为了阐明洪湖碘泡虫(Myxobolushonghuensis)在隐性感染异育银鲫(Carassiusauratusgibelio,Bloch)不同组织器官中的分布情况,本研究采集曾发生过喉孢子虫病养殖池塘的2龄健康异育银鲫的鳃(丝)、伪鳃、中肾、头肾、肌肉、脾脏、肝脏、卵巢、血液等9个组织器官,采用荧光定量PCR检测分析了不同组织器官的感染率和相对感染强度。结果显示,所采集的30尾异育银鲫都没有明显临床症状,但鱼体的洪湖碘泡虫感染率为100%,均为隐性感染个体;各组织器官间的感染率存在较大差异,除肌肉未检出外,感染率从高到低依次为:伪鳃(100.0%)、卵巢(83.3%)、鳃(73.3%)、脾脏(70.0%)、中肾(36.7%)、头肾(23.3%)、肝脏(10.0%)、血液(6.7%)、肌肉(0)。不同组织器官的相对感染强度由高到低依次为:伪鳃(14.4349±70.0529)、卵巢(0.9556±1.5627)、脾脏(0.3644±0.7854)、鳃(0.3339±0.2682)、头肾(0.2722±0.3761)、中肾(0.0379±0.1055)、肝脏(0.0019±0.0022)、血液(0.0012±0.0011)。研究表明,洪湖碘泡虫可系统感染异育银鲫多个组织器官,其中,伪鳃感染率和感染强度最高,可以作为该病早期检测和疫病监测的首选组织器官。

洪湖碘泡虫(Myxobolus honghuensis)是引起异育银鲫(Carassius auratus gibelio Bloch)“喉孢子病”的重要病原， 每年导致养殖苗种和成鱼大量死亡。本研究通过隐性感染异育银鲫母本人工受精、实验室条件下受精卵孵化和幼鱼培育， 采用单管半巢式PCR、荧光定量PCR和寡核苷酸荧光原位杂交等检测手段进行亲本、卵和幼鱼等环节的检测分析， 探究异育银鲫寄生洪湖碘泡虫是否存在经卵传播途径。结果表明， 实验所采用34尾异育银鲫母本(A1～A22， B1～B12)的洪湖碘泡虫隐性感染率达50%～75%， 其中， 卵和伪鳃检出率高于卵巢组织样品; 特异性寡核苷酸探针荧光原位杂交在隐性感染母本的卵巢、伪鳃、肾、脾组织检测到洪湖碘泡虫前孢子生成阶段营养体; 实验室条件下阳性母本所产的卵经孵化和培育出的幼鱼15 dph和30 dph样品可以检出阳性(A1、A18、B8和B9); 荧光原位杂交显示15 dph幼鱼在伪鳃、鳃和肾脏组织检测出阳性信号。本研究进一步揭示了异育银鲫寄生洪湖碘泡虫存在经鱼卵传播途径; 研究结果为相关疾病制定防控措施奠定重要的理论基础。

为探究洪湖碘泡虫感染异育银鲫不同组织器官中的分布及不同感染阶段的差异，实验采用显微镜镜检、PCR检测及组织病理切片相结合手段，对发病异育银鲫及隐性感染异育银鲫的肌肉、伪鳃、鳃、头肾等11个组织器官进行了广泛检测分析。显微镜镜检发现，在发病鱼的咽、伪鳃和鳃能观察到孢囊或成熟孢子；在隐性感染异育银鲫的咽上壁与副蝶骨间结缔组织、伪鳃及其血管周边观察到大量棕黄色结节，并含有洪湖碘泡虫的成熟孢子；不同组织器官DNA样品PCR检测发现，在发病鱼除肌肉外的其他10个组织器官中均检测到洪湖碘泡虫阳性，其中伪鳃检出率最高（100%）；隐性感染异育银鲫在咽上壁组织、伪鳃、头肾、体肾、脾脏及卵巢中检出洪湖碘泡虫阳性，伪鳃检出率也为最高（26.7%）；组织病理切片显示发病鱼咽上壁内分布着大量蜂巢状孢囊及成熟孢子，伪鳃被严重侵占和破坏；残存伪鳃鳃丝周边能观察到增殖和发育阶段的孢子生成细胞。综上所述，本研究首次报道了洪湖碘泡虫在发病和隐性感染异育银鲫不同组织器官中的分布差异，发现伪鳃可能是洪湖碘泡虫寄生和发育成熟的重要器官。研究结果为洪湖碘泡虫病的准确检验检疫和进一步开展致病机制研究奠定基础。

为建立一种灵敏、特异的快速检测异育银鲫寄生洪湖碘泡虫(Myxobolus honghuensis)的方法,本研究根据洪湖碘泡虫ITS-5.8S r DNA基因序列筛选出一对特异性引物Mh F/R,建立PCR检测方法,对反应条件进行优化,并通过特异性试验、灵敏性试验与临床检测验证其可行性。结果显示,建立的PCR检测方法能特异性扩增洪湖碘泡虫相应的基因片段,长度为479 bp,而对试验中其他9种粘孢子虫的扩增结果均为阴性;最低能检测0.1 pg的虫体基因组DNA。通过临床样品检测,PCR方法比显微镜检测的检出

在异育银鲫(Carassius auratus gibelio Bloch)养殖过程中，因感染洪湖碘泡虫(Myxobolus honghuensis)引起的“喉孢子虫病”常会导致池塘养殖苗种和成鱼大量死亡。因此，建立一种特异性强、灵敏度高和易于操作的检测方法对于该病的早期诊断以及防治具有重要意义。本研究基于洪湖碘泡虫18S rDNA基因序列设计合成两组特异性引物，通过外引物组和单条内引物组合及条件优化，建立了洪湖碘泡虫单管半巢式PCR检测方法，并对该方法的特异性、灵敏度及临床应用分别进行了验证。结果显示，该检测方法特异性好，只有洪湖碘泡虫扩增为阳性，瓶囊碘泡虫(Myxobolus ampullicapsulatus)、吴李碘泡虫(Myxobolus wulii)、武汉单极虫(Thelohanellus wuhanensis)及异育银鲫肌肉样品等均为阴性；最低检测灵敏度极限为4.2 copy/μL；对疫区养殖池塘健康异育银鲫的卵巢、肾脏及脾脏组织样品检测发现洪湖碘泡虫阳性率分别为40%、32%和8%，检出率显著高于普通PCR。因此，本研究所建立的检测方法特异性强、灵敏度高，可应用于洪湖碘泡虫的早期快速检测。

咽碘泡虫（Ｍｙｘｏｂｏｌｕｓ ｐｈａｒｙｎａｅ）病是近几年发生在江苏省盐城地区的大丰、射阳和滨海以及周边地区，引起养殖异育银鲫（Ｃａｒａｓｓｉｕｓ ａｕｒａｔｕｓ ｇｉｂｅｌｉｏ）大批死亡的一种黏孢子虫病，咽碘泡虫只特异地寄生在异育银鲫的咽部组织内，为了阐明该病对鱼体的损伤作用，我们对不同患病时期的异育银鲫的组织病理和疾病中期的病理生理进行研究。组织病理结果表明：疾病初期病鱼咽部略有轻度充血，咽碘泡虫以营养体阶段寄生在咽部黏膜下层的组织中，并开始形成由成纤维细胞包裹的小孢囊，其他组织器官无病理损伤现象；疾病中期由于小孢囊数量增加和囊内营养体分裂增殖并逐步发育为成熟孢子后体积增大，构成的大孢囊使．．．

为了完善瓶囊碘泡虫的分类学特征及厘清其与洪湖碘泡虫的分类关系，实验采用形态学、组织学和分子生物学方法对瓶囊碘泡虫进行了重描述，并与洪湖碘泡虫的分子标记进行了系统比较。结果显示，瓶囊碘泡虫寄生于异育银鲫的鳃，形成乳白色的圆形或椭圆形孢囊，直径为1.2～1.4 mm。成熟孢子壳面观呈梨形，前端较尖，后端钝圆，孢子长17.3～19.6μm，孢子宽7.4～9.9μm。两个极囊呈瓶状，大小不等。大极囊长6.4～9.7μm，大极囊宽2.1～3.3μm；小极囊长5.3～8.9μm，小极囊宽2.0～3.3μm。极丝圈数为8～11圈。组织学分析显示，瓶囊碘泡虫寄生于鳃小片间的上皮组织。BLAST分析显示，本研究获得的瓶囊碘泡虫的小亚基核糖体DNA (SSU rDNA)序列与GenBank中瓶囊碘泡虫序列的相似性为99.5%～99.8%(KC425223～KC425225、MH329620、JQ690361、JQ690373、KJ725082、MN227351、DQ339482)。系统发育分析表明，瓶囊碘泡虫与洪湖碘泡虫形成姐妹支。瓶囊碘泡虫与洪湖碘泡虫分子标记序列的比较结果显示，这两种碘泡虫的序列相似性为98.2%～98.8%，遗传距离为0.014～0.018，存在27个碱基差异。SSU rRNA二级结构分析显示，瓶囊碘泡虫和洪湖碘泡虫同一物种不同群体间的二级结构一致，两个物种间的二级结构存在明显差异，表明SSU rRNA二级结构可以作为鉴别瓶囊碘泡虫和洪湖碘泡虫的分子特征。本研究完善了瓶囊碘泡虫在异育银鲫鳃部的详细寄生部位，提出SSU rRNA二级结构可以作为有效鉴别瓶囊碘泡虫和洪湖碘泡虫的分子标记。

洪湖碘泡虫是中国异育银鲫养殖中常见的一种粘孢子虫，严重感染时病鱼出现眼球凸起，咽部发炎肿胀等症状，造成苗种和成鱼死亡。为探究严重危害养殖异育银鲫“喉孢子虫病”病原的宿主范围以及不同宿主寄生虫株间的遗传差异，本研究广泛采集了金鱼、红鲫、异育银鲫、彭泽鲫、方正银鲫、淇河鲫、金背鲫、杂交鲫等我国常见鲫复合种样品，采用18S r DNA PCR检测了各样品伪鳃的洪湖碘泡虫感染率，并进一步通过巢式PCR克隆测序获得部分样品洪湖碘泡虫的ITS2序列(登录号：OR744899–OR744905)。PCR检测结果显示，来自7个地区8种鲫属鱼类品系都存在洪湖碘泡虫的隐性感染，感染率为25.0%～88.2%;ITS2序列分析表明，感染鲫复合种的洪湖碘泡虫株系间序列差异较低，所获得的序列间仅有6个差异信息位点，平均遗传距离为0.003；不同来源虫株间共存在7种单倍型，其中H1、H2和H3只出现在金鱼、红鲫寄生虫株，H5广泛存在不同来源的异育银鲫寄生虫株。系统发育分析显示，来自不同鲫复合种的洪湖碘泡虫聚集为2个分支，其中寄生金鱼的虫株与瓶囊碘泡虫亲缘关系较近。本研究结果为阐明异育银鲫“喉孢子虫病”的流行病学规律和防控疾病发生提供重要基础数据。

根据基因库中单孢子虫的基因保守序列,设计了1对特异性引物和1条TaqMan探针,对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了检测单孢子虫的荧光定量PCR方法。该方法对单孢子虫的检测敏感性达到40拷贝数,比常规PCR敏感性高100倍;对派琴虫、折光马尔太虫、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测结果全为阴性。表明该研究建立的单孢子虫荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量和重复性好等优点,可用于临床单孢子虫感染的快速检测。

检查了东海区283尾野生黄鳍东方鲀(Takifugu xanthopterus)样本，发现具有河鲀毒素的黄鳍东方鲀也受到线虫的感染。11月份黄鳍东方鲀体内异尖线虫感染情况最严重。通过形态学特征和线粒体DNA鉴定，黄鳍东方鲀组织内寄生的线虫为派氏异尖线虫(Anisakis pegreffii)。免疫组学分析发现异尖线虫体内含有河鲀毒素，进一步的高效液相色谱-质谱检测，异尖线虫体内河鲀毒素含量为425ng/g。这是首次发现寄生在东方鲀体内的线虫具有河鲀毒素。

为克服现有小瓜虫病的显微镜检和PCR诊断等方法在该寄生虫的感染早期阶段和环境样本检测中存在的缺陷，建立特异性强、灵敏度高的多子小瓜虫PCR检测方法，实验根据多子小瓜虫线粒体COⅠ序列设计和筛选了一对引物，经过PCR程序优化、特异性、灵敏性验证以及临床和环境样品检测分析，分别建立了普通PCR和荧光定量PCR检测方法。结果显示，本研究获得的检测引物对多子小瓜虫有较高的扩增特异性，对同属纤毛虫类的草履虫、四膜虫和肠袋虫以及常见养殖鱼类宿主异育银鲫、草鱼、尼罗罗非鱼和团头鲂等样本均无扩增；扩增特异性和灵敏度都优于文献报道的方法。其中，普通PCR最低检测的样本浓度为掠食体2.67个/μL，荧光定量PCR在掠食体0.02个/μL时依然能有效检出，荧光定量PCR检测灵敏度高于普通PCR。研究表明，在临床样本和养殖水环境样本检测应用中，基于该引物的两种PCR方法表现出很高的一致性，能有效检出潜伏感染鱼体和养殖水环境中的多子小瓜虫。本研究所建立的多子小瓜虫的检测方法特异性强、灵敏度高，适用于淡水养殖中小瓜虫病的早期诊断和病原体的检测。

以环状异帽藻(Heterocapsa circularisquama)ITS1区为靶序列设计了一对特异性引物,运用Real-time PCR方法,对环状异帽藻进行了定性定量检测。以其他9种赤潮微藻为对照验证其特异性。结果表明,仅含环状异帽藻DNA模板的样品有扩增,其他藻没有检测到扩增信号。以超声波破碎得到的藻液为标准品,所得标准曲线具有高度线性相关,相关系数R2为0.989,并且可以在30个循环内检测到0.5个细胞。对在不同培养条件下获得的环状异帽藻DNA样品进行检测,都能获得扩增信号。利用该方法建立的标准曲线对初步模拟现场样品进行定量检测,与显微镜计数结果基本一致。

根据基因库中折光马尔太虫的基因保守序列,设计合成了一对引物和一条TaqMan探针,建立检测折光马尔太虫的荧光定量PCR方法,将建立的荧光定量PCR检测方法与常规PCR检测对比,所建立的荧光定量PCR方法灵敏度可达40个拷贝/μl,比常规PCR灵敏度高100倍,对派琴虫、单孢子虫、嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测结果为阴性。结果显示研究建立的折光马尔太虫荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床上折光马尔太虫感染的检测。

选择派琴虫保守的核糖体DNAITS-2区域设计引物和TaqMan探针,通过对反应体系和反应条件进行优化,建立了实时荧光定量PCR检测派琴虫的方法。所构建方法检测质粒模板DNA的动态范围为2.6×101～2.6×107拷贝,敏感度可检测到26拷贝质粒DNA,而且与包拉米原虫、隐孢子虫等其他寄生性原虫无交叉反应,也不受贝类组织DNA的干扰。利用本研究所建立的方法对来自我国山东、福建等不同沿海海域的30份贝类样品进行检测,检出阳性样品3份。研究表明,本研究所构建的派琴虫实时荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏和特异等优点,可满足国内养殖场及进出口水生动物携带派琴虫的检测需要。

对近几年发生在江苏省盐城地区引起池养异育银鲫大批死亡的粘孢子虫进行了形态和分子等方面分析研究,发现该粘孢子虫主要特点是:孢子梨形,部分孢子后部外周包围有透明无色的膜状鞘和壳瓣底部内侧呈现1～6个"V"形缺刻,两个极囊大小不等,孢子前端内侧两个极囊间有一个细长的囊间突起,胚质中无嗜碘泡,孢囊大小10～25 mm,孢子长16.82±0.43(16.03～17.69)μm,孢子宽10.26±0.43(9.12～10.88)μm,孢子厚8.09±0.29(7.50～8.75)μm,孢子长宽比1.64±0.09(1.50～1.93);大极囊长8.66±0.25(8.25～9.16)μm、宽3.65±0....