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[期刊] 中国水产科学
[作者]
常藕琴 霍礼霞 罗满林 石存斌 张德峰 潘厚军 任燕
分离纯化草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肾中性粒细胞、鉴定和检测其活性,目的在于为研究中性粒细胞的功能和免疫防御机制提供细胞材料。本研究使用鱼类脏器组织中性粒细胞分离试剂盒和差异贴壁法分离获得草鱼肾中性粒细胞;应用迪夫氏染色、碘化钾-吡啰红G (KI-Py G)染色、电镜技术鉴定细胞形态,使用多功能酶标仪检测经MPA刺激的细胞活性,台盼蓝染色法和CCK-8检测细胞存活率。结果显示,获得的细胞大小均一,细胞核圆形或肾形,胞质有A、B型颗粒,表面有皱褶,具有中性粒细胞的形态特征;细胞纯度达(99.3±0.53)%,细胞活力达(97.70±0.76)%,在体外培养24h内细胞存活率可保持在(89.91±3.56)%;在PMA刺激下检测到细胞表达MPO、ROS、NO和NETs的量显著提高(P<0.05),与刺激时间呈正相关。结果证实,分离的细胞具有很好的活力,具有中性粒细胞的功能特征。本研究成功建立草鱼中性粒细胞的分离方法,细胞具有很好的活力,可为深入研究鱼类中性粒细胞的功能和免疫机制提供基础。
关键词：
草鱼 中性粒细胞 分离 鉴定 活性检测
[期刊] 上海水产大学学报
[作者]
李聃 杨先乐 张书俊 喻文娟 陈昱
红霉素-N-脱甲基酶(ERND)是细胞色素P450 3A(CYP3A)依赖的酶类,可通过测定该酶催化代谢产物甲醛的量来反映其活性,从而评价CYP3A活性的高低。以草鱼肝细胞系(GCL)为模型,红霉素为底物,采用Nash比色法检测ERND产物甲醛含量,Lowry比色法测定细胞蛋白含量,建立鱼类细胞中CYP3A活性的简便检测方法。研究表明,底物以0.4 mmol/L作用60 m in后进行检测较为合适。细胞样品中ERND产物甲醛平均回收率为78.80%±4.37%,平均日内精密度为2.80%±1.40%,平均日间精密度为3.91%±1.45%,通过计算探针酶ERND活性可为鱼类细胞CYP3A活性的...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
罗晓春 李正秋 王金虎 张奇亚
用白细胞分离介质Histoque 10 77将草鱼外周血液中淋巴细胞分离后 ,依据它们对尼龙毛的粘附特性分为粘附性细胞和非粘附性细胞两个类群。分别检测分离前、后的淋巴细胞的细胞表面超微结构、α 醋酸萘酯酶活性及膜表面球蛋白。结果表明 :表面粗糙细胞、α 醋酸萘酯酶阳性细胞和膜表面球蛋白阳性 (SIg+ )细胞在外周血液总淋巴细胞中的比例分别为 47.8%、15 .2 %和 5 3.8% ,在粘附性淋巴细胞中的比例分别为 82 .3%、0 .1%和 76 .2 % ,在非粘附性淋巴细胞中的比例为 18.3%、2 4.2 %和 2 5 .5 %。
[期刊] 水产学报
[作者]
陶会竹 肖宁 赵雨婷 房慧 李槿年
为了建立草鱼肠巨噬细胞的分离培养与鉴定方法,本研究在采用刮除法结合胶原酶IV消化法制备肠黏膜固有层单细胞悬液的基础上,使用鱼类脏器单核细胞分离试剂盒分离肠巨噬细胞,再经差异贴壁法纯化肠巨噬细胞,最后,用含10%胎牛血清和5%草鱼血清的RPMI 1640完全培养液,在28°C、5%CO2条件下原代培养肠巨噬细胞,并通过细胞形态学检查、分子标记检测和功能验证实验加以鉴定。结果显示,每尾鱼(约250 g)肠巨噬细胞的获得量约为3×107个,细胞活率为99.6%,纯度达到95%以上;倒置显微镜观察发现,原代培养4~5 d的贴壁细胞多呈圆形或多边形,体积明显增大,细胞汇合度达到95%;光镜和电镜观察到染色后的贴壁细胞具有巨噬细胞的形态结构特征,贴壁细胞经荧光定量PCR在m RNA水平检测到巨噬细胞特异性标志分子(草鱼巨噬细胞集落刺激因子受体),功能实验证实贴壁细胞具有吞噬功能,脂多糖能够显著提高其呼吸暴发活性。本研究首次成功建立了草鱼肠巨噬细胞的分离培养与鉴定方法,为开展口服疫苗诱导的草鱼肠黏膜免疫应答研究提供细胞模型。
关键词：
草鱼 肠巨噬细胞 分离 原代培养 鉴定
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
童娜 尹晓燕 李大鹏 汤蓉
将草鱼肾细胞(CIK)在28℃条件下培养24h后,分别置于28(对照)、32、36和40℃的条件下暴露2h,测定不同温度处理组的细胞乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、细胞周期的改变、细胞内多泛素化蛋白水平以及caspase-3和bcl-2的表达变化;置于28(对照)、32、36和40℃的条件下暴露12h,测定不同温度处理组的细胞活力。试验结果表明,热应激引起细胞活力显著下降,导致CIK细胞的LDH漏出率显著上升,多泛素化蛋白表达量显著增加,bcl-2的表达量显著下调和caspase-3的表达量显著上调,G0/G1期细胞显著减少。急性热应激可能会引起CIK的细胞膜通透性和蛋白质表达量的变化,从而诱导细...
关键词：
急性热应激 草鱼肾细胞 细胞凋亡
[期刊] 水产学报
[作者]
于灵芝 杨先乐 王翔凌 喻文娟 胡鲲
细胞色素P450s(CYPs)主要参与动物体内药物代谢。水产养殖中不合理的联合用药常会导致治疗失败,这通常与CYP活性的诱导有关。然而,关于鱼类CYP的诱导却知之甚少。为获得有关CYP诱导的信息,实验采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)的方法测定了草鱼肾细胞(CIK)中CYPs的特异性诱导剂对双氟沙星(DIF)的代谢作用及酶动学分析。对照组和β-萘黄酮(BNF)诱导组的酶动学方程分别为1/V=0.1375×1/[S]+0.003和1/V=0.0245×1/[S]+0.0013。DIF与经BNF处理的CIK共孵育后,其代谢量增加了1倍,酶动学参数Clint和Vmax值分别增加了7倍和2倍。BN...
[期刊] 水产学报
[作者]
郭琼林
草鱼淋巴细胞表面扫描电镜结构特征为有孔穴且较为光滑、具短小细锥状突起 ;中华鳖淋巴细胞、胸腺细胞表面扫描电镜结构特征为凹凸不平、较为光滑 ;它们均以表面凹凸不平特征的占大多数。E花环试验的光镜和扫描电镜观察显示 :草鱼淋巴细胞E花环形成不明显 ,而中华鳖淋巴细胞、胸腺细胞的成花率分别为 2 5 %～ 34%和 36 %～ 47% ,能形成花环的淋巴细胞、胸腺细胞以表面结构特征凹凸不平 (类似哺乳动物T淋巴细胞 )的为主。草鱼、中华鳖血液淋巴细胞和中华鳖胸腺细胞与抗人CD2 单克隆抗体交叉反应的免疫组化检测显示中华鳖血液淋巴细胞和胸腺细胞的CD2 阳性率分别为 2 4%和 33%。草鱼血液淋巴细...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
姜代勋 陈武 侯显涛 于同泉 路苹 穆祥
【目的】以猪中性粒细胞为靶细胞,研究白芍制剂对其相关功能(呼吸爆发和弹性蛋白酶释放)及磷酸二酯酶活性的影响。【方法】中性粒细胞分离纯化后,以细胞色素C还原法检测中性粒细胞呼吸爆发,以弹性蛋白酶底物的减少反映弹性蛋白酶的释放量,以HPLC检测底物cAMP的变化反映磷酸二酯酶的活性等。【结果】白芍制剂呈剂量依赖性抑制中性粒细胞的呼吸爆发(P<0.001),3个不同浓度的抑制率分别为33.15%、45.96%和62.22%;对弹性蛋白酶的释放在低浓度时表现抑制作用(P<0.05),抑制率为23.22%,在高浓度时表现促进作用;对中性粒细胞磷酸二酯酶活性具有抑制作用,低、高浓度抑制率分别为13.24%...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
姜代勋 陈武 谷金妮 许剑琴 于同泉 路苹 穆祥
【目的】通过对猪中性粒细胞磷酸二酯酶(PDE)基因表达、活性及特异性抑制剂实验检测,研究其存在的主要PDE亚型及在体外的活性,为探讨PDE在中性粒细胞的分布、活性变化及对cAMP、cGMP调节与中性粒细胞功能关系提供依据。【方法】采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测PDE基因在猪中性粒细胞的表达,以高效液相色谱(HPLC)检测环核苷酸在PDE反应前后的含量变化,计算PDE活性。【结果】在检测的18个PDE亚型中,PDE1B、2A、3A、3B、4A、4B、4C、4D、5A、7A、7B、8A、8B、9A、11A共15个PDEmRNA在猪中性粒细胞表达,特异性抑制剂实验表明PDE4、PDE5分...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
符贵红 杨先乐 喻文娟 胡鲲 章海鑫 黄宣运
采用基因克隆技术获取草鱼(Ctenopharyngodon idellus)细胞色素P450 3A(CYP3A)cDNA序列长1 849 bp,包含完整开放阅读框(open reading frame,ORF)1 542 bp,1个终止密码和含polyA信号3′UTR;ORF编码514个氨基酸,含信号肽(29 aa),2个跨膜螺旋区(23 aa,23 aa),血红素结合域(21 aa)和6个底物识别位点(SRS1-6);与其他脊椎动物CYP3A氨基酸序列相似度达60%～92%。用实时定量PCR和分光光度计法分别研究了草鱼肾细胞系(Ctenopharyngodon idellus kidney ...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
郭欣娅 季策 谢子健 季帆 祖尧 任建峰 张庆华
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是人-兽-鱼共患的致病菌,严重威胁食品安全和人类的健康。为了研究宿主嗜中性粒细胞清除细菌感染的动态变化过程,利用红色荧光蛋白标记的副溶血弧菌Vp57~(RFP)菌株感染受精后48 h(hours post fertilization,hpf)的斑马鱼(Danio rerio)幼鱼耳泡,建立局部感染模型,并以大肠杆菌(Escherichia coli)Ec01菌株为对照,系统比较了副溶血弧菌和大肠杆菌的半数致死剂量(median lethal dose,LD_(50))、存活曲线以及和嗜中性粒细胞相互作用的动态过程,RT-qPCR验证炎症相关基因il1b和il10在感染前后的表达量变化。结果显示副溶血弧菌和大肠杆菌感染斑马鱼幼鱼的LD_(50)分别为7.90×10~8 CFU/mL和1.14×10~(11) CFU/mL,与感染大肠杆菌相比,斑马鱼感染副溶血弧菌后招募嗜中性粒细胞的速度更快,且数量更多。RT-qPCR结果发现斑马鱼感染副溶血弧菌后在相同时间点能够激活更高的il1b和il10基因的表达,引起强烈的炎症反应。基于以上研究,我们建立的副溶血弧菌-斑马鱼幼鱼耳泡局部感染模型,为进一步研究嗜中性粒细胞清除副溶血弧菌感染的动态过程,以及深入揭示天然免疫应答机制提供了依据。
[期刊] 水产学报
[作者]
秦真东 杨敏璇 卢志杰 施斐 李亚男 詹凡玢 万全元 李军 林蠡
为系统研究草鱼血红蛋白对草鱼肾细胞（Ctenopharyngodonidelluskidney CIK）细胞的损伤机制，实验探究了血红蛋白和血红素刺激CIK细胞后细胞的生长情况，结果显示，血红蛋白和血红素明显抑制了CIK细胞的正常生长。其次，检测了血红蛋白和血红素刺激对CIK细胞内铁代谢相关基因的表达情况，结果表明，血红蛋白和血红素的刺激不同程度的上调了铁代谢相关基因的表达。通过检测被血红蛋白和血红素刺激后的CIK细胞其细胞炎症和抗氧化酶相关基因的表达情况，结果表明，血红蛋白和血红素可以通过NF-κB途径激活下游炎症因子的表达，如促炎因子TNF-α，IL-1β和IL-6，抑炎因子IL-10以及趋化因子IL-4和IL-8等，也同时激活了超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）3种抗氧化酶基因的表达水平。为进一步检测血红蛋白对CIK细胞的毒性作用，实验也检测了血红蛋白刺激CIK细胞后，细胞内铁离子和ROS的变化情况，结果显示，血红蛋白的刺激显著增加了细胞内铁离子和ROS的含量。最后，实验检测了CIK细胞受血红蛋白和血红素刺激后，胞凋亡相关基因的表达情况，结果显示，血红蛋白和血红素都在不同程度上显著激活了CIK细胞凋亡相关基因的表达水平。总之，本研究结果表明，高氧化活性的血红蛋白可以激活细胞内铁代谢和炎症因子相关基因的表达，同时增加细胞内铁离子和ROS水平导致CIK细胞凋亡基因的高表达。本研究结果将丰富鱼类血液免疫基础理论，同时也为水产健康养殖提供新的参考。
关键词：
草鱼 血红蛋白 氧化损伤 凋亡
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
徐先栋 付辉云 饶毅 盛银平 王海华 傅义龙 李彩刚 周永灿
从草鱼体内分离到致病菌株Ｊｘｓｋｓ１，该菌株对草鱼的ＬＤ５０值为２．３×１０３ＣＦＵ／ｇ鱼体质量，为强致病菌；经生理生化、１６ｓ ｒ ＤＮＡ和ｇｙｒ Ｂ基因序列测序鉴定为嗜水气单胞菌。ＥｒＩＣ－ＰＣｒ分型结果表明，该菌株为迄今未见报道的类型。选取丝氨酸蛋白酶ＡｈＰ、热稳定性肠毒素Ａｓｔ、气溶素ＡＥｒ Ａ、热不稳定性肠毒素ＡＬｔ、鞭毛基因ＦＬＡ、脂酶ＬＩＰ等６种毒力基因特异性引物对该菌株进行ＰＣｒ检测，结果表明其毒力基因型为ＡＥｒ Ａ～＋、ＡＬｔ～＋、Ａｓｔ～＋、ＡｈＰ～＋、ＬＩＰ～＋、ＦＬＡ～－。选取２８种抗生素进行药敏检测结果表明，该菌株对喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类、氯霉素、第二代和第三．．．
[期刊] 中国水产科学
[作者]
潘连德 邹玉蓉
运用吖啶橙检测法研究中华鳖 (Trionyxsinensis)嗜中性粒细胞吞噬功能。试验测定了中华鳖嗜中性粒细胞对金黄色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus)和大肠杆菌 (Escherichiacoil)的吞噬和杀伤能力。结果发现 ,中华鳖嗜中性粒细胞分别和金黄色葡萄球菌、大肠杆菌温育 30～ 180min ,吞噬百分率分别由 15%增加到 6 5%、由 9%增加到 6 3% ,杀伤百分率由 6 %增加到 6 2 %、由 2 %增加到 6 4 % ,吞噬指数由 0 .56增加到11.92、由 0 .14增加到 10 .77,杀伤指数由 0 .32增加到 0 .95、由 0 .2...
[期刊] 水产学报
[作者]
胡亚芹 薛长湖 谢江碧 姜凤英 林洪
在草鱼红、白色肉分离出的微粒体中，同时存在脂肪的酶氧化和非酶氧化两种体系。酶氧化体系需要ＡＴＰ或ＡＤＰ和Ｆｅ３＋、Ｆｅ２＋等因子的参与。高浓度的ＡＤＰ对脂质氧化有抑制作用。Ｆｅ２＋比Ｆｅ３＋的催化作用强。红、白色肉细胞微粒体脂肪氧化最适ｐＨ值在６．０～７．０之间。高铁血红蛋白和肌红蛋白被过氧化氢激活后，能催化非酶氧化。在过氧化氢与血红素摩尔比为１∶１时，催化效果最佳。
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