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[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
刘朋虎 邓优锦 江玉姬 谢宝贵
分别从不能出菇的草菇单孢菌株PYd21(基因组测序菌株)和PYd15(重测序菌株)及由PYd21、PYd15配对杂交获得可正常出菇的异核菌株H15-21中克隆测序了磷酸丙糖异构酶(TPI)基因,并对TPI基因的结构及其在3个菌株中的表达量进行了分析.结果表明:PYd21、PYd15中TPI基因的序列完全相同;转录组读段定位、双末端分析结果显示,TPI基因全长1015 bp,开放阅读框序列全长756 bp,编码251个氨基酸,有6个外显子、5个内含子;RNA加工过程中存在两种可变剪切类型和两个可变剪切位点;数字基因表达谱测序的结果表明,PYd21、PYd15和H15-21中TPI基因的表达量(T...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
张磊 李林
为获得高效抗除草剂的基因,提高转基因作物的应用能力,本研究使用含硝磺草酮的酪氨酸无机盐培养基(TMSM)平板筛选法,筛选得到一株能够耐受5 000μmol/L硝磺草酮的革兰氏阴性细菌MST-5,经过16S rRNA序列分析鉴定为嗜麦芽窄食单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)。根据4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase,HPPD)同源基因设计引物,从MST-5中克隆到编码HPPD的基因Sthppd,序列分析发现Sthppd序列长度为1 071bp,编码356个氨基酸。同源比对发现,St HPPD与已报道的HPPD相似性仅为47%～51%。在大肠杆菌中进行原核表达Sthppd并通过Co2+亲和层析纯化获得St HPPD纯蛋白,活性检测表明此蛋白具有4-羟苯基丙酮酸双加氧酶活性,抗性分析显示其对硝磺草酮具有较高的抗性,IC50为15.5μmol/L,同时对其它HPPD抑制剂类除草剂如苯吡唑草酮和二酮腈也有较强抗性,IC50分别达到10.8和28.2μmol/L。St HPPD的最适反应温度为30℃,最适pH为7.0,大部分金属离子和某些化学添加剂严重抑制St HPPD的活性,Fe3+、Mg2+和Urea对St HPPD酶活基本没有影响。综上,St HPPD具备较高硝磺草酮抗性,在构建抗除草剂转基因作物、与HPPD抑制剂类除草剂搭配在相关转基因作物的田间应用中,具有一定价值。
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
杨兆辉 汪子洋 杨文涛 蔡瑜婷 谭伟龙 黄恩炯 张灵玲
乙酰化是蛋白质翻译后修饰的一种重要方式,可参与多种细胞进程,但迄今未见有关乙酰化修饰在Bt中发挥作用的报道.本课题组前期通过对高效杀虫Bt菌株LLP29的基因组进行测序分析,发现该菌株也存在编码乙酰转移酶的基因(如ykkB).为探讨乙酰化修饰在Bt菌株中的作用,以ykkB为靶标,利用无缝克隆技术成功克隆与测序了ykkB基因.通过生物信息学分析,发现该基因编码的蛋白可能是一类N-乙酰转移酶,赖氨酸和亮氨酸含量最高,半胱氨酸含量最低,是一种亲水性蛋白质,且无跨膜区;同时,成功表达、纯化了YkkB蛋白,通过体外自乙酰化分析,证实该蛋白可发挥乙酰基转移的作用.
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
王文婷 张晨燕 赵可冉 丁建华 荆恩荣 杨超
【目的】双组分系统VfmH/VfmI与Dickeya属病原菌的致病因子和致病过程有关。研究D fangzhongdai Onc5菌株vfmH和vfmI基因的克隆、原核表达及蛋白纯化，为明确VfmH/VfmI的调控机理提供依据。【方法】采用RT-PCR方法扩增D. fangzhongdai Onc5菌株，获取vfmH和vfmI基因开放阅读框（ORF）。随后将目的基因克隆至原核表达质粒pET-32a，构建重组质粒pET-32a-VfmH和pET-32a-VfmI，经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后，利用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白，并利用Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。【结果】D. fangzhongdai Onc5菌株vfmH和vfmI的ORF大小分别为1 401 bp和1 320 bp，分别编码466个和439个氨基酸；同源性分析表明，其氨基酸序列与Dickeya属其他菌种的vfmH和vfmI序列具有很高的相似性；SDS-PAGE和Western blot鉴定分析表明：添加0.5 mmol·L-1 IPTG，可诱导重组质粒pET-32a-VfmH转化株和pET-32a-VfmI转化株表达产生大量携带His-tag的融合重组蛋白；同时，成功纯化出目的蛋白。【结论】本研究首次克隆出D. fangzhongdai中双组分系统基因vfmH和vfmI，并成功纯化出VfmH和VfmI蛋白。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
朱慧 王云霞 胡白石 刘凤权
利用PCR方法从产酶溶杆菌OH11菌株中克隆到编码几丁质酶的chiA基因。同源性比较发现,其推测产物与产酶溶杆菌C3菌株和N4-7菌株的ChiA有97%以上的序列一致性。基因经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到含T7启动子的高表达载体pET21a(+)上构建重组质粒pChiA,并转化宿主菌BL21(AI)产生BLChiA表达菌株。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后发现,BLChiA菌株产生相对分子质量约为75×103的蛋白质。生物活性试验表明,该蛋白能水解几丁质,在几丁质培养基上产生一透明的水解圈,并对立枯丝核菌菌丝的生长有抑制作用。因此该蛋白具有一定的生物防治作用。
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
臧超群 白元俊 宋飞 谢瑾卉 林英 梁春浩
由卵菌引起的植物病害大多难以控制,常因再侵染次数多,暴发流行而导致严重损失。卵菌细胞壁的主要成分为纤维素,因此具有产生纤维素酶能力的生防菌能够更好的用于防治卵菌门真菌引起的植物病害。SY286菌株对葡萄霜霉病菌具有较强抑制活性。纤维素酶活性检测试验结果显示,SY286菌株代谢产物中含纤维素酶,菌落周围透明带宽度达5.9mm。根据已报道的纤维素酶基因序列设计引物,经聚合酶链式反应(PCR)扩增得到了561bp纤维素酶基因相关片段,经Blast比对,该与内切β~(-1),4-葡聚糖酶基因序列相似性达99%,即为SY286基因的核心序列。根据此片段的序列设计特异性引物,通过交错式热不对称PCR(TailPCR)得到其上下游序列,经拼接获得完整的纤维素酶基因的开放阅读框(ORF)序列(命名为SY286基因)。该基因序列ORF长度为1494 bp,编码1个含497个氨基酸的蛋白质,预测其蛋白分子量为55.04k Da,理论等电点PI为8.12。经Blast比对,该序列与内切β~(-1),4-葡聚糖酶编码序列相似性达99%,确定SY286基因为内切β~(-1),4-葡聚糖酶基因。并利用SDS-PAGE电泳对该蛋白在E.coli BL21(DE3)中的表达结果进行了检测。经0.5mmol·L~(-1)的IPTG诱导下,重组菌在15℃、22℃、30℃和37℃条件下的表达产物均可在PAGE凝胶上出现特异性条带。经检测重组菌具有纤维素酶活性。试验结果为研究纤维素酶在植物病害生物防治中的应用,以及SY286菌株抑菌分子机理研究和菌株的遗传改良奠定了基础。
关键词：
苍白杆菌 纤维素酶 克隆 表达
[期刊] 中国农业科学
[作者]
邵铁梅 宋福平 李卓夫 张杰 姜声华 刘大群 黄大昉
通过PCR方法筛选160株苏云金芽孢杆菌,其中94株含有zmaR基因。测定了含zmaR基因的菌株培养物上清液对草生欧文氏杆菌(Erwiniaherbicola)的抑菌活性,结果表明有67株菌有抑菌活性,其中21株抑菌活性较高。经鉴定,抑菌活性较高的G03菌株含有cry1Ac、cry1Aa、cry1Ca和cry2Ab等高毒力杀虫基因,并从G03中克隆了zmaR全长基因,完成了序列测定。该基因编码区为1125bp,由核苷酸序列推导的氨基酸残基组成为375个,分子量为43.5kD,等电点pI4.945。通过载体pET-21b将zmaR基因导入大肠杆菌BL21,可正常表达43.5kD蛋白,并使宿主菌产...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
陈萌 徐敏 王业民 白亭丽 毕德玺 邓子新 陶美凤
通过基因组粘粒文库的高通量接合转移、异源表达和生物活性测定，结合ＤＮＡ序列测定，从刺孢吸水链霉菌ＡＡ９７０２６中筛选具有广谱抗菌活性的小分子化合物及其生物合成基因簇，获得１个对革兰氏阳性细菌和红酵母均有抑制活性的阳性克隆１Ｈ５，其部分ＤＮＡ序列与链丝菌素生物合成基因相似。含１Ｈ５的异源链霉菌宿主的发酵液均能检测到链丝菌素的不同组份，表明１Ｈ５含有完整的链丝菌素生物合成基因簇。
[期刊] 水产学报
[作者]
罗鹏 胡超群
溶藻弧菌的胞外产物(ECP)在其致病过程中发挥重要作用,已经观察到溶藻弧菌ECP所致的溶血现象,关于溶藻弧菌溶血素的种类和其对溶藻弧菌的致病性贡献的报道非常稀少。利用已经报道的多种弧菌溶血素基因序列设计通用引物,检测溶血素基因在溶藻弧菌中的分布,发现96个菌株中有74株扩增出溶血素基因(vah)片段。对致病株ZJ0451的vah片段测序。根据已测得的片段序列设计引物,通过反向PCR扩增及后续克隆测序获得全长vah基因及部分侧翼序列。经比对证实溶藻弧菌vah与多种弧菌的TLH类溶血素高度相似,且其肽链N端有信号肽。利用pET32a载体构建了两种包含不同长度融合标签的vah表达载体,并均在大肠杆菌...
关键词：
溶藻弧菌 溶血素 反向PCR 表达
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
邬敏辰 周晨妍 李剑芳
以宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001株基因组DNA为模板,PCR扩增了编码木聚糖酶Ⅱ(Xyla-nases,XynⅡ)成熟肽的DNA片段。构建重组克隆质粒pUCm-T-XynⅡ,并以其为摸板,PCR扩增XynⅡ成熟肽的cDNA片段(555 bp),连接于表达质粒pGEX-5X-3的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点间,构建重组表达质粒pGEX-5X-3-XynⅡ,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行检测。结果表明,XynⅡDNA中存在1个内含子,长度为51 bp;融合蛋白GST-XynⅡ主要以包涵体形式存在,相对分子质量约为50 ku,IP...
[期刊] 华北农学报
[作者]
贾振华 刘方 宋聪 黄亚丽 马宏 宋水山
为了揭示hrp基因表达的Harpins蛋白能够广泛地诱导植物对植物病虫害防卫反应的分子机制,通过琼脂固体平板法,发现胡萝卜软腐欧文氏菌Ecc36菌株具有很高的胞外酶分泌活性,该菌接种非寄主植物烟草,能够引起过敏反应(HR),结果表明,Ecc36携带hrp基因。用地高辛标记的hrp N基因作探针,通过Southern杂交证明了Ecc36菌株中含有hrp N基因,命名为hrp NEcc PR基因;核苷酸序列分析表明,hrp NEcc PR基因的开放阅读框ORF为1 254 bp,编码的Harpin蛋白(命名为HrpN_(EccPR)蛋白)由417个氨基酸残基组成,其分子量为45.27 ku,等电点为5.73,与其他几种软腐欧文氏菌Harpin蛋白有较高的同源性。此外,将hrp NEcc PR基因克隆到表达载体p ET28a(+)上,将构建的hrp NEcc PR基因表达载体(p ET30a-Ecc PR)转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG(异丙基硫代-β-D半乳糖苷)诱导HrpN_(EccPR)蛋白表达,纯化后的HrpN_(EccPR)能诱导烟草发生过敏反应,表明HrpN_(EccPR)蛋白具有激发植物免疫反应的生物活性,可为进一步研究HrpN_(EccPR)蛋白诱导植物防卫反应的机制奠定基础。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
王伟 白俊杰 劳海华 叶星 罗建仁
根据已报道的Mx蛋白cDNA序列设计合成特异引物,应用逆转录 聚合酶链式反应(RT PCR)方法,从草鱼呼肠孤病毒(GCRV)诱导的草鱼(Ctenopharyngodonidellus)肝脏总RNA中扩增获得Mx蛋白cDNA,回收纯化后克隆到pGEM TEasyVector系统的T载体上。重组子的序列分析表明:所克隆的Mx蛋白cDNA长722bp,编码240个氨基酸,包括1个三联GTP结合区域和1个发动蛋白(dynamin)族特征的序列。与已知鱼类Mx蛋白基因序列比较表明,草鱼Mx蛋白基因序列与其它鱼类Mx基因相应序列具有较高的同源性,其中与斑马鱼Mx蛋白E型基因碱基序列比较同源性最高,为87...
关键词：
草鱼 Mx蛋白基因 基因克隆 原核表达
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
孔祎頔 田佳鑫 赵林辉 陈秀梅 单晓枫 王桂芹
【目的】克隆维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)低钙反应蛋白(AcrV)并进行原核表达,为进一步研究AcrV蛋白的结构功能及AcrV基因工程亚单位疫苗的制备奠定基础。【方法】克隆维氏气单胞菌TH0426菌株AcrV基因,通过生物信息学软件分析其编码蛋白的理化性质、疏水性、信号肽、跨膜区、二级结构及三级结构。将AcrV基因克隆到pET-30a(+)原核表达载体上,构建原核重组表达质粒pET-30a(+)-AcrV,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,进行EcoRⅤ和XhoⅠ双酶切鉴定和测序鉴定。用IPTG对pET-30a(+)-AcrV进行诱导表达,对IPTG浓度(0.2,0.4,0.6和0.8 mmol/L)和诱导时间(2,3,4和5 h)进行优化。在最佳条件下诱导表达重组蛋白AcrV,经镍柱纯化且尿素梯度复性后免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,进行SDS-PAGE及Western blot分析,对目的蛋白的免疫原性进行检测。【结果】成功获得了1 086 bp的AcrV全基因,编码361个氨基酸。AcrV蛋白是无跨膜结构且不编码信号肽的蛋白,有2个高度保守的结构功能域,属于全α型蛋白。成功构建了原核重组表达质粒pET-30a(+)-AcrV,其最佳诱导表达条件为IPTG 0.8 mmol/L诱导5 h。SDS-PAGE及Western blot分析结果显示,AcrV蛋白能被鼠抗阳性血清识别,表明其具有一定的反应原性。【结论】成功克隆了1 086 bp的AcrV基因,分析了其编码蛋白的生物信息;获得了免疫原性良好的重组AcrV蛋白。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
姚家成 夏珍珍 黄粤 皮婷 梅枫 何冬兰 程国军 刘涛 李晓华
对从湖北省襄阳市烟草种植土壤中分离筛选得到的尼古丁降解菌根癌土壤杆菌SCUEC1菌株中agnH基因进行克隆表达,并对AgnH蛋白的表达和纯化条件进行优化,为解析agnH基因的功能和揭示根癌土壤杆菌SCUEC1菌株尼古丁降解的分子机制提供理论依据。通过PCR扩增获得agnH全长基因(585bp),构建重组质粒pET28a(+)-agnH,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行异源表达,研究不同IPTG浓度、诱导温度和诱导时间对重组质粒pET28a(+)-agnH诱导表达的影响,用不同浓度的咪唑洗脱液洗脱重组蛋白,采用SDS-PAGE检测重组蛋白。结果表明:在IPTG浓度为0.4mmol/L、诱导温度为25℃且诱导时间为25h条件下,AgnH蛋白表达量较高;在250mmol/L的咪唑洗脱液洗脱下,得到浓度较高的AgnH蛋白。
[期刊] 水产学报
[作者]
李常健 刘军 桂建芳
采用RACE-PCR技术结合SMART cDNA合成技术,从银鲫中克隆到Ran的全长cDNA并对其编码区全长进行了原核表达、相应抗体制备及其时空表达特征分析。RT-PCR结果表明,Ran基因除在脑组织的转录水平较低外,其它组织中的转录水平几乎相同;Ran基因在不同发育阶段的胚胎中都有mRNA转录,但其mRNA的量在原肠期以后呈下降趋势。Western blot结果表明,Ran在卵巢和精巢中均高水平表达,在心、脑、肝、脾、肾中有较低水平表达,在肌肉中则不表达。同时检测到Ran在不同胚胎发育阶段均有较强表达。这表明,Ran基因在银鲫中可能起着多种作用,尤其在生殖细胞的发生中具有重要作用。最后,采用...
关键词：
银鲫 Ran 时空表达 精核解凝
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