目的探讨应激时热休克蛋白mRNA转录水平的变化。方法根据HSP90、HSP70和GAPDHmRNA序列,设计并合成引物,将PCR扩增的基因片段克隆到pGEM-T载体,重组质粒经筛选、鉴定,体外转录出RNA,梯度稀释作为阳性模板,用于标准曲线的制定和样品检测,建立了一步法实时荧光定量RT-PCR技术平台,并用于检测长途运输猪心脏和肝脏中HSP70及HSP90mRNA转录水平的改变。结果经1、2、4、6和10h的运输应激后,组织中HSP70mRNA的转录水平随着运输应激时间的延长一直呈现出上升的趋势,运输应激到10h时HSP70mRNA的转录水平升到最高,肝脏和心脏组织中HSP70mRNA的转录水...

【目的】克隆猪cDNA,作为猪LPLmRNA定量检测的标准品,建立检测方法。【方法】用RT-PCR,从猪背最长肌的总RNA中逆转录扩增LPL的cDNA,将纯化的LPLcDNA与pGM-T载体进行连接,转化宿主菌TOP10,提取重组质粒DNA,PCR鉴定并测序分析,对质粒标准进行实时荧光定量PCR检测。纯化质粒并检测260nm吸光度,确定原液的重组质粒拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品。【结果】建立了猪LPLmRNA实时定量PCR检测方法,特异性好,检测灵敏度达103拷贝,线性范围为1×103～1×1010拷贝,阈值与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系(R2=0.9...

采用苏木精–伊红(HE)染色、醋酸铀–枸橼酸铅染色和免疫组织化学染色,对模拟运输应激小鼠免疫器官(胸腺、淋巴结和脾脏)的结构和3种热休克蛋白(HSP27、HSP70和HSP90)的表达情况进行分析。结果表明:试验组小鼠的胸腺、淋巴结和脾脏结构均受到不同程度的损伤,胸腺髓质增大,皮质中血管充血,淋巴小结缩小,脾小结增大,中央动脉被破坏,细胞发生凋亡等;淋巴细胞核核膜呈锯齿状甚至碎裂,嗜酸性粒细胞胞核溶解消失,浆细胞破坏更为严重,线粒体肿胀,嵴断裂或消失等;HSP27在淋巴小结中的表达逐渐降低,在淋巴结髓质和脾脏中的表达有所增加,HSP70在淋巴结髓质中的表达逐渐降低,在淋巴小结和脾脏红髓中的表达升高,HSP90仅在淋巴结中有明显表达。综上可知,运输所引起的应激反应会对小鼠免疫器官的结构造成严重损伤,应激相关热休克蛋白HSP27、HSP70和HSP90的表达情况也会发生一定的变化,提示热休克蛋白与运输应激之间可能存在着某些调控关系。

采用苏木精–伊红(HE)染色、醋酸铀–枸橼酸铅染色和免疫组织化学染色,对模拟运输应激小鼠免疫器官(胸腺、淋巴结和脾脏)的结构和3种热休克蛋白(HSP27、HSP70和HSP90)的表达情况进行分析。结果表明:试验组小鼠的胸腺、淋巴结和脾脏结构均受到不同程度的损伤,胸腺髓质增大,皮质中血管充血,淋巴小结缩小,脾小结增大,中央动脉被破坏,细胞发生凋亡等;淋巴细胞核核膜呈锯齿状甚至碎裂,嗜酸性粒细胞胞核溶解消失,浆细胞破坏更为严重,线粒体肿胀,嵴断裂或消失等;HSP27在淋巴小结中的表达逐渐降低,在淋巴结髓质和脾脏中的表达有所增加,HSP70在淋巴结髓质中的表达逐渐降低,在淋巴小结和脾脏红髓中的表达升高,HSP90仅在淋巴结中有明显表达。综上可知,运输所引起的应激反应会对小鼠免疫器官的结构造成严重损伤,应激相关热休克蛋白HSP27、HSP70和HSP90的表达情况也会发生一定的变化,提示热休克蛋白与运输应激之间可能存在着某些调控关系。

依据GenBank已公布的鲫鱼热激蛋白70(Heat shock protein70,HSP70)和beta-actin mRNA序列,分别设计两对引物,应用半定量RT-PCR方法检测应激处理后不同恢复时期鲫鱼(Carassius auratus)肝脏中HSP70 mRNA的表达情况。结果表明,诱导后肝脏组织中HSP70 mRNA的表达量呈现时间依赖性,存在先升高后回落的趋势。在诱导后1h即有所升高,在4h时达到最高值,之后逐渐降低,至48h,表达量降至最初值。研究结果为鲫鱼HSP70的研究提供了基础数据,也为将HSP70用作鱼类生理状态的诊断提供了理论依据。

【目的】建立一种可同时检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）野毒株、猪A群轮状病毒（GARV）、猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）、猪阿尔法冠状病毒（SADS-CoV）及猪捷申病毒（PTV）5种猪腹泻病毒的一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测法。为猪腹泻病的快速诊断和流行病学调查提供高效灵敏的工具。【方法】对PEDV多个基因型毒株ORF3基因比对分析，以PEDV野毒株为模板，对疫苗株ORF3基因稳定缺失区域设计特异性探针，并在两端保守区域设计上下游引物；在靠近GARV G3、G4、G5和G9型NSP5基因5′端保守碱基区域设计引物及探针，并加入简并碱基。同时，分别选择PDCoV M基因、PTV 5′UTR序列、SADS-CoV N基因等保守基因设计特异性引物及探针，用于多重荧光定量PCR方法的建立。对引物、探针浓度和退火温度进行优化；用RStudio参照代码绘制ROC曲线，确定检测方法的敏感度值、特异度值及曲线下面积AUC，并计算Youden指数，最终确定检测临界值；从阳性核酸中扩增靶基因，并克隆至pEASY-T1载体。通过体外转录，获得5种标准品分别命名为：cRNA-PEDV、cRNA-GARV、cRNA-PDCoV、cRNA-PTV和cRNA-SADS-CoV。对检测方法的敏感性、特异性和重复性等进行评估；并与同类方法对临床样本的检测符合率进行比较。【结果】得到了5种病原检测的最佳引物、探针浓度和最佳退火温度。根据ROC曲线确定PEDV、GARV、PDCoV、PTV和SADS-CoV临界CT值分别为：35.78、34.25、34.98、34.60和35.70;5种病原的检测下限均可达到1×102 copies/μL，标准曲线线性关系良好，扩增效率在96.3%—104%之间；该方法对PEDV CV777疫苗株、PEDV AJ1102疫苗株、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、猪霍乱沙门氏菌（S.choleraesuis）、多杀性巴氏杆菌（P.multocida）、大肠杆菌（E.coli）、猪链球菌（S.suis）和葡萄球菌（S.aureus）等多种菌毒株均不检出，具有良好的特异性；经重复性检验，组内变异系数在0.22%—3.08%之间，组间变异系数在0.89%—4.0%之间；对242份临床样本检测并与同类方法的检测结果进行比较，符合率分别为：PEDV 97.9%、GARV 98.8%、PDCoV 100%、PTV98.3%和SADS-CoV100%,Kappa值均大于0.9。对PEDV野毒株的检测准确性高于同类方法。此外，对临床样本检测结果显示，当前四川省腹泻猪群中尚无SADS-COV检出；但PEDV、GARV、PDCoV和PTV仍持续流行，其总体阳性率分别达到：10.7%(26/242)、13.6%(33/242)、18.2%(44/242)和14.5%(35/242)，且各腹泻病原之间存在不同形式和程度的混合感染，使感染猪腹泻病情加剧。故需进一步加强几种猪腹泻病毒在本地区猪群中流行情况调查和遗传变异规律研究，为制定更具针对性的防控措施提供依据。【结论】本研究成功建立了一种同时检测PEDV野毒、PDCoV、SADS-CoV和GARV、PTV多基因型的一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR，为猪腹泻病的快速鉴别诊断和流行病学调查提供了一种高效灵敏的工具。

根据hsp70、hsp90和GAPDH基因mRNA序列,设计并合成3对引物,将PCR扩增的基因片段克隆到pGEM-T载体,重组质粒经筛选、鉴定,体外转录出RNA,系列稀释作为阳性标准品,用于标准曲线的绘制和样品检测,并用持家蛋白GAPDH基因对样品进行归一化,建立了一步法实时荧光定量RT-PCR技术平台,并对其扩增效率、敏感性、特异性进行了检测。结果证明,建立的一步法荧光定量RT-PCR技术可以真实地反映反应管中模板的数量,可用于猪hsp70、hsp90和GAPDH基因mRNA水平的检测。

研究根据传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因序列设计了两条引物,通过RT-PCR技术对IBDV的VP2进行扩增,构建IBDV-VP2的标准品质粒,建立基于IBDV-VP2基因的荧光定量RT-PCR检测(QRT-PCR)技术和标准曲线,并检测该QRT-PCR体系的特异性、灵敏度和重复性,最后将该QRT-PCR体系应用于鸡外周血淋巴细胞(PBLs)中IBDV超强毒株(vvIBDV)复制规律以及临床样品的检测。结果表明,建立的QRT-PCR体系特异性好,不能与NDV、IBV及FAV1等发生反应,敏感度为1.51×101拷贝数/μl,扩增效率达1.018,重复性试验组内变异系数和组间变异系数均小于...

将 90只肉鸡随机分成A组 (对照)、B组 (热应激 6h)、C组 (热应激 12h)、D组 (热应激 18h)、E组 (热应激 24h) 和F组 (热应激 48h)。对各组受试鸡心肌进行病理组织学检查, 并利用 4种HSP单克隆抗体 (HSP27、HSP60、HSC70和HSP86 ) 对心肌纤维进行免疫组织化学染色。实验结果显示, 热应激时心肌纤维的病理组织学损伤主要表现为心肌纤维变性和心肌纤维断裂; HSP27、HSP60、HSC70和HSP86在心肌纤维中的定位不尽相同, HSP27、HSC70和HSP86在心肌纤维中有强阳性表达, 但HSP60的阳性染色较弱。提示HSPs在心肌纤维内...

为建立及应用定量检测猪促炎细胞因子mRNA表达水平的方法,从分子水平研究脑心肌炎病毒(EMCV)的致病机制,分别构建含有猪促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α以及管家基因β-actin基因片段的重组质粒标准品,建立了检测IL-1β/β-actin、IL-6/β-actin、TNF-α/β-actin的多重TaqMan real-time PCR检测方法。标准曲线的相关系数均达到0.998以上;初始模板的检出下限均达到10拷贝/μL;只有以目标cDNA为模板,并加入特异性引物和探针的反应才能检测到荧光信号;组内与组间的变异系数均小于2%。应用所建立的检测方法,对猪源EMCV GXLC株感...

【目的】建立一种能检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)含量的荧光定量RT-PCR方法,为猪传染性胃肠炎(TGE)的诊断和防治提供技术支持。【方法】根据TGEV TH98株的N基因序列设计1对特异性引物,扩增出目的片段,连接克隆载体后构建质粒标准品;对荧光定量的循环条件进行优化,建立猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法,对其重复性、特异性进行检测,并与普通PCR检测方法进行比较,最后应用该方法对采自陕西杨凌周边的30份临床样品进行检测。【结果】成功构建了质粒标准品,建立了检测猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量RT-PCR方法,该方法特异性高、重复性好、敏感性比普通PCR检测方法高2个数量级,对...

为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法,根据GenBank收录的TGEV-Miller毒株的S基因序列,设计合成1对特异性引物,用RT-PCR方法从疫苗株中扩增TGEV S基因的部分保守片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,得到重组质粒作为荧光定量RT-PCR检测的标准模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR扩增,并制作标准曲线,建立TGEV的荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明:该方法检测灵敏度可达30拷贝/μL,与猪圆环病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒和猪流感病毒和猪细小病毒不发生交叉反应,具有重复性好、特异...

卵黄磷蛋白作为卵黄蛋白的主要成分,可为甲壳动物胚胎和早期幼体发育提供能量,为研究其来源及合成规律,实验应用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR法检测了凡纳滨对虾和罗氏沼虾性腺不同发育时期卵巢和肝胰腺两种组织中卵黄蛋白原mRNA的表达水平。结果发现,凡纳滨对虾和罗氏沼虾的卵巢和肝胰腺中都有卵黄蛋白原mRNA的表达。随着卵巢的发育,凡纳滨对虾卵巢中卵黄蛋白原mRNA的相对表达量在前5个阶段不断增加,分别为1.1,5.9,10.4,26.9,85.0,恢复期急剧减少,为1.6。肝胰腺中的相对表达量也不断增加,分别为1.3,3.3,7.1,37.3,51.6,恢复期急剧减少,为1.0。罗氏沼虾肝胰腺中...

中国明对虾卵黄蛋白原mRNA基因在卵巢和肝胰腺中都有表达。采用实时荧光定量PCR方法测定在卵巢不同发育时期卵巢和肝胰腺这两种组织的卵黄蛋白原mRNA的表达水平,提取组织总RNA,设计特异性引物进行荧光定量PCR扩增,对卵巢发育的各个阶段,卵原细胞增殖期、卵黄发生前期、初级卵黄发生期、次级卵黄发生期和消退期的卵黄蛋白原mRNA表达进行相对定量分析。结果表明:在卵巢中,卵黄蛋白原mRNA在前3个阶段随着卵巢的发育,表达量不断增加,分别为0.04、0.23和1.03,次级卵黄发生期开始减少到0.16,消退期卵黄蛋白原mRNA表达量又增加到1.00。而在肝胰腺,前4个阶段随着卵巢发育,表达量逐步增加,...

【目的】蓝莓休克病毒（ＢｌｕｅＢｅｒｒｙ ｓｈｏｃｋ ｖｉｒｕｓ，Ｂｌｓｈｖ）是蓝莓上主要病毒之一，侵染蓝莓后能够对其产量造成严重影响。研究旨在建立用于Ｂｌｓｈｖ快速检测的ｉｃ－ｒＴ－ｎｅｓＴｅｄ Ｐｃｒ技术，为该病毒的检测鉴定提供可靠的技术手段。【方法】根据ＧｅｎＢａｎｋ已报道的Ｂｌｓｈｖ基因序列，设计一对外侧引物（Ｂｌｓｈｖ－Ｆ／Ｂｌｓｈｖ－ｒ）和一对内侧引物（Ｂｌｓｈｖ－１／Ｂｌｓｈｖ－２），以感染Ｂｌｓｈｖ的蓝莓病叶为材料，利用免疫ｉｃ－ｒＴ－Ｐｃｒ（免疫捕获ｒＴ－Ｐｃｒ）和ｎｅｓＴｅｄ Ｐｃｒ（巢式Ｐｃｒ）建立Ｂｌｓｈｖ的ｉｃ－ｒＴ－ｎｅｓＴｅｄ Ｐｃｒ检测技术；分别以Ｂｌｓｈｖ、蓝．．．