[目的]克隆草原短尾羊Brachyury基因(即T基因)编码区(CDS),并制备Brachyury蛋白特异性多克隆抗体,为草原短尾羊短尾表型机制研究提供重要的试验材料。[方法]提取草原短尾羊16 d胚胎的组织RNA,反转成cDNA,以cDNA为模板,采用PCR方法克隆草原短尾羊Brachyury基因CDS全长序列。将Brach yury基因CDS全长序列连接至pEASY~?-Blunt E1载体,构建原核表达载体pEASY~?-Blunt E1-Brach yury,并进行NheⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定。将原核表达载体导入RosettagamiB(DE3)大肠杆菌,并进行IPTG诱导表达,对表达产物进行回收纯化。利用纯化后的表达产物免疫6周龄日本大耳白兔,用间接ELISA(iELISA)法测定血清多克隆抗体效价。以制备的多克隆抗体为一抗,采用Western blot法检测草原短尾羊16,20,25和30 d胚胎中Brachyury蛋白的表达水平。[结果]克隆了1335 bp的草原短尾羊Brachyury基因CDS全长序列,成功构建了原核表达载体pEASY~?-Blunt El-Brachyury,表达获得了49.16 ku的重组Brachyury蛋白。成功制备了重组Brachyury蛋白多克隆抗体,抗体效价达1:1 500,该多克隆抗体可以特异性识别草原短尾羊胚胎中的Brachyury蛋白。草原短尾羊16d胚胎中Brachyury蛋白的表达量最高。[结论]成功制备草原短尾羊Brachyury蛋白兔血清多克隆抗体,抗体效价为1:1 500,该多克隆抗体可以特异性识别草原短尾羊胚胎中的Brachyury蛋白。

【目的】原核表达奶山羊表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)蛋白胞外区25-644位共620个氨基酸序列(ECD序列),纯化蛋白并免疫家兔,制备针对山羊EGFR蛋白的特异性多克隆抗体,为山羊EGFR蛋白功能研究奠定基础。【方法】以pMD19-T-EGFR为模板,采用PCR方法扩增得到EGFR胞外区(ECD)基因序列。将ECD序列连接pET-32a(+)质粒构建pET-32a(+)-ECD原核表达载体,将该重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导

【目的】构建溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核表达载体,优化OmpK蛋白的诱导表达条件,制备OmpK蛋白小鼠多克隆抗体。【方法】通过PCR扩增获得ompK基因,连接pET-32a质粒构建OmpK-pET32a载体,将其转化大肠杆菌BL21后进行诱导表达。利用切胶纯化获得OmpK蛋白后,免疫小鼠制备OmpK蛋白多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体效价,Western-Blotting法检测抗血清特异性。通过正交试验,获得OmpK菌株的最佳诱导表达条件与培养条件。【结果】PCR扩增获得了长816bp的ompK基因;成功构建了OmpK-pET32a载体,其诱导表达产物分子质量为30ku,与预期结果一致。E...

为构建小鼠BMP3蛋白原核表达载体,纯化BMP3蛋白,制备并鉴定BMP3蛋白小鼠多克隆抗体,以及对BMP3进行系统进化关系研究。采用RT-PCR方法从小鼠肝脏中克隆获得BMP3蛋白的表达菌株;利用SDS-PAGE电泳切胶纯化、尿素梯度复性获得BMP3蛋白,免疫小鼠制备BMP3蛋白多克隆抗体;采用ELISA法检测抗体滴度达1∶3 200倍,Western Blotting证实抗血清具有很好的特异性。通过DNAMAN软件对BMP3序列同源性分析发现其C-端在不同动物间存在较高同源性;MEGA软件对BMP3序列的系统发生分析证实BMP3在动物间具有明显的进化趋势。为BMP3蛋白调控骨代谢及与肿瘤的关...

为研究L蛋白在乌鳢水泡病毒(snakehead vesiculovirus, SHVV)增殖过程中发挥的作用,扩增SHVV L基因的前900个碱基,将其克隆到载体pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET32a-L,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。设置不同温度、IPTG浓度及诱导时间,选择最佳的表达条件。通过NI-NTA亲和层析柱纯化蛋白,并利用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。用Western blot鉴定抗体特异性,间接免疫荧光观察L蛋白在SHVV感染斑点叉尾鮰卵巢细胞(channel catfish ovary, CCO)中的定位情况。结果显示,纯化的L蛋白分子质量约42 ku,与预期大小相符。制备的L蛋白多克隆抗体可以与L蛋白发生特异性免疫反应,且L蛋白主要定位在细胞质,表明L蛋白多克隆抗体制备成功。

为探讨干扰素3(Interferon 3,IFN3)在抗病毒免疫应答中的作用,以草鱼(Ctenopharyngodon idella)巨噬细胞cDNA为模板,PCR扩增IFN3成熟肽基因序列,制备草鱼IFN3蛋白的多克隆抗体,同时研究了IFN3在草鱼不同免疫组织中的蛋白表达,以及草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)感染草鱼肾细胞系(Ctenopharyngodon idella kidney,CIK)后不同时间点的表达。结果显示,细菌表达的重组IFN3大小约为45 kD,主要以包涵体形式存在;抗体效价约为1∶3 200,制备的多克隆抗体既能识别原核表达的重组蛋白,也能识别个体水平上和细胞水平上的内源蛋白。草鱼主要免疫组织中,肝胰腺和皮肤检测到相应条带。CIK细胞感染病毒后12 h开始检测到IFN3蛋白,随感染时间的延长,IFN3蛋白表达量有所增加。蛋白水平上检测IFN3的表达,为深入研究草鱼的抗病毒免疫机制奠定了基础。

【目的】通过筛选灰飞虱cDNA酵母表达文库发现原肌球蛋白(tropomyosin,Tm)能与水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)P10蛋白发生互作。研究旨在克隆灰飞虱原肌球蛋白基因(Tm),将其在原核细胞中进行表达,纯化Tm蛋白,免疫大白兔并制备其多克隆抗体,为进一步分析Tm在灰飞虱与RBSDV互作过程中的作用提供抗体条件。【方法】根据与之高度同源的Tm基因信息确定灰飞虱Tm的开放阅读框(open reading frame,ORF)。提取灰飞虱总RNA,采用RT-PCR方法从灰飞虱中克隆Tm的ORF,连接至pMD-18T载体后进行测序...

【目的】制备甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg)多克隆抗体,并检测甜菜夜蛾不同发育时期血淋巴中的Vg蛋白表达量变化,为进一步研究Vg转运与利用机制以及生物学功能打下基础。【方法】以羽化24 h的甜菜夜蛾雌成虫c DNA为模板,通过PCR扩增得到甜菜夜蛾Vg基因片段,其包含vitellogenin-N结构功能区。将Vg目的片段连入pMD-19T载体后进行测序,利用DNAMAN软件分析该基因序列的准确性及编码蛋白的特性。将测序正确的Vg基因片段通过Nde

采用SDS-PAGE分离纯化彩鲫(Carassius auratus gibelio)ran基因编码区cDNA全长序列的原核表达蛋白,并以此为抗原免疫家兔,制备了相应的多克隆抗体;W estern b lotting结果表明,该抗体效价为1∶1000,具有较高的特异性。并从抗原蛋白相对分子质量、每次注射蛋白量、注射方式、注射途径等诸方面对该技术的要点进行了介绍。

根据FAdV-4 NP株F1蛋白编码框的主要抗原位点,设计一对特异性引物,经PCR扩增、测序,分析表达效率后,进行密码子优化;以合成的新序列作为模板,构建重组表达质粒pET-32a-F1,将质粒转化到BL21中,筛选诱导条件,Western blot鉴定表达产物;将待纯化蛋白依次经过不同浓度的咪唑洗脱,纯化重组蛋白;最后将纯化后的蛋白免疫新西兰黄兔,收集血清并用间接ELISA法测定抗体效价.结果表明,所设计的特异性引物扩增了一条约699 bp的片段.PCR验证和酶切鉴定表明,pET-32a-F1被成功构建,并能够高效表达.重组质粒pET-32a-F1诱导的最佳IPTG浓度为0.3 mmol·L~(-1),最佳诱导时间为5 h,最佳诱导温度为37℃;咪唑洗脱浓度为80 mmol·L~(-1)时,能获得较单一的洗脱蛋白.此外,本试验制备的F1多克隆抗体的效价可达1∶1 024 000.

【目的】利用朊蛋白双基因敲除(PRNP-/-)羊制备朊蛋白多克隆抗体,并对其特性进行分析。【方法】构建山羊朊蛋白(PrP)原核表达载体,转入大肠杆菌并诱导表达,纯化获得羊PrP;将获得的PrP免疫PRNP-/-山羊,制备朊蛋白特异性的多克隆抗体;并对获得的朊蛋白多克隆抗体进行ELISA及Western-blot检测。【结果】获得了大量的朊蛋白特异性抗血清,间接ELASA检测抗血清中朊蛋白多克隆抗体的效价为25600;Western-blot检测显示所制备抗体不仅可以识别鼠、牛、羊脑组织内源性朊蛋白,而且能识别鼠脑组织内朊病毒。【结论】PRNP-/-转基因山羊可用于制备大量高亲和力朊蛋白多克隆抗...

【目的】制备猪源CD1d的多克隆抗体，为探究猪CD1d蛋白在非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染过程中的功能奠定基础。【方法】利用PCR方法扩增了猪CD1d基因，并将其同源重组至pGEX-6p1载体中，构建了原核重组表达质粒pGEX-6p1-CD1d。将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)并用IPTG进行诱导表达，表达的GST-CD1d重组蛋白经SDS-PAGE和Western blot(WB)方法鉴定，SDS-PAGE结果显示约50 ku处有一条明显的条带，该蛋白以包涵体形式表达。然后利用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析方法进行蛋白纯化，将纯化的GST-CD1d蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化后，将纯化的蛋白免疫新西兰大白兔，采用颈背部多点皮下注射，免疫剂量为200μg/只，首免后第3周和第5周分别进行二免和三免，均采用弗氏不完全佐剂乳化，方法和剂量与首免相同。三免后第7天，通过耳缘静脉采血分离血清。首免后第7周进行第四次免疫，一周后心脏采血。该抗体经Protein G亲和层析纯化后冻存于-80℃冰箱。通过WB和间接免疫荧光（IFA）鉴定瞬时转染表达的外源CD1d蛋白和猪原代巨噬细胞（PAMs）表达的内源CD1d蛋白的表达与细胞定位情况。同样，制备的CD1d抗体可以将外源瞬时转染表达的CD1d通过IP拉下。为了探究CD1d在ASFV感染早期的情况，将ASFV接种于PAMs，制备ASFV感染0、15、30、60 min的样品，以CD1d为一抗，通过WB检测了CD1d蛋白的表达情况。在HEK293T细胞共转pCAGGS-HA-CD1d和pCAGGS-Flag-CD2v质粒，24 h后收取细胞裂解，加入Flag beads过夜结合蛋白，通过WB检测互作情况染，同时，质粒共转染于共聚焦小皿中的HEK293T细胞，用标签抗体对其进行孵育，选择相应的荧光二抗，通过激光共聚焦显微镜观察CD1d与CD2v在细胞中共定位情况。采用Co-IP验证CD1d与ASFV外囊膜蛋白CD2v的相互作用。【结果】原核表达的GST-CD1d蛋白以包涵体形式表达在感受态细胞中，分子质量约为35 ku；实验兔4次免疫CD1d重组蛋白后采血并分离血清，纯化的抗体经SDS-PAGE检测在45和25 ku处各出现一条特异性条带，分别为CD1d抗体的重链与轻链。以纯化的CD1d蛋白作为免疫原制备的兔抗CD1d抗体包含重链和轻链，且具有较好纯度；该抗体能够通过WB和IFA鉴定瞬时转染的外源以及PAMs内源CD1d蛋白的表达和细胞定位。进一步检测结果显示，ASFV感染PAMs后，CD1d蛋白表达水平明显增加，并且WB和IFA结果显示CD1d与ASFV编码的外囊膜蛋白CD2v存在相互作用和共定位。【结论】通过原核表达技术制备了CD1d的抗体，为进一步探究CD1d蛋白在ASFV感染过程中的生物学功能打下了基础。

提取睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)基因组DNA,PCR扩增teiR基因,将扩增产物克隆到pET28a中,经酶切验证后获得teiR基因表达载体pET28a-teiR.将重组质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21,添加终浓度为1 mmol.L-1的IPTG进行诱导,提取细菌总蛋白进行蛋白的SDS-PAGE电泳.并根据融合蛋白特性,利用Ni-NTA Spin Column对TeiR融合蛋白进行分离纯化,经分离纯化后的重组蛋白在SDS-PAGE上呈现出单一条带.进一步以获得的TeiR融合蛋白为抗原,制备兔抗TeiR多克隆抗体,经ELISA测定该抗...

为探讨玉米AGPL2在籽粒发育时期淀粉积累过程中的功能机制,通过AGPL2基因克隆和构建带有GST标签的原核表达载体PGEX-6 T-1-AGPL2,并利用大肠杆菌诱导表达体系,用0. 5 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在28℃条件下诱导表达6 h后,GST-AGPL2融合蛋白能够得到高水平表达,然后利用GST(Glutathione S-transferase)标签蛋白纯化介质进行亲和层析纯化,能够得到质量较高的GST-AGPL2融合蛋白;利用纯化所得的GST-AGPL2重组蛋白免疫新西兰大白兔制备了AGPL2多克隆抗体,分离并纯化抗血清,然后用rTEV Protease去除抗原GST-AGPL2融合蛋白的GST标签,并用纯化后的AGPL2多克隆抗体进行Western Blot检测,结果发现,AGPL2多克隆抗体具有较高特异性和灵敏性,可用于检测纳克级抗原蛋白;并利用Western Blot方法研究了AGPL2蛋白在玉米不同组织和不同授粉时期胚乳中的分布和表达模式,结果显示,AGL2蛋白在玉米不同组织中的表达具有组织特异性,且在胚乳中含量最高。AGPL2蛋白在玉米胚乳不同授粉时期表达量先增加后降低,且在授粉中期达到最大值。其结果与玉米籽粒发育过程中淀粉的积累规律一致,说明AGPL2主要存在于玉米胚乳中,且可能参与淀粉的合成,也说明AGPL2多克隆抗体具有很好的特异性,能够识别玉米体内的AGPL2抗原。

针对CyHV-2病毒ORF121基因(GenBank:AFJ20543.1)进行原核表达系统的构建,将纯化重组蛋白作为抗原来免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,应用该抗体开展CyHV-2病毒诊断及其感染机制研究。以CyHV-2病毒感染细胞上清液为扩增模板,扩增ORF121基因构建至pGEX-4T原核表达载体,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达rORF121重组蛋白,利用尿素纯化后免疫6周龄BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,CyHV-2病毒ORF121基因可在原核表达系统中高效表达目的重组蛋白rORF121,经SDS-PAGE分析大小约为60 ku,主要以不可溶的包涵体存在。利用尿素溶解rORF121蛋白免疫BALB/c小鼠获得抗ORF121蛋白的多克隆抗体,Western Blot实验显示,该抗体可特异性识别CyHV-2病毒感染RyuF-2细胞样品。研究表明,利用CyHV-2感染RyuF-2细胞后,本研究制备的抗ORF121蛋白的多克隆抗体能够通过间接免疫荧光实验特异性识别CyHV-2病毒感染的细胞样品。本研究制备的抗ORF121蛋白的多克隆抗体,能够为CyHV-2病毒诊断技术的构建以及深入开展CyHV-2病毒感染机制提供良好的技术基础。