- 年份
- 2024(2299)
- 2023(3618)
- 2022(3282)
- 2021(3165)
- 2020(2940)
- 2019(5815)
- 2018(5810)
- 2017(9906)
- 2016(6210)
- 2015(7051)
- 2014(7021)
- 2013(6977)
- 2012(6746)
- 2011(6125)
- 2010(6365)
- 2009(5899)
- 2008(5965)
- 2007(5512)
- 2006(4900)
- 2005(4239)
- 学科
- 济(20087)
- 经济(20062)
- 管理(14472)
- 业(12906)
- 企(11270)
- 企业(11270)
- 学(10242)
- 方法(9512)
- 数学(7923)
- 数学方法(7725)
- 农(5487)
- 中国(5073)
- 财(4778)
- 业经(4498)
- 理论(4467)
- 和(4313)
- 地方(4236)
- 环境(4064)
- 制(3824)
- 农业(3537)
- 水产(3273)
- 资源(3226)
- 划(3199)
- 务(3012)
- 财务(3003)
- 财务管理(2990)
- 及其(2922)
- 银(2915)
- 教育(2883)
- 策(2883)
- 机构
- 大学(94133)
- 学院(93489)
- 研究(38360)
- 科学(30769)
- 管理(29425)
- 农(27776)
- 济(27282)
- 经济(26511)
- 中国(25998)
- 理学(25165)
- 理学院(24728)
- 管理学(23889)
- 管理学院(23760)
- 所(22889)
- 农业(22643)
- 研究所(21581)
- 京(21190)
- 业大(20970)
- 中心(16278)
- 江(15938)
- 室(14940)
- 省(14556)
- 农业大学(14491)
- 技术(14022)
- 院(14012)
- 实验(13861)
- 范(13758)
- 师范(13430)
- 实验室(13371)
- 财(12973)
- 基金
- 项目(67657)
- 科学(50143)
- 基金(45991)
- 家(43838)
- 国家(43501)
- 研究(42238)
- 科学基金(34352)
- 省(28993)
- 划(25309)
- 自然(25123)
- 自然科(24504)
- 自然科学(24489)
- 自然科学基金(23999)
- 基金项目(23853)
- 社会(22962)
- 社会科(21544)
- 社会科学(21531)
- 教育(19740)
- 资助(19458)
- 计划(16985)
- 重点(16742)
- 科技(16646)
- 编号(16333)
- 发(14596)
- 成果(14255)
- 科研(13824)
- 创(13646)
- 部(13405)
- 课题(13008)
- 创新(12960)
共检索到136588条记录
发布时间倒序
- 发布时间倒序
- 相关度优先
文献计量分析
- 结果分析(前20)
- 结果分析(前50)
- 结果分析(前100)
- 结果分析(前200)
- 结果分析(前500)
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
徐诗英 李婧慧 邹勇 刘林 贡成良 曹广力 薛仁宇 陈辉
为探明呼肠孤病毒(GCRV)外衣壳蛋白VP7基因工程亚单位疫苗产生的抗体效价水平和免疫保护力,用RT-PCR方法,从GCRV中扩增到VP7基因片段,并克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,得到重组质粒pET-VP7,酶切鉴定后,将pET-VP7转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,产生的重组蛋白经变性和复性后,按0.5、1.0、2.0 mg/尾的注射剂量分为3个免疫组,以等体积的氢氧化铝为佐剂进行注射。经SDS-PAGE电泳分析,发现了相对分子质量为34 000的蛋白表达带;Western Blot检测结果显示表达的蛋白具有很好的抗原性;间接凝集试验结果表明,3个免疫组均有抗体产...
[期刊] 水产学报
[作者]
郝贵杰 潘晓艺 姚嘉赟 徐洋 尹文林 沈锦玉
将编码草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)主要衣壳蛋白VP70.9kb的基因片段连接至克隆载体pMD19-T中,筛选阳性克隆并测序,经检测为正确序列后,再将目的片段克隆入真核表达载体pCI,筛选得到阳性重组质粒pCI-VP7。然后构建pCI-VP-GFP重组表达质粒(即GFP基因与VP7的一段上游基因融合表达),用PCR及酶切方法鉴定克隆的正确性。并用脂质体法将其转染入真核细胞COS-1和CIK进行瞬时表达,荧光显微镜观察及RT-PCR特异性检测。结果表明,GFP基因与VP7的一段上游基因被成功转染到COS-1和CIK细胞,并得到了很好的表达。进而证明pCI-VP...
关键词：
草鱼呼肠孤病毒 衣壳蛋白 转染 真核表达
[期刊] 水产学报
[作者]
徐诗英 刘林 李婧慧 邹勇 倪金俤 杨鸢劼 贡成良 曹广力 薛仁宇 陈辉
将草鱼呼肠孤病毒(GCRV)外衣壳蛋白VP7双基因(约0.9 kb)及团头鲂的β-肌动蛋白启动子(约0.56 kp)经扩增并鉴定正确后,克隆至基因转移载体pFastBacTM Dual中,获得重组质粒pFastBac-β-VP71-VP72,以此研究草鱼免疫实验及免疫效果。重组质粒按10、30、60μg分为3组,同时设30μg空载体组及对照组。于免疫后第14、21、28、49天通过RT-PCR检测VP7的转录水平、间接凝集反应测定抗体水平及攻毒试验检测免疫保护效果。结果显示,pFastBac-β-VP71-VP72导入鱼体后,VP7基因在β-肌动蛋白启动子的驱动下持续表达,至第49天仍能检测到...
[期刊] 水产学报
[作者]
秦波 程洛单 陈杰 蒋霞云 邹曙明
为探索草鱼出血病防治新技术,实验采用衣壳蛋白靶向灭活(capsid-targeted viral inactivation,CTVI)策略,利用Tgf2转座子元件,构建了带爪蟾EF1α或鲤热休克蛋白70两种不同启动子的CTVI转基因质粒p Tgf2-EF1α-VP3-SN或p Tgf2-Hsp70-VP3-SN。该2种质粒均包含GCRV衣壳蛋白VP3与金黄色葡萄球菌核酸酶(Staphylococcus aureus nuclease,SN)融合表达阅读框。通过将2种CTVI转基因质粒与体外合成的Tgf2转座酶5'加帽mRNA共同显微注射入草鱼1~2细胞期受精卵,获得了带2种不同启动子的CTVI...
[期刊] 水产学报
[作者]
宗乾坤 张也 吕利群
为建立针对Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒（ＧＣＲＶ）的血清学检测方法，分别构建了ＧＣＲＶ ＪＸ０２株外衣壳蛋白ＶＰ４、ＶＰ３５的原核重组表达质粒ＰＧＥＸ－４Ｔ－３－Ｓ６、ＰＧＥＸ－４Ｔ－３－Ｓ１１，用纯化的重组蛋白Ｒ ＶＰ４、Ｒ ＶＰ３５分别免疫小鼠制得相应的多克隆抗体，用间接ＥＬＩＳＡ方法测定２种抗体的效价，用ＷＥＳＴＥＲｎ ＢＬｏＴ鉴定抗体的特异性。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析细菌表达的Ｒ ＶＰ４、Ｒ ＶＰ３５大小分别约为９８ｋｕ和６１ｋｕ，且都主要以包涵体的形式存在；间接ＥＬＩＳＡ方法测定制备的抗体效价分别约为１：４×１０５和１：１０６；ＷＥＳＴＥＲｎ ＢＬｏＴ结果显示，制备的２种多克隆抗体都既能够识别原核．．．
[期刊] 中国水产科学
[作者]
曾宪辉 曾令兵 周勇 范玉顶 陈倩 刘文枝 张雪萍 张琳琳
根据大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus,GSIV)主衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因序列设计特异性引物,经PCR扩增得到MCP基因编码框1392 bp全长序列,将其定向克隆到真核表达载体pc DNA3.1(+)中,构建重组质粒并命名为pc DNA-MCP。将pc DNA-MCP质粒转染大鲵肌肉细胞系(GS-M),间接荧光免疫染色结果显示,MCP蛋白可在GS-M细胞中表达,且转染后72 h的表达量显著高于转染后48 h;收集转染后72 h的GS-M细胞,经Western blot检测,可检测到MCP蛋白的特异性表达...
[期刊] 水产学报
[作者]
王杭军 叶星 田园园 张莉莉 邓国成
在前期研究中分离到一株草鱼呼肠孤病毒,GCRV-GD108,并获得其全基因组序列。该病毒株的M5基因编码VP5蛋白,该蛋白与哺乳动物正呼肠孤病毒μ2蛋白具有较高的同源性及相似的NTPase结合保守区域,推测VP5蛋白也同样具有NTPase活性。为检测VP5蛋白是否具有NTPase活性及其是否具有免疫保护作用,采用已构建的原核表达载体表达VP5重组蛋白,通过孔雀绿钼酸铵法检测纯化后的重组蛋白的NTPase活性。采用DNAstar软件预测M5基因编码蛋白的抗原性,综合蛋白亲水性、表面可及性与表面抗原性三项指标,预测编码蛋白可形成抗原表位的氨基酸区域数多达86个,提示VP5蛋白具有较强的免疫原性。用...
[期刊] 水产学报
[作者]
姜霖 涂加钢 张永安
Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒（GCRV）基因片段S11编码外衣壳蛋白VP35。为深入探究VP35蛋白在病毒增殖中发挥的作用，本研究扩增S11基因并插入载体pCMV-3×flag中，构建pCMV-3×flag-S11真核表达质粒，转染草鱼肾细胞（CIK）后感染Ⅱ型GCRV，收集感染后的上清液与细胞。首先利用实时荧光定量PCR中相对定量的方法检测细胞样品中Ⅱ型GCRV-S6基因的mRNA，结果显示，过表达VP35在病毒mRNA水平促进Ⅱ型GCRV的增殖；然后扩增S6基因并插入到载体pET-32a(+)中，构建重组原核表达质粒，纯化Ⅱ型GCRV-VP4蛋白并制备多克隆抗体，用Western blot检测收集的细胞样品中的VP4蛋白，结果表明过表达VP35在病毒蛋白水平促进Ⅱ型GCRV的增殖；最后使用pET-32a-S6质粒作为阳性标准质粒并制作标准曲线，建立Ⅱ型GCRV病毒基因拷贝数的绝对定量检测方法，利用该方法检测细胞上清液中的病毒颗粒，结果表明过表达VP35增加Ⅱ型GCRV病毒拷贝数。本研究从三个维度证明过表达VP35蛋白促进Ⅱ型GCRV增殖，有助于深入解析VP35蛋白功能，也为进一步探究Ⅱ型GCRV的致病机制提供理论基础。
[期刊] 淡水渔业
[作者]
周勇 范玉顶 徐进 李艳秋 肖艺 曾令兵
以据草鱼呼肠孤病毒(GCRV)VP6蛋白的全基因序列(GeneBank AF403394)为模板,采用RT-PCR构建了草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白基因植物表达载体的构建。结果显示:实验构建的pCR 2.1-VP6重组质粒含有NcoⅠ和BglⅡ酶切位点;pCR 2.1-VP6重组质粒经PCR扩增和测序显示含有1.3 Kbp的草鱼呼肠孤病毒VP6基因读码框片段。将目的片段VP6酶切、克隆到携带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的植物表达载体pCAMBIA1302中,再经酶切、PCR扩增和序列测定显示,pCAMBIA1302-VP6含有1.3 Kbp的草鱼呼肠孤病毒VP6基因片段,说明已插入植物表达载体pC...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
苏岚 曾令兵 周勇 张辉 高正勇 张金凤
根据GeneBank中草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)104株VP6蛋白的全基因序列(HM234682)设计一对特异引物,以提取的GCRV-104核酸为模板,采用RT-PCR技术扩增VP6蛋白编码基因,并将其克隆到含强启动子AOXⅠ的毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZB上。重组酵母质粒pPICZB-VP6经SacⅠ线性化,电击转化到毕赤酵母KM71菌株中,Zeocin抗性平板上筛选高拷贝转化子。阳性转化子在30℃,0.5%(V/V)的甲醇添加量的条件下,连续诱导3 d,表达产物经SDS-PAGE和Western-Blotting检测,...
[期刊] 水产学报
[作者]
喻飞 王浩 宗乾坤 张娅楠 刘海云 陈百朋 吕利群
为研究Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒外纤维蛋白ＶＰ５６与宿主蛋白的相互作用，实验采用酵母双杂交Ｇａｌ４系统鉴定与ＶＰ５６相互作用的草鱼蛋白。首先利用ＲＴ－ＰＣＲ技术从Ⅱ型ＧＣＲＶ感染的草鱼肾细胞中扩增目的基因ＶＰ５６，构建Ｐ ＧＢＫＴ７－ＶＰ５６诱饵表达载体；在酵母菌株中检测其自激活性后，以ＶＰ５６为诱饵在草鱼酵母双杂交文库中筛选阳性菌株，并对阳性克隆的序列进行分析。实验也克隆了草鱼ＪａＭ－ａ（ＧＣ ＪａＭ－ａ）基因，并构建Ｐ ＧａＤＴ７－ＧＣ ＪａＭ－ａ载体，在酵母中研究草鱼ＧＣ ＪａＭ－ａ与病毒蛋白ＶＰ５６相互作用的可能性。研究表明构建的诱饵质粒Ｐ ＧＢＫＴ７－ＶＰ５６无自激活作用，可以应用于酵母双杂．．．
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
王杭军 叶星 田园园 张莉莉 瞿兰 张蕊
根据草鱼呼肠孤病毒广东株GCRV-GD108编码VP5的M5基因的cDNA序列,分别设计合成带特定酶切位点的特异引物,进行PCR扩增;通过酶切与连接,构建2种重组表达载体pET30c-M5和pColdⅡ-M5,分别转化于大肠杆菌并进行诱导表达;对培养基、诱导时间、诱导剂浓度和温度等条件进行优化,确定最适表达体系。通过SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定。结果显示,所构建的2种VP5蛋白原核表达载体,均在大肠杆菌中成功表达了分子质量大小(约80ku)与预期相符的重组蛋白,表达产物主要存在于包涵体中。诱导表达后的菌体经离心、洗涤与超声破碎,离心收集包涵体。包涵体通过变性、透...
[期刊] 水产学报
[作者]
苏航 苏建国
为了阐明草鱼呼肠孤病毒（grass carp reovirus， GCRV）的感染机制，实验深入探究VP56（是II型和III型（GCRV-II/III）特有的纤维蛋白）与宿主细胞蛋白的相互作用。实验首先使用免疫共沉淀（co-immunoprecipitation， co-IP），发现VP56与细胞内定位于内质网的分子伴侣蛋白葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78 ku， GRP78）发生相互作用。而后，VP56与GRP78的互作通过基于远红色荧光蛋白mNeptune的双分子荧光互补系统（bimolecular fluorescence complementation， BiFC）得到验证。在VP56稳定表达的草鱼肾细胞系（C. idella kidney， CIK）中，相比于稳定表达空载质粒的CIK细胞，内质网形态发生巨大变化，产生肿胀、扩张、脱粒等现象，说明VP56激活内质网应激。通过对内质网应激下游转录因子的mRNA水平检测，发现VP56激活活化转录因子6（activating transcription factor 6， ATF6）介导的信号转导途径，激活非折叠蛋白反应。结果表明，GCRV-II感染过程中，破坏了细胞稳态，激活内质网应激。本研究为GCRV感染机制和抗GCRV病毒研究提供了新的思路，揭示了一种新的病毒逃逸机制，有助于淡水养殖产业中草鱼出血病的防控。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
周勇 曾令兵 范玉顶 罗晓松 徐进 肖艺
根据GenBank中草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)VP6蛋白的全基因序列(AF403394)和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的基因序列(M17874),设计并合成特异性引物,从感染草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肾细胞(CIK)中提取病毒核酸作为模板,进行RT-PCR扩增,得到约1.3 kb的GCRV VP6基因读码框片段,同时提取大肠杆菌(Escherichia coli)H44815全基因组作为模板,进行PCR扩增得到约370 bp的LTB基因读码框片段。将获得的2个目的片段分别克隆到pCR2....
文献操作()
导出元数据
文献计量分析
导出文件格式：WXtxt
删除
