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[期刊] 海洋渔业
[作者]
符贵红 杨先乐
根据GenBank中斑马鱼(Danio rerio)和虹鳟(Oncorhynchus mykiss)孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)基因序列设计保守区域简并引物,通过PCR扩增获得草鱼(Ctenopharyngodon idellus)PXR cDNA核苷酸序列片段为509 bp,经推导获取169 aa序列。对草鱼与其它物种PXR氨基酸序列进行同源性比较,用以鉴定其在物种中的进化。应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测草鱼9种组织PXR和细胞色素P450 3A(cytochrome P450 3A,CYP3A)基因mRNA相对含量,结果表明,其表达丰度依次为:...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
符贵红 杨先乐 喻文娟 胡鲲 章海鑫 黄宣运
采用基因克隆技术获取草鱼(Ctenopharyngodon idellus)细胞色素P450 3A(CYP3A)cDNA序列长1 849 bp,包含完整开放阅读框(open reading frame,ORF)1 542 bp,1个终止密码和含polyA信号3′UTR;ORF编码514个氨基酸,含信号肽(29 aa),2个跨膜螺旋区(23 aa,23 aa),血红素结合域(21 aa)和6个底物识别位点(SRS1-6);与其他脊椎动物CYP3A氨基酸序列相似度达60%～92%。用实时定量PCR和分光光度计法分别研究了草鱼肾细胞系(Ctenopharyngodon idellus kidney ...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
梁亚冰 张琪 常嵘 童德文 许信刚
【目的】克隆及真核表达猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)陕西分离株的3a和3b基因,研究表达蛋白在细胞中的分布及其对细胞周期的影响。【方法】利用软件Primer 5.0参照Genbank公布的序列设计两对分别针对TGEV非结构蛋白基因3a和3b的特异性引物。采用RT-PCR方法从TGEV陕西分离株克隆3a和3b基因,再将其与真核表达载体p EGFP-N1连接,构建真核表达质粒p3a-EGFP-N1和p3b-EGFP-N1。利用脂质体转染法将重组质粒转染猪小肠黏膜上皮细胞(intestinal epithelial cells,...
[期刊] 水产学报
[作者]
杨光 秦真东 赵丽娟 詹凡玢 沈海洋 张梦兰 卢志杰 叶成凯 李凤麟 潘淦 林蠡
蜕皮是甲壳动物重要的生理活动,与其蜕皮激素的合成密切相关,细胞色素P450(CYP)302a1是甲壳动物蜕皮激素合成通路中的关键酶之一。本研究克隆了罗氏沼虾CYP302a1基因(Mr-CYP302a1),cDNA全长1 859 bp,开放阅读框(ORF)为1 629 bp,编码543个氨基酸(aa),分子量大小为61.09 ku,等电点为8.42。氨基酸序列分析显示CYP302a1基因的保守结构域含有5个P450基因家族特征保守区域:heme-binding、helix-K、helixC、helix-I及PERF。系统进化分析结果显示Mr-CYP302a1首先与绿虾CYP302a1聚为一支,然后与凡纳滨对虾及三疣梭子蟹等十足目甲壳动物的CYP302a1聚为一支,与甲壳动物的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测表明Mr-CYP302a1在罗氏沼虾的多个组织中均有表达,其中在Y器官中的表达量最高,性腺中次之。同时研究发现,MrCYP302a1基因在罗氏沼虾的蜕皮后期(A期和B期)表达量很低,蜕皮间期(C期)表达量开始上升,在蜕皮前期D1亚期达到峰值。对Mr-CYP302a1进行蛋白表达及多克隆抗体制备,蛋白印迹法(Western blot,WB)检测表明Mr-CYP302a1蛋白在罗氏沼虾Y器官中的表达量最高,在蜕皮过程中的蜕皮前期D1亚期达到峰值。综上所述,该基因在罗氏沼虾的蜕皮过程中扮演着十分重要的角色。
[期刊] 中国内部审计
[作者]
黄邦夏
基于３Ａ标准体系的内部控制审计是指以３Ａ标准进行质量管控，达到充分发挥内部控制审计成效的目的。本文结合中国移动通信集团广东有限公司（以下简称广东移动）３Ａ质量标准体系的内部控制审计实践案例，探讨通过３Ａ标准完善内部控制审计的质量管控体系，对研究如何在内部控制审计资源相对不足的情况下，最大化地做好内部控制审计的质量管控，充分发挥内部审计价值具有一定意义。
关键词：
内部控制审计 3A质量标准体系 质量管控
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
杨光圣 瞿波 傅廷栋
对甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育系宜３Ａ 花药发育过程中的显微结构和超微结构的观察结果表明， 宜３Ａ 雄性败育发生于花粉母细胞阶段， 其主要特点是花粉母细胞不进行减数分裂， 不能形成二分体或四分体； 花粉母细胞原生质体浓缩并逐步收缩， 最后解体； 在相当于正常油菜的单核小孢子阶段， 花粉母细胞壁上形成“类花粉壁”； 同时， 其绒毡层细胞质浓缩， 并逐步解体。
关键词：
甘蓝型油菜 细胞核雄性不育 花药 解剖
[期刊] 水产学报
[作者]
王英英 李凯彬 刘春 王庆 曾伟伟 石存斌 吴淑勤
为了构建剑尾鱼脑细胞系并探讨其细胞色素P4501a(CYP1A)基因的诱导效应,实验通过胰蛋白酶消化法对剑尾鱼脑组织进行体外培养,经连续继代培养,建立了可稳定传代的脑细胞系,命名为SFB。SFB最适培养液为含有15%胎牛血清(FBS)的DMEM/F-12和L-15等比混合培养液,培养条件为27℃,5%CO2。生长特性研究表明,第65代细胞的群体倍增时间为43.048h,显示出旺盛的生长和分裂能力。染色体分析发现,培养细胞的染色体众数为48条,SFB核型公式为2n=2st+46t,臂指数(NF)=48,与剑尾鱼一致。诱导实验表明,SFB在10-8～10-5mol/L的苯并(a)芘诱导下,CYP1...
关键词：
剑尾鱼 脑细胞系 细胞色素P4501A
[期刊] 水产学报
[作者]
朱磊 胡晓 房文红 胡琳琳 李新苍 李国烈 写腊月
根据5种硬骨鱼已知CYP3A序列保守区设计兼并引物,以异育银鲫cDNA为模板扩增得到CYP3A基因片段,根据得到片段序列设计特异引物并利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得全长cDNA。得到异育银鲫CYP3A基因全长为1 769 bp,开放阅读框为1 545个核苷酸,编码514个氨基酸。其预测蛋白质分子量为58.624 ku,理论等电点为6.30。将异育银鲫CYP3A序列理论编码氨基酸序列提交细胞色素P450命名委员会(Cytochrome P450 NomenclatureCommittee)并由其命名为CYP3A136。氨基酸序列分析显示,其与稀有鲫、草鱼、鲦同源性较高,并且具有高度...
[期刊] 水产学报
[作者]
林茂 杨先乐 纪荣兴
为了建立以CYP1A cDNA为探针的水环境毒理学细胞模型,以β-萘黄酮(BNF)作为诱导剂,通过半定量PCR技术研究CYP1A在草鱼不同细胞系及其对应组织中的诱导表达情况。在半定量PCR反应参数研究中,对关键的退火温度和循环次数进行了优化,结果显示退火温度为57℃,循环次数为30次较为合适,该条件下Gauss迹量的CYP1A/ACT比值能更准确的反映CYP1A的表达水平。对照组和诱导组草鱼细胞中ACT和CYP1A cDNA扩增结果表明,细胞中CYP1A的基础表达量较低,而BNF诱导使GCL、CIK和CO细胞中CYP1A的表达水平得到显著的提高。GCL、CIK和CO细胞三者之间诱导后CYP1A...
关键词：
草鱼 细胞 CYP1A cDNA 诱导
[期刊] 淡水渔业
[作者]
李思 刘晓宇
为探究不同剂量的有机磷农药辛硫磷在24、48、72和96 h染毒后对鲫(Carassius auratus gibebio)肝微粒体中CYP3A酶活性、mRNA及蛋白表达的影响,采用半静态染毒法,设置辛硫磷空白对照组低、中、高浓度组(0.082 5、0.165、0.330 mg/L),以红霉素-N-脱甲基酶(ERND)活性反映CYP3A酶活性,最后采用实时荧光定量PCR和Western blot法分别测定CYP3A-mRNA及蛋白的表达量。结果显示:辛硫磷能抑制CYP3A的酶活性并且下调CYP3A-mRNA的表达,72 h和96 h后,各浓度组中的mRNA的表达量相较对照组降低了50%以上。辛硫磷染毒后的CYP3A蛋白的表达量在各时间段中都呈现显著的剂量效应关系,在低、中浓度组间存在时间效应关系。结果表明,辛硫磷能作为一种抑制剂降低鲫肝脏中CYP3A酶活性、mRNA及蛋白表达量,其对蛋白表达抑制的剂量效应和时间效应影响更显著。
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
邬恺正 王俊亚 范丁月 李仕然 徐兢 王梓璇 邹钧
芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AhR）作为配体激活的转录因子在T细胞、单核细胞和树突状细胞（dendritic cells，DCs）的功能调节方面扮演重要角色，炎症相关细胞因子的产生与AhR信号通路也密切相关。为阐明草鱼（Ctenopharyngodon idella）ahr1a基因在炎症发生过程中的作用，本研究克隆获得了草鱼ahr1a基因cDNA序列，其编码区共2 544 bp，编码847个氨基酸。结构域预测发现草鱼AhR1a蛋白含有螺旋-环-螺旋（helix-loop-helix，HLH）超家族中bHLH-PAS（period-aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator single minded，Pre-Arnt-Sim）亚家族的典型结构域。氨基酸序列分析表明，草鱼AhR1a与黄河鲤（Cyprinus carpio）的相似性与一致性最高。系统进化树结果发现草鱼ahr1a基因与金鱼（Carassius auratus）、黄河鲤和斑马鱼的（Danio rerio）同源基因聚在一支。草鱼ahr1a基因在多个组织（肠、鳃、肾、肝、头肾、胸腺、脾、皮肤、脑）中均有表达，其中肠和鳃表达量最高。草鱼感染柱状黄杆菌（Flavobacterium columnare）后，ahr1a在脾（24、48 h）和头肾（12、24 h）中的表达水平显著下降。腹腔注射草鱼呼肠孤病毒（Reovirus of grass carp，GCRV）后，脾和头肾中ahr1a表达水平无明显变化。体外实验结果显示，脂多糖（lipopolysaccride，LPS）和IL-1β重组蛋白下调草鱼原代头肾白细胞中ahr1a的表达。综上所述，本研究克隆分析了草鱼ahr1a基因并初步证实其参与炎症反应的调控。
关键词：
草鱼 芳香烃受体 基因克隆 免疫反应
[期刊] 西南农业学报
[作者]
薛正楷 魏弘
为了克隆巴马小型猪细胞色素P4503A46基因,建立P4503A46稳定表达肝癌细胞株(Hep G2-P4503A46),并探究其药物代谢活性,通过RT-PCR从肝组织中钓取基因P4503A46,将基因与真核表达载体pc DNA3.1连接并转染Hep G2细胞,经G418筛选10代,获得稳定表达重组细胞株Hep G2-P4503A46,以P4503A特异性代谢底物硝苯地平(NF)探针药物,将探针药物与重组细胞在优化的细胞浓度、药物浓度、孵育时间等条件下进行体外孵育,通过高效液相色谱仪检测其药物代谢(抑制)动力学参数,并将对照组进行比较分析。结果表明,本研究成功从人Bama小型猪肝组织克隆了P4...
[期刊] 华北农学报
[作者]
张冬杰 刘娣
采用半定量RT-PCR技术检测分析了在体外培养的猪成纤维细胞内分别添加终浓度为0.5,5,10,30μg/μL的维生素A后,分别作用12,24,48和72 h后,视黄酸受体γ基因(RARγ)的表达变化情况。结果表明,不同浓度组间差异不显著,但是分别作用24和72 h后,会出现抑制RARγ基因表达的现象。
[期刊] 水产学报
[作者]
曹丽萍 贾睿 杜金梁 丁炜东 殷国俊
四氯化碳(CCl4)作为一种经典的肝脏毒物,被广泛应用于哺乳动物的肝损伤模型构建及保肝药物筛选。低、中、高浓度的CCl4-橄榄油溶液(6.25%、12.50%和15.00%,0.01 mL/g)腹腔注射建鲤72 h后,采用单细胞凝胶电泳和肝组织病理切片技术,测定血清中肝损伤生化酶来考察CCl4对肝细胞DNA的毒性作用;同时采用实时荧光定量PCR法测定肝组织中CYP3A表达量的变化。结果显示,6.25%CCl4作用建鲤72 h后肝组织切片检查没有发生明显的改变,对血清中酶学指标无显著影响,CYP3A的mRNA表达量与空白对照组相比也没有显著变化,而彗星实验结果显示该浓度的CCl4作用肝细胞后,尾...
关键词：
建鲤 四氯化碳 CYP3A 彗星实验
[期刊] 中国农业科学
[作者]
米焱 张伶俐 李海军 杜晨光 曹贵方
【目的】探讨Ghrelin和GHS-R1a mRNA在牛卵母细胞体外成熟过程中的表达及二者表达与FSH之间的关系。【方法】利用实时定量RT-PCR技术检测体外成熟进程中牛卵母细胞Ghrelin和GHS-R1a mRNA水平表达变化,观察不同浓度FSH对Ghrelin和GHS-R1a mRNA表达的作用以及FSH与FSH受体抑制剂的组合对Ghrelin和GHS-R1a基因表达的影响。【结果】实时定量RT-PCR结果揭示牛卵母细胞Ghrelin和GHS-R1a mRNA的相对表达量随着成熟过程的延长而呈现一定变化规律,即Ghrelin和GHS-R1a mRNA在卵母细胞体外成熟过程中从8 h开始显...
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