为深入研究CIPK基因家族在应对非生物胁迫应答等过程中的分子机制，探究非生物胁迫下草地早熟禾CIPK32基因的作用。以草地早熟禾午夜Ⅱ号为试验材料，应用RT-PCR技术克隆CIPK32基因，分析该基因在不同组织部位及不同非生物胁迫条件下的表达规律。并通过NCBI-CDD、SWISS-MODEL等在线软件对编码氨基酸序列进行蛋白结构、同源比对等生物信息学分析。结果表明：草地早熟禾CIPK32基因序列ORF为1 320 bp,共编码439个氨基酸。预测CIPK32蛋白相对分子质量为50.28 ku,等电点6.82,蛋白质分子式为C_(2249)H_(3574)N_(608)O_(665)S_(16),属于不稳定亲水性蛋白。草地早熟禾CIPK32含有典型STKc＿SnRK3和CIPK＿C结构域，与山羊草(XP＿020198391.1)、黑麦草(XP＿047091407.1)、大麦(XP＿044980943.1)编码氨基酸同源性较高，并含有酰胺化位置、N-糖基化位点、N-肉豆蔻酰化位点等多个结合位点。草地早熟禾CIPK32基因的表达水平呈现组织特异性，叶部>茎部>根部。干旱胁迫下该基因呈现先上调后下降的趋势，10%PEG6000处理16 h为最高值，是0 h的6.2倍；随着NaCl浓度的升高显著促进该基因的表达，200 mmol/L NaCl是0 mmol/L NaCl的6.9倍；低浓度NaNO_3及低浓度KH_2PO_4(0.1 mmol/L KH_2PO_4)环境均可促进CIPK32基因的表达。综上所述，草地早熟禾CIPK32基因具有组织特异性，干旱、盐、氮素和磷素胁迫均能诱导CIPK32基因的表达。CIPK基因家族在非生物胁迫中具有潜在的作用。

为探讨小G蛋白在玉米盐胁迫响应中的作用,克隆玉米ZmRab7基因并对其生理功能进行初步分析。生物信息学分析表明,ZmRab7基因编码206个氨基酸,包含保守的G1-G5基序和C末端Cys位点;系统进化分析显示,玉米ZmRab7蛋白与同为单子叶植物的高粱SbRab7亲缘关系最近;ZmRab7蛋白在二级结构和三级结构上由4个α-螺旋和多个β-折叠、无规卷曲组成功能域,且与双子叶植物拟南芥AtRab7空间结构高度相似。进一步研究发现,ZmRab7主要在玉米的根及幼胚中表达;该基因启动子区含有4个GT1GMSCAM4和2个DRECRTCOREAT盐胁迫响应元件,高盐能够轻微抑制其表达;酵母生长试验证实,ZmRab7-pYES2转基因酵母表现出盐胁迫不耐受表型。这些结果说明,玉米ZmRab7基因编码1个响应盐胁迫的Rab类小G蛋白,为进一步详细阐明玉米中Rab类蛋白的生理功能奠定了基础。

为探究在非生物逆境胁迫条件下免疫亲和素（immunophilins）基因家族在水稻（Oryza sativa L. japonica Nipponbare）中的功能，利用生物信息学技术鉴定水稻中免疫亲和素基因家族成员，并进行克隆及组织特异性、非生物逆境胁迫下的表达分析。结果表明，水稻基因组中存在30个OsFKBPs及29个OsCYPs免疫亲和素家族基因。30个OsFKBPs主要聚类为3个大的亚群，29个OsCYPs主要聚类为4个大的亚群。通过PCR扩增得到完整的OsFKBPs与OsCYPs基因编码序列，且序列信息与预测一致。OsFKBPs与OsCYPs基因在水稻的各个组织、各个发育时期均有不同程度的表达。OsFKBP19在各组织各发育时间表达量较为一致；OsCYP29在叶鞘中表达量最高而OsCYP57在根中表达量最高。定量PCR结果显示，在高光强胁迫处理4 h后水稻叶片中OsCYP37基因被诱导持续上升表达，而在渗透胁迫及盐胁迫处理中无显著变化；高光强及渗透胁迫处理4 h后水稻叶片中OsFKBP19持续上升表达，而在盐胁迫处理中波动上升表达。综上，OsFKBPs及OsCYPs参与水稻的高光强、渗透胁迫及盐胁迫应答过程。

为研究蛋白激酶B (Akt)在许氏平鲉(Sebastes schlegelii)应答细菌胁迫过程中的作用，本研究应用PCR技术对许氏平鲉Akt基因(SsAkt)的编码区序列进行了克隆和特征分析，并应用实时荧光定量PCR技术检测了健康许氏平鲉各组织和细菌胁迫后肾脏、血液、肝脏中SsAkt mRNA的表达规律。结果显示，SsAkt的开放阅读框(ORF)的长度为1440 bp，编码479个氨基酸，预测其蛋白的相对分子质量为55.80 kDa，理论等电点(pI)为5.64。SMART分析显示，SsAkt蛋白含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的3个特征性保守结构域和2个磷酸化位点。同源比对发现，SsAkt与鱼类的同源性较高，与尖嘴鲈(Lates calcarifer)的相似度最高，为99.37%。组织表达分析显示，SsAkt在许氏平鲉健康组织(血液、鳃、肝脏、肌肉、肾脏、脾脏、肠、脑和心脏)中均有表达，在肾脏、脑和血液中的相对表达量较高。许氏平鲉响应细菌胁迫的表达结果显示，藤黄微球菌(Micrococcus luteus)感染后，SsAkt在3种组织中的表达明显上调，呈现先上升后下降的趋势；鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后，SsAkt在3种组织中呈现出不同的表达趋势：在肾脏中，SsAkt的表达趋势为先上升后下降又上升再下降，而在血液和肝脏中的表达趋势为先上升后下降。以上研究表明，SsAkt响应了外源微生物对许氏平鲉的胁迫，在抵御外源微生物免疫应答过程中发挥重要作用。本研究结果为许氏平鲉的免疫机理研究奠定了基础。

【目的】克隆内蒙古白绒山羊AKT基因cDNA并分析其基本表达模式。【方法】RT-PCR克隆AKT基因cDNA。通过在线软件BLAST进行核酸序列分析,用SMART与Psite进行氨基酸序列分析。半定量RT-PCR检测AKT基因在绒山羊组织中的表达特异性。Western blotting检测绒山羊胎儿成纤维细胞中AKT表达。【结果】克隆到的内蒙古白绒山羊AKT基因cDNA片段长1 443 bp,包含了编码480个氨基酸残基的全长ORF,氨基酸序列与绵羊(NM_001161857.1)同源性为97%。SMART分析表明,ORF编码的蛋白包含了可与3-磷酸肌醇结合的PH结构域及具有丝氨酸/苏氨酸激酶...

【目的】分析小麦质膜蛋白基因TaPM19-1的特征及其对非生物胁迫的响应,并探讨其在小麦抗逆调控过程中的生物学功能。【方法】利用RACE技术克隆了该基因cDNA全长,采用生物信息学方法分析克隆基因编码蛋白的特性,并通过半定量RT-PCR分析该基因在非生物胁迫条件下的表达特性。【结果】TaPM19-1的cDNA全长1 090 bp,无内含子,编码蛋白包含182个氨基酸,分子量为19.02 kD,包含有典型的AWPM19保守域;依据氨基酸序列将来源于不同植物的16个AWPM19类蛋白分为3组,TaPM19-1与2个来源于大麦及1个二穗短柄草的AWPM19类蛋白亲源关系最近,同属于第三组。高级结构分...

【目的】克隆强抗寒性牧草短芒大麦钙依赖蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinase,CDPK)基因,分析其生理生化特性,为理想抗逆工程基因的筛选和利用奠定基础。【方法】采用RACE-PCR技术,获得短芒大麦CDPK基因全长cDNA序列;采用Northern杂交分析该基因在逆境条件下(低温(4℃)、干旱(200 g/L PEG6000)、盐(300 mmol/L NaCl)、激素(100μmol/L ABA))的表达模式;采用农杆菌介导的方法,对该基因编码蛋白进行亚细胞定位,并对转基因烟草的离子渗漏率和脯氨酸含量进行测定。【结果】获得了短芒大麦CDPK基因的编码序列...

【目的】研究马铃薯蛋白激酶基因StPK1,为在马铃薯抗病反应中的功能提供证据。【方法】利用TAIL-PCR技术,从马铃薯晚疫病水平抗性、垂直抗性和感病等3种材料中,分别克隆了该基因的启动子区域。此外,将从水平抗性材料中克隆得到的启动子与GUS连接构建植物表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化法转化本氏烟(Nicotiana benthamiana),将得到的转基因烟草分别用水、晚疫病原菌或水杨酸(SA)溶液处理,并进行表达活性分析。【结果】3个启动子长度分别为922、929和922 bp,均具有TATA-box和CAAT-box以及多种与抗病反应和基因时空表达有关的元件,而三者的主要差异是个别碱基...

蛋白激酶C(PKC)广泛参与哺乳动物T、B淋巴细胞涉及的免疫反应并发挥重要作用,然而PKC在鱼类免疫过程中的作用却少有报道。本研究在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)中克隆了PKC家族的典型成员PKCα(命名为CsPKCα),并进行了分子特征和表达模式分析。CsPKCα的cDNA全长为2315 bp,其中,开放阅读框(ORF)为2013 bp。qRT-PCR分析显示,CsPKCα在各个组织中广泛表达,其中,在鳃、肝脏、皮肤和肠中具有较高的转录水平,表明CsPKCα可能在免疫过程中发挥作用。随后检测了CsPKCα在哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)感染后6种免疫相关组织(鳃、肝脏、皮肤、肠、脾脏和肾)中不同时间点的表达水平,发现细菌侵染后24 h或48 h,CsPKCα在鳃、肾脏、皮肤和脾脏中显著上调,侵染后12 h在肝中有显著性下调。研究表明,CsPKCα可能在应对哈维氏弧菌的免疫应答中发挥作用,但是否参与病原菌侵染的巨噬细胞激活以及与T、B细胞相关的信号通路还需要进一步研究。这是关于PKCα参与鱼类细菌性免疫反应的首次报道。

为探讨蓖麻钙依赖蛋白激酶29基因(RcCDPK29)在蓖麻耐盐中的作用，以蓖麻叶片为材料，设计特异性引物，克隆蓖麻钙依赖蛋白激酶29基因(RcCDPK29),并对所得序列进行生物信息学分析。结果表明，蓖麻钙依赖蛋白激酶29基因(RcCDPK29)序列全长1 590 bp;编码528个氨基酸；蛋白分子量为59.74 ku;等电点(pI)值6.21;是典型的非跨膜蛋白；亲水性数值为负值，属于亲水性蛋白；RcCDPK29蛋白α-螺旋占比最高有228个；RcCDPK29与拟南芥CDPK(SMTL ID:3q5i.1)相似度为40.41%,具有较高可信度(>30%)。将木薯、麻枫树、巴西橡胶树、柑橘、石榴、毛果杨与蓖麻RcCDPK29氨基酸序列进行同源性比对。其中，与麻枫树的同源性最高，为82.29%。RcCDPK29蛋白包含1个Ser/Thr蛋白激酶催化结构域和4个与Ca~(2+)结合的EF-hand型结构域。通过qRT-PCR技术，分析RcCDPK29在不同水平盐胁迫下蓖麻不同组织中的表达，结果表明，RcCDPK29基因主要在茎中表达，盐处理12 h表达量最高。随着盐处理时间的延长，RcCDPK29基因根的表达量逐渐下降，分别在2,8,24 h达到最低，与0 h差异显著；叶的表达量在2 h的表达量最低且与0 h相比差异显著。根据RcCDPK29全长设计带有SmaⅠ和XbaⅠ酶切位点的引物扩增出序列全长，用SmaⅠ和XbaⅠ进行双酶切后与表达载体pCG-3300连接。成功构建了CRcCDPK29的表达载体。因此，RcCDPK29在蓖麻受到盐胁迫时起重要作用。

【目的】克隆蛋白激酶C基因(PKC)及其启动子,验证该基因拷贝数,同时对PKC的表达规律进行研究,了解该基因在信号转导途径中的激活条件,为进一步研究该基因的功能奠定基础。【方法】首先通过简并引物PCR法获得PKC的同源片段,再利用Genome walking技术克隆片段的3′端和5′端侧翼序列,采用RT-PCR法扩增基因全长,并对基因结构和上游调控元件进行生物信息学分析。利用Southern blotting验证基因拷贝数。最后,利用半定量RT-PCR技术研究玉米大斑病菌在不同碳源、氮源培养以及非生物胁迫条件下,PKC的表达量的变化规律。【结果】获得PKC全长序列及其上游部分启动子区,生物信息...

【目的】盐胁迫影响作物的产量和品质,而作物的耐盐性受特定基因的调控。在前期获得谷子类受体蛋白激酶基因SiRLK35过表达水稻株系的基础上,拟结合植株在盐胁迫下的表型,对部分盐胁迫指标及响应基因的表达模式进行检测和验证,解析谷子SiRLK35参与盐害响应的可能机制。【方法】选取谷子SiRLK35过表达水稻株系,分别为过表达株系(over-expression,OE)-1(OE-1)、OE-2和OE-3,以野生型中花11为对照,实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测各株系中SiRLK35的表达情况;分别用含0、150和200 mmol·L~(-1) NaCl的MS培养液处理三叶期的对照及转基因株系幼苗,观察其表型,统计150 mmol·L~(-1) NaCl处理3d后苗长及根长;用150 mmol·L~(-1) NaCl处理四叶期幼苗,统计处理14 d后材料干重、死亡率和死叶率,对各材料的耐盐性进行评价;进一步挑选SiRLK35过表达程度高且耐盐表型好的OE-1株系,利用3,3’-二氨基联苯胺(3,3’-Diaminobenzidine,DAB)和氮蓝四唑(nitrotetrazolium blue chloride,NBT)染色检测其胁迫下过氧化物积累及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化物酶(peroxidase,POD)的活性;并对部分盐害响应基因的表达模式进行检测。【结果】谷子SiRLK35在株系OE-1中的相对表达量最高;150 mmol·L~(-1)NaCl处理3 d幼苗后,中花11苗长和根长的生长受抑制程度均大于SiRLK35过表达株系,其中OE-1的受抑制程度最小;四叶期幼苗经150 mmol·L~(-1) NaCl处理14 d后,转基因株系地上部和地下部干重降低幅度均低于对照,且幼苗死亡率和死叶率均低于对照;盐胁迫下对照过氧化染色反应明显,O~(2-)和H_2O_2的积累均高于过表达植株,SOD和POD抗氧化酶活性均高于对照;部分盐害响应基因在SiRLK35过表达株系中表现为上调,其中,OsLEA3在盐处理24 h的相对表达量是对照中的1.9倍。【结论】谷子SiRLK35异源转化水稻获得的过表达株系对盐胁迫具有一定的抗性,SiRLK35可通过调控抗氧化酶活性及相关信号途径,从而参与盐害响应。

采用qRT-PCR、RACE等方法,获得了拟穴青蟹丝裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK)基因cDNA全长序列。该基因全长1 558 bp,开放阅读框长度为1 224 bp,编码407个氨基酸残基。同源分析显示,该基因编码的蛋白与昆虫的相似性高达70%,推测MAPKK基因在节肢动物具有较高的保守性。经荧光定量PCR检测,MAPKK基因在拟穴青蟹多个组织中有表达,且在脑神经节和卵巢中表达量较高。在拟穴青蟹卵巢发育过程中,MAPKK基因在卵巢发育期(Ⅲ期)表达量最高,发育期为卵母细胞快速生长期,推测MAPKK具有促进卵母细胞快速生长的作用。

【目的】蛋白磷酸化在介导非生物逆境信号的转导中具有重要作用。以笔者在低磷胁迫下鉴定的小麦促分裂原活化蛋白激酶(MAP激酶)基因TaMPK1a-1为基础,开展该基因应答低磷逆境分子特征的研究。【方法】利用cDNA-AFLP技术,鉴定特异上调表达的MAP激酶基因TaMPK1a-1。采用生物信息学技术研究基因结构和编码蛋白特征,采用半定量RT-PCR技术研究TaMPK1a-1应答低磷胁迫逆境的分子特征。【结果】TaMPK1a-1 cDNA长度为2170bp,开放阅读框为1737bp,编码578个氨基酸残基。TaMPK1a-1含有2个参与双重磷酸化作用的TEY和TDY基序。在正常供磷条件下,磷高效品种...

从甘蔗蔗茎cDNA文库中获得1个TRXⅠ类第3亚组成员的硫氧还蛋白家族基因全长cDNA序列,命名为ScTRXh2(登录号:KF921298).该基因全长752 bp,开放阅读框长381 bp,5'非翻译区长57 bp,3'非翻译区长314 bp,编码126个氨基酸残基,氨基酸序列与拟南芥TRXs具有高度同源性.实时定量PCR检测显示,该基因在甘蔗中为组成型表达,叶片和蔗茎中的表达量显著高于根和芽.在H2O2和PEG逆境胁迫下,甘蔗ScTRXh2基因的应答模式基本相同,呈现初期(3 h)略微下调,早中期(6 h或12 h)表达量明显上调,中后期(24、48、72 h)显著下调并维持基本稳定的低水...