基因的cDNA大小为195bp,编码64个氨基酸。同源性分析表明,鸭AvBD2与其它物种AvBD2同源性较高。凝胶电泳结果显示重组鸭AvBD2蛋白在原核高效表达(分子量约为32kD),...

通过PCR技术从罗曼鸡肝脏基因组中扩增鸡α干扰素(ChIFN-α)全基因,并克隆和测序。序列分析表明,ChIFN-α基因全长为582 bp,亚克隆其成熟蛋白编码基因489 bp,利用基因重组技术构建了重组质粒,使ChIFN-α置于原核表达载体pQE30的T5启动子下并同6×His(多聚组氨酸标签)-Tag融合。经酶切和PCR鉴定,DNA测序证实重组质粒pQEChIFN-α构建正确;将pQEChIFN-α转化大肠杆菌M15感受态细胞,用IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Westernblot证实表达出分子质量为19.80 kDa的融合蛋白。表达的蛋白以包涵体形式存在,经变性、复性处理后,在Ve...

【目的】克隆维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)低钙反应蛋白(AcrV)并进行原核表达,为进一步研究AcrV蛋白的结构功能及AcrV基因工程亚单位疫苗的制备奠定基础。【方法】克隆维氏气单胞菌TH0426菌株AcrV基因,通过生物信息学软件分析其编码蛋白的理化性质、疏水性、信号肽、跨膜区、二级结构及三级结构。将AcrV基因克隆到pET-30a(+)原核表达载体上,构建原核重组表达质粒pET-30a(+)-AcrV,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,进行EcoRⅤ和XhoⅠ双酶切鉴定和测序鉴定。用IPTG对pET-30a(+)-AcrV进行诱导表达,对IPTG浓度(0.2,0.4,0.6和0.8 mmol/L)和诱导时间(2,3,4和5 h)进行优化。在最佳条件下诱导表达重组蛋白AcrV,经镍柱纯化且尿素梯度复性后免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,进行SDS-PAGE及Western blot分析,对目的蛋白的免疫原性进行检测。【结果】成功获得了1 086 bp的AcrV全基因,编码361个氨基酸。AcrV蛋白是无跨膜结构且不编码信号肽的蛋白,有2个高度保守的结构功能域,属于全α型蛋白。成功构建了原核重组表达质粒pET-30a(+)-AcrV,其最佳诱导表达条件为IPTG 0.8 mmol/L诱导5 h。SDS-PAGE及Western blot分析结果显示,AcrV蛋白能被鼠抗阳性血清识别,表明其具有一定的反应原性。【结论】成功克隆了1 086 bp的AcrV基因,分析了其编码蛋白的生物信息;获得了免疫原性良好的重组AcrV蛋白。

【目的】克隆果蝇抗菌肽Andropin基因,以期利用原核表达系统生产高活性抗菌肽。【方法】首先化学合成了目的基因的2个片段和1对引物,然后利用重叠区互补PCR法得到抗菌肽Andropin的全基因序列。构建了融合表达载体pET32a-Anp,并转入感受态细胞OrigammiB进行原核融合表达。重组菌株诱导表达后,用His-Tag Purification kit亲和层析柱纯化融合蛋白,纯化的蛋白用肠激酶切割并进行活性分析。【结果】在诱导温度37℃、1mmol/LIPTG诱导培养4h的条件下,可获得高效表达的融合蛋白;融合蛋白的表达量占总蛋白的30%,分子质量约为28ku,可溶性达70%以上;抗菌...