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[期刊] 水产学报
[作者]
周勇 曾令兵 范玉顶 徐进 马杰 罗晓松 肖艺
利用RT-PCR技术扩增出草鱼呼肠孤病毒(GCRV)VP6蛋白编码区长度为1 250 bp的片段,克隆到pEGFP-N1载体上,构建重组质粒pEGFP-N1-VP6。经PCR鉴定确认正确后,以10倍梯度稀释pEGFP-N1-VP6重组质粒,作为标准模板进行TaqMan real-time PCR扩增,制作标准曲线,建立了草鱼呼肠孤病毒的荧光定量PCR检测方法。检测结果显示,标准曲线的相关系数(R2)达到0.998 09,斜率为-3.373;对初始模板定量检测的范围为1×101～1×106copies/μL;特异性试验结果表明,该方法可特异性地检测出草鱼呼肠孤病毒,而对鲤春病毒血症病毒(SVCV...
[期刊] 水产学报
[作者]
殷亮 王庆 曾伟伟 李永刚 王英英 刘春 梁红茹 石存斌 吴淑勤
为了建立和应用可检测基因Ⅰ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的荧光定量检测方法,实验根据基因Ⅰ型GCRV的S6保守序列,分别设计扩增目的条带661 bp普通引物(P1、P2)、扩增目的条带159 bp荧光定量引物(F1、F2)和一条探针;同时构建含有目的片段的PVAX1-S6作为标准质粒,10倍梯度稀释构建质粒拷贝数与Ct值的标准曲线(Y=-3.389X+38.076)。结果表明,此方法在3.9×107~3.9×101拷贝/μL之间相关性较好,R2为0.992,最小检测量为4拷贝/μL;且与基因Ⅱ型、Ⅲ型GCRV以及其他病原核酸无交叉反应。运用该方法检测16份草鱼出血病疑似样品,阳性结果为4份;而普...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
曾伟伟 王庆 王英英 张乐生 刘宝芹 石存斌 吴淑勤
针对草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)各类型毒株的保守区域分别设计3对引物,优化反应条件和体系,建立了草鱼呼肠孤病毒三重RT-PCR检测方法,通过PCR扩增分别获得大小约为530 bp、297 bp和196 bp的DNA片段。进一步分析表明,该检测方法具有良好的敏感性、特异性和稳定性,可以检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型核酸最低量分别约为260、190与230拷贝的病毒量,且某一类型的引物只能检测到同一类型的GCRV。用建立的多重RT-PCR方法对2008—2011年采集自江西、广东、湖北、浙江、重庆、四川、福建等地的草鱼(Ctenopharyngodonidellus)主养区...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
刘宝芹 曾伟伟 王庆 张乐生 王英英 石存斌 吴淑勤
草鱼出血病是危害中国淡水养殖最为重要的病害之一,其病原为草鱼呼肠孤病毒(grass carp hemorrhagevirus,GCRV),其中,HZ08株是当前引起草鱼出血病的主要流行毒株。为建立一种快速、灵敏、特异的草鱼呼肠孤病毒主要流行株检测方法,本研究利用草鱼呼肠孤病毒HZ08株S7基因保守区,设计了一对能特异性扩增154 bp片段的引物和TaqMan探针,用含有S7基因全长的重组质粒PAVX1-S7作为标准品,构建质粒拷贝数与CT值的标准曲线,并对该方法的特异性、可重复性、敏感度进行评价。结果显示:标准曲线在6.0×1010～6.0拷贝数之间有很好的线性关系(r=0.999);实时荧光...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
范玉顶 马杰 周勇 江南 刘文枝 曾令兵
根据Gen Bank登录的草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)不同基因型毒株编码VP2蛋白的S2节段保守序列,设计1对简并引物,通过优化反应条件及灵敏度和特异性评价,建立了一种能同时检测三种基因型GCRV的通用RT-PCR检测方法。结果显示:该方法在三种基因型GCRV中均扩增出大小约590 bp的特异性条带;灵敏度试验结果显示,该方法对于I、Ⅱ、Ⅲ型GCRV的检测限分别为380、250和380拷贝/μL。该方法可特异性地检测目前已知的三种基因型GCRV,而在大鲵虹彩病毒(GSIV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cy HV-2)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)和传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)中无扩增产物。利用该方法检测49份草鱼出血病疑似样品,结果显示均为GCRV阳性,其中I型阳性率为8. 2%,Ⅱ型阳性率为85. 7%,Ⅲ型阳性率为2%,I、Ⅱ型混合感染阳性率为4. 1%,其他类型的混合感染未检测到。结果表明,本研究建立的针对I、Ⅱ和Ⅲ型GCRV的RT-PCR检测方法具有通用性好、省时高效的突出特点,同时还兼具较高的灵敏度和特异性。
[期刊] 淡水渔业
[作者]
曾伟伟 王英英 尹纪元 汤亚方 李莹莹 王庆 高彩霞 任燕 刘春 石存斌
为了解决Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus genotypeⅡ,GCRV-Ⅱ)含量和滴度测定方法的选择问题,本研究利用荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)、免疫过氧化物酶单层细胞试验(immunoperoxidase monolayer assay,IPMA)和间接免疫荧光试验(indirect fluorescent assay,IFA)三种方法来对GCRV-Ⅱ进行检测和含量测定,从特异性、敏感性、可靠性和检测结果的相关性来比较这三种方法对于GCRV-Ⅱ定量检测的差异。结果显示:qPCR、IPMA和IFA三种方法检测GCRV-Ⅱ的最低限分别为8.6、86和86拷贝/μL,qPCR的检测灵敏度比IPMA和IFA高一个数量级;特异性分析表明,qPCR、IPMA和IFA三种方法均只能检测出GCRV-Ⅱ型分离株,而其它病毒和未感染病毒的阴性对照细胞均为检测阴性,表明这三种方法均具有较高的特异性;3种方法分别检测60份已知临床样品,qPCR、IPMA和IFA的诊断敏感性和特异性分别为96.7%(29/30)和100%(30/30)、100%(30/30)和93.3%(28/30)及100%(30/30)和100%(30/30);三种方法对于GCRV-Ⅱ的定量检测结果中病毒拷贝数和病毒滴度之间具有较好的相关性,其拟合曲线分别为:Y(IPMA,TCID_(50)/mL)=23.629X-536 174(qPCR,拷贝/mL)(R~2=0.996)、Y(IFA,TCID_(50)/mL)=20.318X-575 062(qPCR,拷贝/mL)(R~2=0.995)和Y(IPMA,TCID_(50)/mL)=1.161X-1 176(IFA,TCID_(50)/mL)(R~2=0.999)。结果表明,GCRV-Ⅱ病毒滴度的测定,除了用IPMA和IFA外,也可以采用qPCR方法通过测定病毒的核酸拷贝数来测算其病毒滴度。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
张金凤 曾令兵 张辉 周勇 肖艺 苏岚 高正勇
根据草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)衣壳蛋白VP6编码基因的序列设计特异性引物,以病毒全基因组RNA为模板,通过对反应条件进行优化,建立了GCRV的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。检测结果表明,本方法可在63℃下1 h内实现靶片段的大量扩增,扩增产物经凝胶电泳呈现梯型条带,反应体系中添加SYBR Green I荧光染料后,绿色阳性结果明显区别于橙色阴性结果。该检测体系针对草鱼呼肠孤病毒的检测灵敏度高,其最低检测限为33 pg,与常规RT-PCR方法相比较,灵敏度高10倍,且与斑点叉尾鮰呼肠孤病毒(CCRV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、锦鲤疱...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
王土 许丹 吕利群
从草鱼(Ctenopharyngodon idellus)出血病疑似病料提取物感染的草鱼肾细胞(CIK)中提取病毒基因组dsRNA,电泳显示出水生呼肠孤病毒基因组的典型特征。应用简化的FLAC(full-length amplification of cDNA)技术扩增得到病毒的4个全长基因组片段进行测序分析。核酸序列BLAST分析表明:其中3个基因组片段与GCRV-873第5、9、10片段高度同源,另外1个基因组片段与GCRV-HZ08第11片段高度同源;因此推测病料中同时存在两种不同的病毒核酸,但也可能存在一种杂合病毒。根据已发表的GCRV-HZ08第5、9、10片段设计了3对引物对分离的...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
张迪 杨铿 苏友禄 冯娟 郭志勋
青蟹呼肠孤病毒(mud crab reovirus,MCRV)和青蟹双顺反子病毒-1(mud crab dicistrovirus-1,MCDV-1)是从近年发生大规模死亡的养殖拟穴青蟹体内分离的、对青蟹具有致病性的两种病毒。它们常常同时存在,给青蟹养殖业带来巨大经济损失。在疾病的防治中,快速高效的病毒检测方法对疾病诊断以及及时采取有效地防治措施具有重要的意义。本研究利用MCRV和MCDV-1基因保守区设计4对引物,建立了可同时检测这两种病毒的双重巢式PCR(duplex-nested PCR)检测方法。研究发现该方法对两种病毒的检测限都可以达到10个拷贝,并与鲍肌肉萎缩病毒(AbSV)、虾类...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
张旻 王娜 景宏丽 吴绍强
为提高草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)的检测效率,根据GCRV-873株VP5基因片段,设计了2对特异性引物,建立了检测GCRV-873株的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。结果显示:该方法使用25μL反应体系,经优化后的反应温度为65℃,反应时间1 h,检测限可达10个拷贝数的病毒核酸,比传统的RT-PCR方法要高10倍。且不与鲤春病毒、传染性造血器官坏死病病毒、传染性胰脏坏死病毒和病毒性出血性败血症病毒RNA产生交叉反应。在反应体系中加入染料后,反应结果肉眼直接可见,是一种特异性强、方便快捷的检测方法,适合GCRV-873株的现场初筛和核酸检测工作。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
储旭 房文红 刘志强 周俊芳 李信书 李新苍
青蟹呼肠孤病毒 (mud crab reovirus，MCRV)是养殖拟穴青蟹(Scylla paramamosain)致死率最高的病原之一，青蟹种蟹及其幼体携带该病原对青蟹养殖产业高质量发展造成了重大威胁。为从源头切断该病原的感染和传播，本研究研发了一种筛选无MCRV种蟹的荧光定量检测方法。为最大限度提高检测灵敏性，本研究首先分析了MCRV在感染青蟹主要组织中的含量，发现血淋巴中病毒载量最高；随后分析该病毒的13个预测基因在血淋巴中的表达水平，发现病毒VP11基因相对表达量最高；最后基于VP11基因序列保守区设计特异引物，建立了一种SYBR Green qRT-PCR (quantitative reverse-transcription PCR)检测方法，该方法可精确检测病毒下限为50 copies/反应。考虑到该检测方法还具有组织和靶标基因选择优势，其灵敏性显著高于早期报道的其他检测方法。使用该方法对含有5种常见甲壳动物病原的样品进行检测，均无特异性扩增。抽取微量血淋巴(大约50 μL/只)提取RNA，随后使用该检测方法对22只种蟹和20只市售青蟹进行MCRV检测，阳性率分别54.55%和85.00%。此外，利用该方法进一步分析了MCRV在较低温度下(21℃)在青蟹体内增殖情况，发现病毒感染早期呈指数方式增殖，随后进入平台期，实验周期内无青蟹死亡。总之，本研究建立了一种灵敏性高、实用性强的MCRV检测方法，其既可用于微创条件下无MCRV种蟹筛选，也能满足病原感染相关研究的需要。
[期刊] 水产学报
[作者]
周勇 曾令兵 张辉 范玉顶 徐进
针对鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)DNA解旋酶基因编码区序列设计特异性引物,利用PCR技术扩增出长度为1 446 bp的基因编码区片段,克隆到pMD19T载体上,构建重组质粒。经PCR鉴定与测序分析确认正确后,以10倍梯度稀释重组质粒,作为标准模板进行TaqMan real-time PCR扩增,制作标准曲线,建立了鲤疱疹病毒Ⅱ型的荧光定量PCR检测方法。检测结果显示,标准曲线的相关系数(R2)达到0.999 1,斜率为-3.412;对初始模板定量检测的范围为1×101～1×107copies/μL;特异性试验结果表明,该方法可特异性地检测出鲤疱疹...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
朱娜 陈国强 张敬友 范红结
根据GenBank发表的猴痘病毒(AF380138)F3L基因全序列,设计并合成了引物和TaqMan、MGB探针,建立了F3L基因的荧光定量PCR检测方法。应用该方法可从人工合成的猴痘病毒F3L基因片段(48 048～48 509 bp)扩增典型的"S"型曲线,25μL反应体系检测灵敏度可达6.8拷贝,但不能从鸡痘、山羊痘等病毒中扩增出相应的扩增曲线。结论:本方法可快速、敏感、特异地检测猴痘病毒。
关键词：
猴痘病毒 荧光定量PCR 检测
[期刊] 水产学报
[作者]
李亚男 刘春 林华剑 秦真东 林蠡
为了进一步丰富蛙虹彩病毒检测方法，实验针对蛙病毒3型（frog virus 3，FV3）核衣壳蛋白（major capsid protein，MCP）基因保守区设计一对特异性引物，并选取另外2种蛙病毒PCR检测方法进行对比实验，通过反应体系的优化、反应特异性和敏感性实验，建立了一种针对FV3的PCR检测方法。结果显示，该方法最低检测限可达1.2 个拷贝数的病毒粒子，与神经坏死病毒、虾血细胞虹彩病毒、大口黑鲈虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒、鲤浮肿病毒、传染性脾肾坏死病毒、加州鲈弹状病毒等常见水产动物致病毒株无交叉反应。临床样品检测表明，该方法所获得的检测结果与另外2种方法一致，结果可靠。本研究所建立的FV3 PCR检测方法，具有简便、快速、敏感度好、特异性高、低成本等特点，可用于FV3 蛙病毒的快速诊断和分子流行病学调研。
关键词：
蛙病毒 虹彩病毒 FV3 PCR
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
王庆 曾伟伟 刘春 马冬梅 石存斌 吴淑勤
为同时检测患病大口黑鲈中不同属虹彩病毒感染和带毒情况,针对蛙病毒属和肿大细胞病毒属大口黑鲈虹彩病毒主衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因的序列,分别设计1对特异性引物Rana-mcp F/R和Mega-mcp F/R,扩增产物片段大小分别为475 bp和262 bp。通过PCR反应体系的优化、反应的特异性和灵敏度试验,建立一种可以同时检测大口黑鲈蛙病毒属和肿大细胞病毒属虹彩病毒感染的双重PCR检测方法,最低DNA检测量分别为6.5 pg和14.5 pg。用此方法,对临床获得的15个大口黑鲈样品进行双重PCR检测和序列测定,获得5个蛙病毒属和1个肿大细胞病毒属虹彩病毒...
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