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[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
张好放 郁二蒙 王广军 余德光 李志斐 谢骏
为研究TGF-β1/Smad4信号通路在草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肌肉发育过程中的作用机制,首先克隆了草鱼TGF-β1、Smad4基因开放阅读框(ORF,Open reading frame)序列各1 134和1 644bp。其次,在TGF-β1、Smad4序列两端分别加上相应的酶切位点,同时对pcDNA3.1(+)真核表达载体进行双酶切,将带酶切位点的片段正向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建TGF-β1、Smad4基因的真核过表达载体pcDNA3.1(+)-
关键词：
草鱼 克隆 真核表达载体 RNA干扰
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王宝维 张倩 葛文华 张名爱 岳斌 黄国清
【目的】鹅源草酸青霉F67(Penicillium oxalicum Currie & Thom)纤维素酶二糖水解酶(cellobiohydrolase,CBHⅠ)基因克隆并构建真核表达载体,为该菌株分子特性的进一步研究及构建高效纤维素分解菌奠定基础。【方法】首先通过兼并PCR法扩增CBHⅠ基因片段,然后利用改良热不对称交错PCR(TAIL-PCR)技术克隆CBHⅠ基因5′端和3′端侧翼序列,最后采用RT-PCR法扩增鹅源草酸青霉F67CBHⅠ基因序列全长,并对该基因进行生物信息学分析,构建pPIC9K真核表达载体。【结果】分别扩增到鹅源草酸青霉F67纤维素酶CBHⅠ基因片段A(EU57473...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
王杉 徐文腾 李明 王洁 王磊 翟介明 陈松林
虹彩病毒是造成斑石鲷(Oplegnathus punctatus)工厂化养殖中大规模死亡的主要病原,其感染力极强,感染后的斑石鲷死亡率高,严重影响了斑石鲷养殖产业发展。转化生长因子TGF-β1是一种重要的免疫调节因子,在病毒免疫应答中发挥重要作用。为研究TGF-β1在斑石鲷被虹彩病毒感染过程中发挥的作用,运用RACE和实时荧光定量qRT-PCR技术对TGF-β1进行了基因克隆,并对其进行在不同组织、不同时间点相对表达量的差异分析。结果显示,斑石鲷TGF-β1基因c DNA序列全长为3157 bp,5’非编码区长712 bp,3’非编码区长1278 bp,开放性阅读框长1167 bp,编码388个氨基酸,基因组包含6个外显子和5个内含子。同源分析发现,TGF-β1和鱼类相似度较高,与半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的同源性最高,为76.67%。TGF-β1在斑石鲷健康组织(肝脏、脾脏、肾脏、头肾、心脏、鳃、胃、肠和皮肤)中均有表达,在头肾、肠、肝脏和皮肤组织中表达量较高,而在脾脏和肾脏组织表达量较低。为进一步研究TGF-β1在病毒感染过程中相对表达量的变化,对健康斑石鲷注射虹彩病毒进行刺激,随后比较了TGF-β1在脾脏、肝脏、肾脏、头肾4个不同组织、不同时间点的相对表达量的差异,在头肾、脾脏和肝脏中,病毒刺激后TGF-β1的表达量均出现升高,但在脾脏和肝脏中,峰值出现在刺激后第4天,而在头肾中峰值出现在感染后的第10天。在肾脏中,病毒刺激后的TGF-β1的表达呈现下降趋势,0 d表达量最高,4、7 d依次降低,7 d降至最低,10 d有所恢复。以上研究表明,TGF-β1可能响应了虹彩病毒对机体的刺激,可能在对病毒免疫应答中发挥作用。而病毒感染后不同组织中TGF-β1相对表达量的差异,则值得进一步研究。
关键词：
斑石鲷 虹彩病毒 TGF-β1
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
刘莉 刘鹏 金佳丽 吴海丽 王改改 江晨 采克俊
Mx蛋白是一类由I型干扰素(IFN)诱导表达的抗病毒蛋白。以PolyI∶C诱导的草鱼(Ctenopharyngodon indellus)肾细胞(CIK cells)为材料,抽提细胞总RNA,通过RT-PCR的方法扩增出Mx基因cDNA全序列,连接至pMD20-T载体上,构建重组质粒pMD20-T-Mx,并测序进行序列分析。用限制性内切酶从克隆的重组质粒pMD20-T-Mx上切下Mx基因,插入到质粒pEGFP-C1中,构建真核表达载体pEGFP-C1-Mx。结果显示,该基因cDNA全序列为1 921 bp,阅读框共编码627个氨基酸,分子量约为71.1 ku,理论等电点pI为8.33,其编码的...
关键词：
草鱼 Mx基因 克隆 序列分析 载体构建
[期刊] 林业科学研究
[作者]
车代弟 王海峰 王金刚 龚束芳 樊金萍
利用简并引物RT-PCR,克隆复叶槭FtsZ基因的cDNA序列,利用马铃薯X组病毒载体pgR107,构建RNA干扰重组病毒载体pVX-AnFtsZi,并转化农杆菌GV3101(含辅助质粒pJIC Sa-rep)侵染烟草。40 d后,检测烟草内源FtsZ基因的表达量。研究结果表明:从复叶槭中克隆到的569bpFtsZ基因cDNA片段,具有FtsZ蛋白的核心功能序列GGGTGSG。构建的hpRNA型RNA干扰载体抑制了FtsZ基因的表达。为培育槭树类彩叶新品种奠定分子理论基础。
[期刊] 海洋渔业
[作者]
苏艳芳 付元帅 施志仪 张红梅 高丽娜
采用RACE-PCR技术,从牙鲆(Paralichthys olivaceus)组织中克隆了血清应答因子(SRF)基因全长序列,该序列全长2 477 bp,开放阅读框1 503 bp,编码500个氨基酸。通过氨基酸同源序列比对,牙鲆SRF与其它物种的同源性较高,在氨基酸序列的N端具有NLS结构域和高度保守的MADS结构域。用PCR方法扩增SRF基因的编码区片段,克隆到p EGFP-N1载体中,构建真核表达载体p EGFP-N1-SRF,将重组质粒转染牙鲆胚胎细胞,在荧光显微镜下观察转染细胞有绿色荧光蛋白表达。荧光定量PCR和Western blot实验进一步证实,SRF在转染细胞中高表达。说明...
关键词：
SRF 牙鲆 克隆 真核表达
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
于巧平 尹明安 任小林 姜永华
【目的】通过生物信息学分析,将苹果的一段EST序列初步定性为转录因子MdHB-1基因,对该基因进行克隆和真核表达载体构建,为进一步研究其分子生物学功能奠定基础。【方法】根据番茄LeACO1转录因子LeHB-1的基因序列,对苹果EST库进行Blast,获得一段EST序列,根据该EST序列设计1对特异性引物,以"皇家嘎啦"苹果花器总RNA为材料,经RT-PCR得到1条长约1 000bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定及分析。将基因MdHB-1与真核表达载体pPICZA连接,构建真核表达载体pPICZA-MdHB-1,并导入毕赤酵母菌种GS115,通过PCR鉴定该载体的导入情况。【结果】克隆...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
冯军厂 刘臻 鲁双庆 聂国兴 周玲 孙浪
采用同源克隆和RACE技术克隆草鱼(Ctenopharyngodon idellus)PepT1基因的全长cDNA序列。该cDNA全长为2 762 bp,包含141 bp的5′UTR序列,479 bp的3′UTR序列,2 142 bp开放阅读框,编码713个氨基酸;草鱼与鲫(Carassius auratus)、斑马鱼(Danio rerio)的核苷酸同源性分别为77.6%和74.0%,氨基酸同源性分别为78.0%和76.7%;与其他物种的核苷酸同源性为53.9%～59.1%,而氨基酸的同源性为57.2%～61.8%。经预测,其编码蛋白的分子量为79.29 kD,等电点为5.87,该蛋白具有与...
[期刊] 华北农学报
[作者]
阚威 王华 马友记 赵兴绪 张勇
为研制奶牛乳房炎无乳链球菌的基因工程疫苗,采集隐性奶牛乳房炎奶样,利用THB(Todd-Hewitt Broth)固体选择培养基和色素试验,并结合无乳链球菌种属特异性基因cfb,采用PCR技术从隐性乳房炎奶样中分离和鉴定无乳链球菌。根据GenBank已报道的链球菌cfb基因序列,经ORF分析和B细胞表位预测,利用Primer 5.0软件设计cfb因子富含B细胞表位区域引物,添加酶切位点和真核表达元件,以分离株无乳链球菌的基因组为模板,PCR扩增cfb基因并连接T载体克隆测序,经测序确定无误后,连接pcDNATM3.1 V5-His A(pcDNA-cfb)真核载体,转化DH5α感受态细胞,提取...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
董建宝 谢芝勋 孙建华 刘加波 庞耀珊 邓显文 谢志勤 谢丽基
设计1对特异性引物,采用PCR方法从pMD18-TCHIFN-γ重组载体中扩增得到广西三黄鸡γ-干扰素基因,然后将该基因克隆入含有绿色荧光报告基团EGFP的真核表达载体pEGFP-N1中,构建成pEGFP-N1CHIFN-γ重组质粒,PCR鉴定结果和测序结果均显示,γ-干扰素基因正确地插入到真核表达载体中。使用脂质体转染法将pEGFP-N1CHIFN-γ转染Vero细胞,荧光显微镜下成功地观察到绿色荧光,说明γ-干扰素基因成功表达。
关键词：
鸡γ-干扰素 绿色荧光 真核表达
[期刊] 中国农业科学
[作者]
廖芳芳 苑嗣纯 张中文 吴国娟
【目的】构建泛素启动酶Arkadia和泛素羧基末端水解酶-5(亦称UCH37)的表达载体,并探讨Smad7蛋白的泛素化修饰对马兜铃酸肾病中TGF-β1/Smads信号通路的影响。【方法】通过观察绿色荧光的表达量及real-time PCR反应优化转染条件,转染Arkadia和UCH37 siRNA,real-time PCR检测mRNA表达抑制率。分别构建Arkadia和UCH37的表达载体pGPU6/GFP/Neo,经鉴定后转染细胞,real-time PCR和Western blotting检测Arkadia、UCH37和Smad7的表达变化。【结果】①30 pmol siRNA和1.5μ...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
丁勇 常玮 刘小烛
【目的】克隆甘蓝型油菜(Brassica napus)油体钙蛋白(caleosin)基因BnClo1,并进行原核表达研究。【方法】在获得甘蓝型油菜BnClo1基因全长cDNA的基础上,根据BnClo1基因编码区设计1对特异引物,以甘蓝型油菜种子总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约750bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段克隆到原核表达载体pTYB12中,构建融合表达载体pTYB12-BnClo1,转化到Escherichia coli ER2566(DE3)中进行表达。【结果】测序结果显示,RT-PCR获得的cDNA全长768bp,包含完整的开放阅读...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
王伟 白俊杰 劳海华 叶星 罗建仁
根据已报道的Mx蛋白cDNA序列设计合成特异引物,应用逆转录 聚合酶链式反应(RT PCR)方法,从草鱼呼肠孤病毒(GCRV)诱导的草鱼(Ctenopharyngodonidellus)肝脏总RNA中扩增获得Mx蛋白cDNA,回收纯化后克隆到pGEM TEasyVector系统的T载体上。重组子的序列分析表明:所克隆的Mx蛋白cDNA长722bp,编码240个氨基酸,包括1个三联GTP结合区域和1个发动蛋白(dynamin)族特征的序列。与已知鱼类Mx蛋白基因序列比较表明,草鱼Mx蛋白基因序列与其它鱼类Mx基因相应序列具有较高的同源性,其中与斑马鱼Mx蛋白E型基因碱基序列比较同源性最高,为87...
关键词：
草鱼 Mx蛋白基因 基因克隆 原核表达
[期刊] 中国水产科学
[作者]
陈玥 李家乐 沈玉帮
为了研究C1qC基因在草鱼(Ctenopharyngodon idella)免疫过程中所起的作用,利用RT-PCR和RACE方法克隆获得了C1qC基因cDNA全长序列,经序列分析表明,所克隆的C1qC cDNA全长为916 bp,包括开放阅读框(open reading frame,ORF)735 bp,5′端非编码区(untranslated region,UTR)89 bp和3′端非编码区(UTR)92 bp。735 bp的ORF共编码244个氨基酸,相对分子量为26 162.5 U。同源性分析表明,草鱼与斑马鱼(Danio rerio)的相似度最高,达到71%。经草鱼呼肠孤病毒(gras...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
张茂 刘德武 林纯 贺晓燕 孟繁明 周庆丰 杜云平 吴珍芳
从黑曲霉(Aspergillus niger)GI M3.452中克隆得到木聚糖酶基因xynA的成熟肽编码序列。通过重叠延伸PCR将不带原基因信号肽编码序列的xynA基因片段和猪腮腺分泌蛋白(parotid secretory protein,PSP)基因的信号肽进行拼接得到融合片段SPA,并将其克隆到真核表达载体pcDNA6/HisTMA中,得到重组质粒pcDNA-SPA,重组质粒经过酶切、测序鉴定其读码框的正确性,在脂质体介导下将重组质粒pcDNA-SPA转染猪肾细胞(PK15),通过RT-PCR证实其在PK15细胞中表达,并在细胞培养液中检测到木聚糖酶活性为7.6I U/mL。
关键词：
黑曲霉 木聚糖酶 xynA基因 真核表达
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