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[期刊] 水产学报
[作者]
苏杭 肖调义 许宝红 刘巧林 吕丽刚 刘益
为研究草鱼补体蛋白5a (complement component 5a,C5a)、补体蛋白5a受体(C5a receptor,C5aR)和凝血因子Ⅱ(blood coagulation factorⅡ，FⅡ)在感染草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)时的蛋白表达和相互作用，针对草鱼C5a和FⅡ蛋白构建了原核表达体系、针对草鱼C5aR蛋白构建C5aR-KLH偶联物，纯化蛋白，免疫日本大耳白兔制备3种蛋白的多克隆抗体。用蛋白质印迹(Western blot)、免疫共沉淀(Co-IP)和拉下(pull down)实验检测3种蛋白表达与互作关系，Western blot结果显示，C5a和C5aR在健康草鱼的肝脏、脾脏、肾脏、头肾、肠、鳃和肌肉中均有蛋白表达，FⅡ在肝脏、脾脏和肠中表达，而在肾脏、头肾、鳃和肌肉中不表达；在感染GCRV的草鱼肝脏组织中C5a、C5aR和FⅡ蛋白均随病程进展呈现上升趋势。Co-IP结果显示，在GCRV处理后，C5a、C5aR和FⅡ蛋白具有相互作用关系。pull down结果显示，C5a pull down共鉴定得到C3、RIG-I等28种候选蛋白，C5aR pull down共鉴定得到转醛醇酶、巨球蛋白等24种候选蛋白。该研究为深入探讨C5a、C5aR和FⅡ互作调控关系以及进一步探索补体和凝血级联系统中3个关联蛋白响应GCRV感染的作用机制奠定了基础。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘伟 郭抗抗 林鸷 盛洁 赵娣 赵紫印 张彦明
【目的】克隆猪Jiv蛋白核心区的2 112bp的基因片段,构建其原核表达载体后进行蛋白的表达和纯化,制备抗猪Jiv蛋白的多克隆抗体。【方法】利用RT-PCR方法,从猪脾脏组织RNA中扩增得到猪Jiv基因,将其克隆到pMD19-T载体并测序,以此为基础构建原核表达载体pET32a-Jiv,转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中,利用IPTG诱导表达,获得大量包涵体形式的猪Jiv融合蛋白。通过镍离子螯合层析柱对表达的目的蛋白进行纯化,对纯化后的包涵体蛋白进行透析复性,以每只新西兰白兔400μg蛋白的初次免疫剂量和500μg蛋白的加强免疫剂量进行免疫,共免疫5次,采集血清,采用间接E...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
余风艳 韩秀杰 沈红霞 张保新 赵凡凡 王晓杜
提取猪日本乙型脑炎病毒(JEV)上海分离株的基因组RNA,反转录合成cDNA,扩增JEV-NS5基因片段,亚克隆到原核表达载体pET-28(a)上,构建重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS5,转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达重组JEV-NS5蛋白,获得分子质量为103 ku的重组蛋白.该蛋白主要以包涵体形式表达,表达量占总菌体蛋白的35%以上,His-band Ni+纯化后,获得高纯度重组蛋白占总蛋白的比例达75%以上.以纯化的蛋白免疫小鼠,制备小鼠抗JEV-NS5抗体,抗体效价达到3×104,并能与病毒感染的样本反应,证明该蛋白具有较好的特异性.
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
陈媛 屈贵蜀 彭尧舜 许丽惠 王全溪
根据FAdV-4 NP株F1蛋白编码框的主要抗原位点,设计一对特异性引物,经PCR扩增、测序,分析表达效率后,进行密码子优化;以合成的新序列作为模板,构建重组表达质粒pET-32a-F1,将质粒转化到BL21中,筛选诱导条件,Western blot鉴定表达产物;将待纯化蛋白依次经过不同浓度的咪唑洗脱,纯化重组蛋白;最后将纯化后的蛋白免疫新西兰黄兔,收集血清并用间接ELISA法测定抗体效价.结果表明,所设计的特异性引物扩增了一条约699 bp的片段.PCR验证和酶切鉴定表明,pET-32a-F1被成功构建,并能够高效表达.重组质粒pET-32a-F1诱导的最佳IPTG浓度为0.3 mmol·L~(-1),最佳诱导时间为5 h,最佳诱导温度为37℃;咪唑洗脱浓度为80 mmol·L~(-1)时,能获得较单一的洗脱蛋白.此外,本试验制备的F1多克隆抗体的效价可达1∶1 024 000.
[期刊] 淡水渔业
[作者]
王艺舟 潘启华 王乾 夏必琳 罗君志 方健 邓羽 廖明聪 陈天圣
实验进行了青鱼(Mylopharyngodon piceus)Dazl基因的原核表达,兔抗青鱼源Dazl多克隆抗体的制备及抗体的特异性验证。首先将青鱼Dazl基因的编码区利用重组表达引物从pCS2-MpDazl质粒中扩增出来,经酶切后连接到pET-28a载体中,构建pET-28a-MpDazl重组表达载体。然后将pET-28a-MpDazl重组质粒转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中,利用异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得分子量为27 kD的Dazl重组蛋白。将纯化的Dazl重组蛋白作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体,抗体的效价和特异性通过ELISA法和Western blot检测。结果:成功构建重组表达载体pET-28a-MpDazl;以0.5 mmol/L IPTG在37℃条件下诱导4 h可获得高效表达的Dazl重组蛋白;制备的兔抗青鱼Dazl多克隆抗体能够特异性识别原核表达Dazl蛋白、青鱼卵巢的内源Dazl蛋白以及细胞中过表达的Dazl蛋白,并证实了青鱼Dazl蛋白在性腺中表达的特异性。
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
袁晓琴 刘梦茜 李春燕 陈仕怡 许丽惠 周五朵 吴异健 王全溪
根据鸡的蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)基因序列进行抗原肽分析,选择含大片段抗原表位区约1 500 bp的一段基因(151 515 bp)设计一对特异性引物后进行RT-PCR扩增,并构建pET-32a(+)-PERK重组质粒,将其转化至BL21(DE3)感受态细胞中.优化诱导表达条件,纯化重组蛋白后免疫兔并制备多克隆抗体.PCR鉴定、酶切鉴定和测序结果表明,pET-32a(+)-PERK重组质粒构建成功.SDS-PAGE电泳鉴定结果表明,重组蛋白在1.0 mmol·L-1IPTG、25℃下诱导9 h时的
[期刊] 水产学报
[作者]
丁炜东 曹哲明 曹丽萍
抗苗勒氏管激素(anti-mullerian hormone,AMH),也称苗勒氏管抑制物质(mullerianin hibiting substance,MIS),为肽类生长因子,属于TGF-β生长和分化因子家族。为研究AMH对奥利亚罗非鱼性腺发育的作用,应用DNAstar软件分析罗非鱼AMH基因的抗原性,选择抗原性较强的22～243氨基酸作为目的片段构建了AMH的原核表达载体并进行融合表达。首先利用RT-PCR方法从性腺中扩增出长约663bp的目的序列AMH基因,克隆至T载体中,经酶切鉴定和序列测定分析确认序列的正确性后将此片段克隆到表达载体pGEX-5x-1中构建重组表达质粒pGEX-A...
[期刊] 水产学报
[作者]
王梓璇 贾钊 邬恺正 朱晓真 王俊亚 冯浩 邹钧
为系统研究草鱼I型干扰素的合成、分泌和免疫功能，实验在大肠杆菌中表达并提纯了草鱼IFNa（CiIFNa）和IFNd（CiIFNd）重组蛋白。将CiIFNa和CiIFNd成熟肽分别克隆到pET-21d或pEHISTEVb表达载体上，并转化到大肠杆菌中；IPTG诱导表达获得CiIFNa和CiIFNd成熟肽的包涵体，经盐酸胍变性、蛋白复性和浓缩后，利用分子筛层析获得了纯度较高的重组蛋白。用重组蛋白免疫小鼠，通过PEG法诱导得到杂交瘤细胞；将稳定分泌抗体的阳性细胞株的细胞悬液注射入小鼠腹腔，制备腹水抗体并进行纯化。本研究纯化了草鱼CiIFNa和CiIFNd各2株抗体，并采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、酶联免疫吸附测定法（ELISA）、蛋白质印迹法（Western blot）和免疫荧光法对其进行了较全面的鉴定。研究结果表明，CiIFNa和CiIFNd单克隆抗体特异性好、效价高，能够特异识别在大肠杆菌和真核细胞中表达的重组蛋白，且不存在CiIFNa和CiIFNd分子间的交叉识别。本研究制备的单克隆抗体为深入研究草鱼干扰素的细胞来源和蛋白表达规律奠定基础。
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
于淼 方健 李玲玉 潘启华 薛亭 邓羽 陈凯 陈天圣
为进一步分析鱼类干细胞多能性转录因子Oct4的功能,将团头鲂(Megalobrama amblycephala)Oct4进行原核表达并制备了兔抗Oct4多克隆抗体。采用RT-PCR方法从团头鲂卵巢中扩增Oct4基因的部分编码片段,插入载体pET32a中构建重组原核表达载体pET32a-MaOct4;将表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导、Ni(2+)亲和柱层析纯化获得分子量约49 ku的可溶性重组蛋白;以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰兔制备抗体,通过ELISA法测定其效价,We
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
上官晓庆 张春霞 赵天永
[目的]将玉米异分支酸合成酶1(ZmICS1)及系统获得抗性缺陷1(ZmSARD1)进行原核表达和纯化,并免疫家兔获得多克隆抗体,为深入研究ZmICS1和ZmSARD1在玉米抵抗病原菌胁迫中的功能奠定基础。[方法]克隆玉米ZmICS1和Zm SARD1基因CDS区,连接到原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌表达菌株Rosettgami2(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达His_(×6)-ZmICS1和His_(×6)-ZmSARD1重组蛋白,以透析纯化后的重组蛋白为抗原免疫家兔,制备多克隆抗体,并进行验证和检测。[结果]成功构建了原核表达载体pET-28aZmICS1和pET-28a-ZmSARD1,于37℃、0.84 mmol/L IPTG在大肠杆菌表达菌株Rosett-gami2(DE3)中诱导出His_(×6)-ZmICS1和His×6-ZmSARD1重组蛋白。纯化蛋白免疫家兔,所得ZmICS1抗体能够检测到3 ng的His_(×6)-ZmICS1,ZmSARD1抗体能检测到低至0.3 ng的His_(×6)-ZmSARD,且分别能特异性地检测玉米B73原生质体过表达的ZmICS1和ZmSARD1蛋白。[结论]成功制备了玉米ZmICS1、ZmSARD1多克隆抗体,可用于玉米内源ZmICS1和ZmSARD1蛋白含量的检测。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
褚文辉 张伟 赵海平 王大涛 李春义
为研究梅花鹿Thymosin beta 10基因(Tβ10)在鹿茸快速生长过程中的作用,利用Gateway技术构建梅花鹿Tβ10基因的原核表达载体—pDEST17-Tβ10并诱导表达,对融合蛋白进行功能检测及多克隆抗体制备。结果表明:1)获得了190bp Tβ10基因开放阅读框序列,并获得重组表达载体pDEST17-Tβ10。2)pDEST17-Tβ10在宿主BL21-SI中诱导表达条件为0.3mol/L NaCL诱导2h,获得产物的最终浓度为0.50mg/mL。3)制备的Tβ10蛋白多克隆抗体血清效价在105之上,该抗体可以特异性结合天然和原核表达的Tβ10蛋白。4)离体检测发现,Tβ10融合蛋白一方面可以促进人脐静脉内皮细胞增殖,另一方面可以抑制鹿茸前成软骨区细胞的增殖。综上所述,本研究获得了具有生物活性的Tβ10融合蛋白,并制备了高度特异性的梅花鹿Tβ10蛋白多克隆抗体,为深入研究Tβ10基因的生物学功能奠定了基础。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
江学斌 马苗鹏 肖淑君 司徒嘉欣 杨军 施巨清 蔡海明 张玲华
根据GenBank中猪SIRT1mRNA序列设计引物,使用杜大长商品猪大脑RNA经RT-PCR扩增得到猪SIRT1基因全长表达序列,通过Ω-PCR将SIRT1蛋白末端抗原表位序列插入载体pET-28a(+),在大肠杆菌中表达并纯化得到45ku大小的蛋白,以其免疫新西兰大白兔并制备出抗体滴度达212的多克隆抗体。结果表明,成功制备出可以特异性识别猪SIRT1蛋白的抗体。
关键词：
猪 SIRT1 PCR 多克隆抗体
[期刊] 中国水产科学
[作者]
孙盛明 戈贤平 傅洪拓 朱健 张世勇 乔慧
应用RACE技术克隆了青虾(Macrobrachium nipponense)的Hc基因全长cDNA序列,并对该基因序列特征进行了分析。青虾Hc基因cDNA全长2 235 bp,包括10 bp的5′末端非翻译区(UTR),2 074 bp的开放阅读框(ORF),151 bp的3′UTR,开放阅读框编码688个氨基酸。蛋白相似度比对显示,青虾血蓝蛋白含有典型的6个保守的铜离子结合位点。系统进化树分析表明,青虾Hc与脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)Hc聚在一起,具有最近的亲缘关系。荧光定量PCR检测显示,Hc基因在青虾不同组织中均有表达,其表达量在肝胰腺中最高;使用荧光定...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
唐秀山 王磊 廖定为 蒋一男 夏春
为了获得鸡CD8α/β蛋白及其多克隆抗体,进一步研究其结构与功能,本实验从三黄鸡cDNA文库中克隆了其CD8α/β胞外区片段,构建了pQE30/ChCD8α/β原核表达系统,并经诱导表达、亲和层析纯化,获得了纯化的重组蛋白(rChCD8α/β),然后用rChCD8α/β分别免疫Balb/c小鼠制备了其多克隆抗体。结果表明:本实验克隆的ChCD8α长483 bp、编码161个氨基酸、可在E.coliJM109中高效表达,蛋白质分子质量为24.0 ku,表达量占菌体蛋白量的25.0%,由该蛋白质所制备的多克隆抗体抗rChCD8α的ELISA效价为1∶1 024 000;另外,克隆的ChCD8β长4...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
朱岩松 王秀华 韩雯 王锐 黄倢
本研究制备了鳗弧菌Vibrio anguillarum、杀鲑气单胞菌Aeromonas salmonicida、副溶血弧菌V.parahaemolyticus、哈维氏弧菌V.harveyi和腐败希瓦氏菌Shewanella putrefaciens5株鲆鲽鱼类病原菌的兔抗血清,建立了5种菌的间接ELISA检测方法,并将该检测方法用于鱼类细菌分离物病原检测。人工感染结果显示,5株菌对大菱鲆的半数致死量(LD50)在102～107CFU/fish;制备的兔抗血清效价分别为1:2048000、1:16000、1:16000、1:1024000、1:128000;交叉反应结果显示,鳗弧菌、副溶血弧菌、...
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