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[期刊] 中国水产科学
[作者]
张超 王庆 石存斌 曾伟伟 刘永奎 江海明 吴淑勤
从浙江省湖州地区采集发病草鱼(Ctenopharyngodon idellus)样本中,取症状明显病料的肝、脾、肾组织,经过滤除菌处理后接种草鱼肾脏细胞(CIK)。盲传8代,CIK细胞未出现明显细胞病变,但感染细胞固定后经电镜观察发现,细胞质内有大量病毒聚集,病毒无囊膜,近球形,直径约70nm,形态与已报道的草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)相似。将病毒提纯后分别经DNA酶、RNA酶和绿豆核酸酶消化,证实为双链RNA(dsRNA)病毒。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示,病毒基因组由11个dsRNA组成,呈现水生呼肠孤病毒基因组典型特...
关键词：
草鱼呼肠孤病毒 病毒分离 病毒鉴定
[期刊] 中国水产科学
[作者]
刘宝芹 曾伟伟 王庆 张乐生 王英英 石存斌 吴淑勤
草鱼出血病是危害中国淡水养殖最为重要的病害之一,其病原为草鱼呼肠孤病毒(grass carp hemorrhagevirus,GCRV),其中,HZ08株是当前引起草鱼出血病的主要流行毒株。为建立一种快速、灵敏、特异的草鱼呼肠孤病毒主要流行株检测方法,本研究利用草鱼呼肠孤病毒HZ08株S7基因保守区,设计了一对能特异性扩增154 bp片段的引物和TaqMan探针,用含有S7基因全长的重组质粒PAVX1-S7作为标准品,构建质粒拷贝数与CT值的标准曲线,并对该方法的特异性、可重复性、敏感度进行评价。结果显示:标准曲线在6.0×1010～6.0拷贝数之间有很好的线性关系(r=0.999);实时荧光...
[期刊] 水产学报
[作者]
曾伟伟 王庆 王英英 石存斌 吴淑勤
为了建立针对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)流行株的血清学检测方法,实验构建了能高效表达GCRV HZ08株主要衣壳蛋白VP4的重组表达载体pET32a-S6,利用纯化的VP4重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,经过克隆和筛选,获得3株能稳定分泌抗VP4重组蛋白单克隆抗体(monoclonal antibody,MAb)的杂交瘤细胞,分别命名为2C2、2F3和5E5。抗体经亚型鉴定均为IgG1,轻链为κ链;间接ELISA试验证明,3株杂交瘤细胞分泌的MAb可特异性识别GCRV-HZ08,与GSRV,ISKNV,IHNV均无交叉反应。选择2C2作为腹水生产细胞株,免疫...
关键词：
草鱼呼肠孤病毒 VP4蛋白 单克隆抗体
[期刊] 水产学报
[作者]
李永刚 曾伟伟 王庆 殷亮 王英英 梁红茹 刘春 石存斌 吴淑勤
为研究草鱼呼肠孤病毒(GCRV)HZ08株S10基因节段编码蛋白的可能功能,采用PCR方法扩增草鱼呼肠孤病毒HZ08株S10基因节段,并把该基因节段克隆至表达载体pET-32a(+),获得的重组表达载体pET-32a-S10转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE分析鉴定后,再通过变性、过Ni柱纯化、透析复性纯化获得目的蛋白。然后用纯化的重组蛋白免疫昆明小白鼠,制得多克隆抗体,用间接ELISA方法测定抗体效价,用Western blot和IFA(间接免疫荧光试验)鉴定抗体特异性。结果表明,SDS-PAGE分析表达的重组蛋白约为53 ku,大小与预期...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
郝贵杰 沈锦玉 潘晓艺 徐洋 姚嘉赟 尹文林
2008年6月从湖州某患病草鱼池塘采集草鱼出血病疑似病样,将除菌过滤后的患病鱼肝、脾、肾组织滤液,注射健康的8~10 cm的草鱼鱼种。5d后草鱼开始发病,且症状与原发病症状一样,死亡率为57%,对照组未有死亡。将无菌处理的病样滤液接种草鱼肾细胞(CIK),连续接5代均出现明显的细胞病变(CPE),并与草鱼呼肠孤病毒参考株所产生的CPE一致。该株病毒的TCID50为10-8/0.1ml。内脏组织经超薄切片,电子显微镜观察,发现组织内有大量的病毒颗粒,大小均一,近似球形,直径约70~75 nm。理化鉴定表明,氯仿、乙醚处理组病毒的感染力和对照组相比并没有多大变化,说明该株病毒对氯仿和乙醚有一定的抗...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
刘永奎 王庆 曾伟伟 石存斌 张超 陈道印 吴淑勤
收集江西南昌地区患典型草鱼出血病的病鱼组织,进行超薄切片电镜观察,结果显示,在脾、肾样品中发现大量病毒颗粒,病毒无囊膜,近球形,直径约70 nm,形态与已报道的草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)相似。取病鱼肌肉、内脏研磨,组织液经离心、过滤除菌后进行鱼体人工感染试验和细胞感染实验,结果发现,人工感染试验鱼出现死亡,且具有典型出血症状;组织滤液感染草鱼肾细胞系(CIK)细胞后,盲传6代未观察到典型细胞病变效应,但感染细胞固定后经超薄切片电镜观察,细胞质内有大量病毒存在,与病鱼组织切片观察到的病毒形态一致。SDS-PAGE结果进一步揭示,新分离病毒株(暂命名JX-0...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
徐洋 郝贵杰 沈锦玉 郑善坚 潘晓艺 姚嘉赟 尹文林
对从江西省南昌县莲塘镇的患病草鱼鱼种池塘采集到草鱼出血病疑似病样材料分离出的两株病毒株进行了鉴定。结果显示:用除菌过滤后的患病鱼肝脏、脾脏、肾脏组织浆滤液腹腔注射感染8～10 cm健康草鱼鱼种,5 d后试验鱼发病,可复制出自然发病症状,死亡率达50%以上,对照组未有死亡。用病样滤液接种草鱼肾细胞系(CIK),可产生细胞病变效应(CPE),病毒的TCID50分别为10-8.3/0.1 mL和10-8.0/0.1 mL。理化特性研究结果显示:氯仿、乙醚处理组病毒的感染力和对照组相比变化不显著。病毒基因组RT-PCR反应可扩增出目的片段,序列测定与分析结果表明,其与GenBank中GCRV(登录号为...
[期刊] 水产学报
[作者]
高彩霞 曾伟伟 汤亚方 王英英 王庆 周文礼 吴杰兴 刘世旭 尹纪元 李莹莹
为研究Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)不同分离株毒力强弱及生物学特性的差异,该研究从患病和健康草鱼体内分离到Ⅱ型GCRV各一株,分别命名为ZH180804和CQ180701,并从细胞培养特性、致病性、基因组带型、基因序列差异、遗传进化关系等方面进行比较分析。结果显示,ZH180804对草鱼和稀有鲫的致死率分别为80%和100%, CQ180701对草鱼和稀有鲫的致死率分别为0和10%,初步表明ZH180804为强毒株,CQ180701为弱毒株,且弱毒株感染过的草鱼对强毒株的攻击感染具有较好的免疫保护;2株分离株在草鱼鳔细胞(GSB)、稀有鲫卵细胞(GRE)及稀有鲫尾鳍细胞(GRF)中均能增殖但不产生致细胞病变效应(CPE),且ZH180804株的增殖量是CQ180701株的1 000倍以上;十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示,2株分离株基因组带型相似,但S7、S8、S9、S10与S11节段的分布存在一定的差异;2株病毒的S7与S11节段的基因序列同源性分别为98%和99%。基于S7与S11节段编码的氨基酸序列构建的遗传进化树显示,2株分离株聚在同一个分支上,具有较近的亲缘关系。研究表明,从患病和健康的草鱼中分离的2株Ⅱ型GCRV有较多共性,但其复制能力、致病性等方面存在较大差异。
[期刊] 水产学报
[作者]
郜婷 吴斯宇 高彩霞 夏苏东 尹纪元 王英英 李莹莹 石存斌 王庆
为研究II型草鱼呼肠孤病毒（GCRV）病毒样颗粒（VLPs）疫苗，实验利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统（BEVS）将具有免疫原性的GCRV-VP3/VP4/VP35蛋白进行GCRV-VLPs的组装。试验将编码VP35蛋白的GCRV-s11基因克隆入杆状病毒载体pFastBacHTA~(TM)，然后将鉴定正确的重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞，筛选得到重组穿梭质粒Bacmid-VP35。将穿梭质粒Bacmid-VP35以及实验室前期构建的重组穿梭质粒Bacmid-VP3、Bacmid-VP4分别转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒pFHB-VP35、pFHB-VP3以及pFHB-VP4。利用Bac-PAK快速滴定试剂盒测定重组杆状病毒滴度，并通过间接免疫荧光（IFA）和蛋白质印迹法（Western blot）鉴定重组蛋白的表达情况。结果显示，实验获得了较高滴度的重组杆状病毒，并且重组蛋白在杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中正确表达。将成功表达蛋白的重组杆状病毒pFHB-VP35、pFHB-VP3以及pFHB-VP4共感染Sf9细胞组装GCRV-VLPs，通过透射电镜（EM）观察VLPs的组装情况。结果显示，GCRV-II的3个蛋白在Sf9昆虫细胞中可以完成自我组装，形成与天然病毒结构形似的VLPs，直径大小为65-72 nm。本实验结果为进一步研制安全、高效的GCRV-VLPs疫苗奠定基础。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
王杭军 叶星 田园园 张莉莉 瞿兰 张蕊
根据草鱼呼肠孤病毒广东株GCRV-GD108编码VP5的M5基因的cDNA序列,分别设计合成带特定酶切位点的特异引物,进行PCR扩增;通过酶切与连接,构建2种重组表达载体pET30c-M5和pColdⅡ-M5,分别转化于大肠杆菌并进行诱导表达;对培养基、诱导时间、诱导剂浓度和温度等条件进行优化,确定最适表达体系。通过SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定。结果显示,所构建的2种VP5蛋白原核表达载体,均在大肠杆菌中成功表达了分子质量大小(约80ku)与预期相符的重组蛋白,表达产物主要存在于包涵体中。诱导表达后的菌体经离心、洗涤与超声破碎,离心收集包涵体。包涵体通过变性、透...
[期刊] 水产学报
[作者]
喻飞 王浩 宗乾坤 张娅楠 刘海云 陈百朋 吕利群
为研究Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒外纤维蛋白ＶＰ５６与宿主蛋白的相互作用，实验采用酵母双杂交Ｇａｌ４系统鉴定与ＶＰ５６相互作用的草鱼蛋白。首先利用ＲＴ－ＰＣＲ技术从Ⅱ型ＧＣＲＶ感染的草鱼肾细胞中扩增目的基因ＶＰ５６，构建Ｐ ＧＢＫＴ７－ＶＰ５６诱饵表达载体；在酵母菌株中检测其自激活性后，以ＶＰ５６为诱饵在草鱼酵母双杂交文库中筛选阳性菌株，并对阳性克隆的序列进行分析。实验也克隆了草鱼ＪａＭ－ａ（ＧＣ ＪａＭ－ａ）基因，并构建Ｐ ＧａＤＴ７－ＧＣ ＪａＭ－ａ载体，在酵母中研究草鱼ＧＣ ＪａＭ－ａ与病毒蛋白ＶＰ５６相互作用的可能性。研究表明构建的诱饵质粒Ｐ ＧＢＫＴ７－ＶＰ５６无自激活作用，可以应用于酵母双杂．．．
[期刊] 水产学报
[作者]
周勇 曾令兵 范玉顶 徐进 马杰 罗晓松 肖艺
利用RT-PCR技术扩增出草鱼呼肠孤病毒(GCRV)VP6蛋白编码区长度为1 250 bp的片段,克隆到pEGFP-N1载体上,构建重组质粒pEGFP-N1-VP6。经PCR鉴定确认正确后,以10倍梯度稀释pEGFP-N1-VP6重组质粒,作为标准模板进行TaqMan real-time PCR扩增,制作标准曲线,建立了草鱼呼肠孤病毒的荧光定量PCR检测方法。检测结果显示,标准曲线的相关系数(R2)达到0.998 09,斜率为-3.373;对初始模板定量检测的范围为1×101～1×106copies/μL;特异性试验结果表明,该方法可特异性地检测出草鱼呼肠孤病毒,而对鲤春病毒血症病毒(SVCV...
[期刊] 水产学报
[作者]
李贤 曾伟伟 王庆 王英英 李莹莹 宋新建 黄琦雯 石存斌 吴淑勤
草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型（ＧＣＲＶⅡ）是当前导致草鱼出血病流行和暴发的主要基因型，本研究拟通过分析ＧＣＲＶⅡ代表株ＨＺ０８在不同鱼类细胞中的增殖情况来筛选ＧＣＲＶⅡ的敏感细胞系。首先以不同浓度的ＨＺ０８株接种草鱼吻端成纤维细胞（ＰＳＦ）和草鱼鳔细胞（ＧＳＢ），以确定病毒接种的最佳浓度；然后以最佳接种浓度同时感染ＰＳＦ、ＧＳＢ、草鱼肝细胞（Ｌ８８２４）、草鱼卵巢细胞（ＣＯ）等１０种鱼类细胞，接毒后每天观察细胞状态，用荧光定量ＰＣＲ（ｑ ＰＣＲ）方法定量分析ＨＺ０８在各种细胞系中的增殖量，并在感染５ ｄ后用间接免疫荧光定性分析病毒在各种细胞中的增殖情况。结果显示，ＨＺ０８感染细胞的最佳接种浓度为１．０×．．．
[期刊] 中国水产科学
[作者]
曾伟伟 王庆 王英英 张乐生 刘宝芹 石存斌 吴淑勤
针对草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)各类型毒株的保守区域分别设计3对引物,优化反应条件和体系,建立了草鱼呼肠孤病毒三重RT-PCR检测方法,通过PCR扩增分别获得大小约为530 bp、297 bp和196 bp的DNA片段。进一步分析表明,该检测方法具有良好的敏感性、特异性和稳定性,可以检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型核酸最低量分别约为260、190与230拷贝的病毒量,且某一类型的引物只能检测到同一类型的GCRV。用建立的多重RT-PCR方法对2008—2011年采集自江西、广东、湖北、浙江、重庆、四川、福建等地的草鱼(Ctenopharyngodonidellus)主养区...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
曾伟伟 王英英 尹纪元 汤亚方 李莹莹 王庆 高彩霞 任燕 刘春 石存斌
为了解决Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus genotypeⅡ,GCRV-Ⅱ)含量和滴度测定方法的选择问题,本研究利用荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)、免疫过氧化物酶单层细胞试验(immunoperoxidase monolayer assay,IPMA)和间接免疫荧光试验(indirect fluorescent assay,IFA)三种方法来对GCRV-Ⅱ进行检测和含量测定,从特异性、敏感性、可靠性和检测结果的相关性来比较这三种方法对于GCRV-Ⅱ定量检测的差异。结果显示:qPCR、IPMA和IFA三种方法检测GCRV-Ⅱ的最低限分别为8.6、86和86拷贝/μL,qPCR的检测灵敏度比IPMA和IFA高一个数量级;特异性分析表明,qPCR、IPMA和IFA三种方法均只能检测出GCRV-Ⅱ型分离株,而其它病毒和未感染病毒的阴性对照细胞均为检测阴性,表明这三种方法均具有较高的特异性;3种方法分别检测60份已知临床样品,qPCR、IPMA和IFA的诊断敏感性和特异性分别为96.7%(29/30)和100%(30/30)、100%(30/30)和93.3%(28/30)及100%(30/30)和100%(30/30);三种方法对于GCRV-Ⅱ的定量检测结果中病毒拷贝数和病毒滴度之间具有较好的相关性,其拟合曲线分别为:Y(IPMA,TCID_(50)/mL)=23.629X-536 174(qPCR,拷贝/mL)(R~2=0.996)、Y(IFA,TCID_(50)/mL)=20.318X-575 062(qPCR,拷贝/mL)(R~2=0.995)和Y(IPMA,TCID_(50)/mL)=1.161X-1 176(IFA,TCID_(50)/mL)(R~2=0.999)。结果表明,GCRV-Ⅱ病毒滴度的测定,除了用IPMA和IFA外,也可以采用qPCR方法通过测定病毒的核酸拷贝数来测算其病毒滴度。
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