为探索分子杂交技术在草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus,SMoV)检测中的运用,利用CTAB法从草莓叶片中提取总核酸,并以此为模板,利用特异引物扩增SMoV非编码区序列,经克隆、测序获得SMoV非编码区序列。系统进化分析结果显示:本研究中的分离物与GenBank中已报道的分离物的亲缘关系较远,独立形成1个小的进化支。以带有病毒特异片段的质粒为模板,运用PCR技术制备了地高辛标记的cDNA探针。以草莓感染SMoV叶片为试材,利用地高辛标记探针可有效检测草莓叶片中的SMoV,草莓总核酸样品稀释10倍后仍可有效检测。

为探索辣椒轻斑驳病毒(pepper mild mottle virus,PMMo V)的分子杂交技术检测方法,以感病辣椒叶片为试材,用改良CTAB法从辣椒叶片中提取总核酸,运用RT–PCR技术扩增出PMMo V特异片段。以带有PMMo V特异片段的质粒DNA为模板,以用PCR技术制备的地高辛标记PMMo V c DNA探针检测PMMo V。结果表明:1)干燥叶片、新鲜叶片中提取的总核酸稀释80、640倍(相当于12.5、1.60μg叶片)后仍可检测到其中的PMMo V;干燥叶片利于保存及长距离转运,利于对大批量样品进行集中检测;2)采用快速提取法提取叶片总核酸,可从稀释80倍(约12.5μg叶...

【目的】明确草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus,SMoV)的分子变异特点;探索利用嵌套PCR和转录增强技术检测SMoV的方法。【方法】利用RT-PCR扩增SMoV3′非编码区(non-coding region,NCR)和大外壳蛋白(large coat protein,LCP)基因特异片段,并对扩增产物进行克隆测序。利用生物信息学软件分析不同地区分离物变异特点及系统发育关系。参考测序结果,在SMoV基因组保守区设计引物,利用嵌套PCR和转录增强技术检测SMoV。【结果】获得了SMoV中国分离物的NCR区和部分LCP基因核酸序列,不同分离物部分LCP基因核酸序列同源性...

以携带草莓斑驳病毒（Ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕＳ）的‘红颜’草莓为材料，通过对玻璃化超低温脱毒技术中各程序的优化，建立适合‘红颜’草莓的茎尖玻璃化超低温脱毒体系。结果表明：１～２ｍｍ的茎尖在０．５ｍｏｌ／ｌ蔗糖的预培养基预培养３～７ｄ，室温装载处理６０ｍｉｎ，０℃玻璃化处理１８０ｍｉｎ，液氮冷冻６０ｍｉｎ，４０℃解冻２ｍｉｎ，高糖溶液卸载２０ｍｉｎ后接种到ｍＳ＋２．０ｍｇ／ｌ ６－ｂａ再生培养基上，成活率可达７０％以上。再生培养６０ｄ后，随机选取２０株再生植株，利用ｒｔ－ＰＣｒ技术检测草莓斑驳病毒的脱毒效果，脱毒率为１００％。利用该体系可以克服传统茎尖脱毒受茎尖大小的限制（０．．．

依据甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)外壳蛋白(CP)基因的保守区设计引物和TaqMan探针,经过对反应体系和反应条件的优化,建立了特异、灵敏、高效的SPFMV实时荧光定量PCR检测方法。试验结果表明:该方法能检测到目的病毒,标准曲线的斜率和相关系数分别为-3.307和0.998,扩增效率为100.6%。最低可检测到约5.46个拷贝的阳性质粒,灵敏度比常规PCR高2个数量级。建立的实时荧光定量PCR方法可用于田间样品的检测,为SPFMV的早期预警和流行学研究提供了技术手段。

根据GenBank上登录的黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)外壳蛋白基因保守序列,设计特异性引物,利用试管捕捉RT-PCR(TC-RT-PCR)和免疫捕捉RT-PCR(IC-RT-PCR)技术对黄瓜绿斑驳花叶病毒进行检测.结果表明,TC-RT-PCR和IC-RT-PCR均具有良好的特异性,检测灵敏度分别比DAS-ELISA高10和100倍;通过对一批进境黄瓜样品的检测,验证了2种检测技术的实际应用效果.因此,本研究建立的TC-RT-PCR和IC-RT-PCR检测技术,可有效应用于CGMMV的快速检测.

【目的】使用简并引物RT-PCR方法并结合序列测定与分析，为甲型香石竹斑驳病毒属（Alphacarmovirus）、乙型香石竹斑驳病毒属（Betacarmovirus）和丙型香石竹斑驳病毒属（Gammacarmovirus）病毒建立一种快速、灵敏、广谱的检测鉴定方法。【方法】通过基因组序列的多重比对分析，在依赖于RNA的RNA聚合酶（RdRp）基因的保守区域设计1对简并引物Carmo-F2/Carmo-R2，在引物5′端分别加入非互补的富含AT序列（AATAAATCATAA）形成引物Carmo-F2a/Carmo-R2a，测试简并引物RT-PCR方法的广谱性、特异性和灵敏度，并对PCR产物进行测序、序列分析和系统发育分析。利用该方法对来自厦门的扶桑（Hibiscus rosa-sinensis）样品进行病毒检测。【结果】利用Carmo-F2/Carmo-R2和Carmo-F2a/Carmo-R2a两对引物建立的RT-PCR方法，扩增甲型、乙型和丙型香石竹斑驳病毒属病毒的部分RdRp基因，扩增片段分别约为500和550 bp。该方法成功用于检测甲型香石竹斑驳病毒属的香彩雀花碎色病毒（angelonia flower break virus,AnFBV）、小花矮牵牛斑驳病毒（calibrachoa mottle virus,CbMV）、香石竹斑驳病毒（carnation mottle virus,CarMV）、天竺葵花碎色病毒（pelargonium flower break virus,PFBV），乙型香石竹斑驳病毒属的木槿褪绿环斑病毒（hibiscus chlorotic ringspot virus,HCRSV），丙型香石竹斑驳病毒属的甜瓜坏死斑点病毒（melon necrotic spot virus,MNSV），显示出良好的广谱性。特异性检测表明，简并引物Carmo-F2/Carmo-R2和Carmo-F2a/Carmo-R2a在玉米褪绿斑驳病毒（maize chlorotic mottle virus,MCMV;Machlomovirus）、天竺葵线纹病毒（pelargonium line pattern virus,PLPV;Pelarspovirus）、香石竹环斑病毒（carnation ringspot virus,CRSV;Dianthovirus），健康的西瓜、甜瓜、南瓜、大豆、豌豆植物未扩增到预期大小的条带。灵敏度检测表明，简并引物Carmo-F2/Carmo-R2最低可检测到10-2稀释液，简并引物Carmo-F2a/Carmo-R2a可检测到10-3稀释液，在5′端加入非互补的富含AT序列可以提高简并引物RT-PCR检测方法的灵敏度。BLAST分析表明，测定的序列均与相应病毒种类具有最高序列一致性。部分RdRp基因氨基酸序列的系统发育分析结果符合目前通读病毒亚科（Procedovirinae）病毒的分类情况，且可以把病毒鉴定到种的水平。采集13份疑似病毒症状的扶桑样品，均检出木槿褪绿环斑病毒。【结论】基于简并引物Carmo-F2/Carmo-R2和Carmo-F2a/Carmo-R2a的RT-PCR方法，可用于甲型、乙型和丙型香石竹斑驳病毒属病毒的筛查检测，结合序列分析及系统发育分析可进行病毒种类的快速鉴定，并有助于发现新的病毒种类。厦门扶桑植物受到木槿褪绿环斑病毒的侵染。

黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是我国的检疫性有害生物,在广西、辽宁、河北、山东、广东和北京等地均发现疫情,已严重威胁着西瓜、甜瓜、黄瓜等作物的生产,因此加强该病毒的检测极为重要。目前黄瓜绿斑驳花叶病毒病的检测主要有生物学检测、血清学检测、分子生物学检测及电镜显微观察等方法。笔者对有关黄瓜绿斑驳花叶病毒病的检测技术进行了综述,并分析了现有检测技术的优缺点和应解决的主要问题,探讨了该病毒检测技术今后发展的方向。

【目的】甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)侵染甘薯造成重要危害,本研究旨在利用反转录环介导等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)建立一种快速、高效检测SPFMV的方法。【方法】从Gen Bank上获得SPFMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因的核苷酸序列,利用Primer Explorer V4设计4条RT-LAM

本文对草莓轻型黄边病毒(Strawberry mild yellow edge virus,SMYEV)的2种分子检测技术进行了比较研究。结果表明,多重PCR技术以草莓actin为内参基因,完全排除在实验中杂质与操作的影响。Real time PCR技术具有更高的灵敏度和可靠性,可以定量检测出样本中病毒粒子的含量。结果表明,Real time PCR的灵敏度是普通PCR的100倍以上,而多重PCR的检测成本更经济。所以Real time PCR技术将用于引进品种的检疫,而多重PCR技术将用于大规模的脱毒苗

【目的】草莓轻型黄边病毒(Strawberry mild yellow edge virus,SMYEV)是侵染草莓的重要病毒,严重影响草莓果实的产量和品质。研究旨在建立利用反转录等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测SMYEV的方法。【方法】根据SMYEV外壳蛋白基因3′端保守序列设计4个特异性引物SMYEV-FIP(5′-CAGATCAGCGACAATTTGGACTCCTGAGGAACTTGCTGCT-3′)、SMYEV-BIP(5′-GCTTTGTC GGGGATCCTG...

从进口美国大豆中挑选具有典型斑驳症状的种子,在隔离温室内种植。出苗后,采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)进行菜豆荚斑驳病毒(bean pod mottle virus,BPMV)的血清学检测。对BPMV血清学反应阳性的幼苗进一步采用反转录(RT)PCR方法和测序方法进行鉴定。结果从大豆幼苗中筛选并鉴定出菜豆荚斑驳病毒。

采用DAS-ELISA对从泰国进口的6个玉米品种的种子进行玉米褪绿斑驳病毒(Maize chlorotic mottle virus,MCMV)检测,结果显示其中1个样品为MCMV阳性,其他品种为阴性。RT-PCR检测结果进一步证实该样品为阳性。对PCR产物进行测序,将分离物序列与已发布的23条MCMV序列进行比对和系统进化分析,结果表明该分离物的序列与中国分离物和泰国分离物的遗传距离较近,同分化在进化树的同一个簇。取5号样品的100粒种子进行DAS-ELISA检测,结果仅有2粒种子为阳性,即MCMV的检出率为2%。

【目的】探索5种葫芦科作物病毒即小西葫芦黄花叶病毒(Zuccini yellow mosaic virus,ZYMV)、西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、番木瓜环斑病毒西瓜株系(Papaya ringspot viruswatermelon strain,PRSV-W)和南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus,SqMV)的斑点杂交检测技术,为葫芦科作物种子带毒的快速准确鉴定、流行病学研究和转基因检测等提供技术和方法。【方法】以构建的重组质粒为模板,用PCR方法合成了相应的地高...