采用能有效转化双子叶植物的表达载体pBI121构建植物硒营养代谢关键酶基因的表达载体,将原载体中GUS基因用茶树ATP硫化酶基因(APS1和APS2)替换,将硒半胱氨酸甲基转移酶基因(CsSMT)连接到pBI121载体上直接与GUS基因相连,分别构建了目的基因植物表达载体pBI-APS1、pBI-APS2和pBI-CsSMT。通过三亲杂交法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,获得转化工程菌,为通过植物基因工程获得富硒农产品打下基础。

为揭示茶树(Camellia sinensis)硒代半胱氨酸甲基转移酶(Selenocysteine methyltransferase,SMT)基因CsSMT的生物学功能及其分子调控机理,利用生物基因组学数据库和生物信息学分析软件,对CsSMT进行生物信息学分析,预测该基因编码产物的理化性质、结构与功能,同时构建CsSMT同源基因的系统进化树。结果表明:CsSMT基因cDNA全长1368 bp,开放阅读框位于50~1105 bp处。编码产物为稳定的亲水性蛋白,分子式为C1670H2645N459O532S15,无跨膜结构,无信号肽,定位于细胞质基质。二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,三维建...

【目的】克隆茶树(Camellia sinensis)的一个类黄酮O-甲基转移酶基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,为进一步研究其酶学特性和调控茶树中甲基化类黄酮物质的代谢机理奠定基础。【方法】采用同源克隆法,以从茶树叶片中提取的总RNA为模板,结合RT-PCR与RACE克隆技术获得该基因cDNA全长,测序正确后将该基因片段连接到原核表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21并诱导表达。【结果】该基因cDNA全长为1 246 bp,其开放阅读框为1 077 bp,编码358个氨基酸,推测的蛋白分子量为40.2 kD,理论等电点为5.62;...

本研究根据脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)转录组序列,采用c DNA末端快速扩增技术克隆获得了脊尾白虾丝氨酸羟甲基转移酶基因(SHMT)。该基因c DNA全长为1855 bp,其中,开放阅读框为1407 bp,5?端非编码区为39 bp,3?端非编码区为409 bp,共编码468个氨基酸,预测蛋白质的分子质量为152.55 kDa,理论等电点为4.90。同源性分析显示,脊尾白虾SHMT基因与甲壳类动物真宽水蚤(Eurytemora affinis)同源性最高,为96%。荧光定量分析结果显示,SHMT基因在脊尾白虾眼柄、胃、肝胰腺、心脏、鳃、肠、肌肉、腹索神经、皮下脂肪以及卵巢中均有表达,其中,卵巢表达量最高,心脏次之。不同浓度Cd2+胁迫结果显示,其在低浓度(0.0100、0.0175和0.021 mmol/L)Cd2+胁迫中的表达模式基本一致,呈先升高后下降再升高再下降的趋势;而在高浓度(0.0278 mmol/L)Cd2+胁迫中,该基因表达量很低,甚至不表达,说明高浓度Cd2+胁迫可以抑制该基因的表达,具体机制有待进一步研究。

丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)在植物应答逆境胁迫中发挥着重要作用。本研究以坛紫菜(Pyropia haitanensis)为研究材料,采用普通PCR技术克隆得到2条坛紫菜的SHMT全长基因序列,分别命名为PhSHMT-1(GenBank收录号:MF687405)和PhSHMT-2(GenBank收录号:MF687406)。其中,PhSHMT-1序列全长1710 bp,包含一个1491 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含497个氨基酸,分子量为121.443 kDa,等电点为4.93;PhSHMT-2序列全长1957 bp,包含一个1395 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含465个氨基酸,分子量为113.969 k Da,等电点为4.95。多序列比对和系统进化树分析结果确认PhSHMT-1和PhSHMT-2基因属于SHMT基因家族。qRT-PCR定量分析结果表明,高温胁迫条件下,2条PhSHMT基因的表达模式基本一致,均表现为先上调后下调再上调的趋势,这说明SHMT基因可能在坛紫菜应答高温胁迫过程中发挥作用。

本研究采用SMART RACE方法克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)Dnmt2(Pt Dnmt2)基因。该基因c DNA全长为1291 bp,开放阅读框为1203 bp,编码400个氨基酸。结构域分析显示,PtDnmt2基因有典型的C5-DNA甲基化酶结构域。同源分析表明,PtDnmt2氨基酸序列与其他物种有较高的同源性。系统进化分析显示,三疣梭子蟹PtDnmt2氨基酸序列与罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)Dnmt2关系最近。qRT-PCR结果显示,PtDnmt2基因在三疣梭子蟹所有组织中均有表达,在卵巢中表达量显著高于其他组织(P<0.05)。PtDnmt2基因在胚胎和幼体发育过程中的表达量随发育时期而变化,其在受精卵和多细胞时期无表达,从囊胚期开始出现,随着胚胎的发育表达量逐渐上升。在性腺发育不同时期PtDnmt2基因表达量存在显著差异,其在卵巢II期表达量最高,之后逐渐下降;在精巢中该基因的表达量随着精巢的发育逐渐上升,在IV期达到峰值。本研究结果表明,PtDnmt2基因参与了三疣梭子蟹胚胎、幼体和性腺发育调控。

为探讨鸡甲基转移酶样蛋白５（Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ５，Ｍｅｔｔｌ５）基因的序列和结构，采用ｒｔ－ｐＣｒ方法克隆该基因，并用生物信息学方法分析该基因的特征；利用定量ｐＣｒ（ｑｐＣｒ）方法检测Ｍｅｔｔｌ５基因的组织表达模式和母鸡叶酸缺乏对仔鸡腹脂中该基因表达的影响。结果表明，鸡Ｍｅｔｔｌ５基因的ＣＤｎａ序列长度为７０２ｂｐ（Ｇｅｎｂａｎｋ ａＣＣｅｓｓｉｏｎ：ｋＵ３５１６８４），编码２１２个氨基酸；进化树分析表明鸡Ｍｅｔｔｌ５氨基酸序列与野鸭和鸿雁的关系较近，与非洲爪蟾的进化关系最远。鸡Ｍｅｔｔｌ５氨基酸序列包含保守的ａＤｏＭｅｔ＿Ｍｔａｓｅｓ ｓＵｐｅｒｆ．．．

根据家蚕表达序列标签(ESTs),克隆了一个家蚕保幼激素甲基转移酶基因(JHAMT2)的全长cDNA序列。序列分析表明,该基因全长1007 bp,序列分析有4个外显子,定位于家蚕第12号染色体的nscaf 2 993上,推导的编码蛋白序列长度为266AA,有一个甲基转移酶超家族功能位点,与烟草天蛾(Manduca sexta)JHAMT同源性达到38%。JHAMT2基因在家蚕丝腺、特别是中部丝腺组织特异表达,发育时期表现为4龄期有比较高的表达量,5龄期只在5龄第3日有表达,性别差异表现为雄性体内持续表达时间比雌性中长。JHAMT2基因表达受到外源激素MH的负调控和JHA的正调控,雌性对外源昆虫...

【目的】茉莉酸羟基甲基转移酶(jasmonic acid carboxyl methyltransferase,JMT)是植物茉莉酸甲酯生物合成的关键酶,通过克隆紫苏JMT,并研究其在不同胁迫下和种子不同发育时期的表达模式,为研究JMT在植物防御和种子发育中的作用提供理论依据。【方法】根据紫苏种子转录组测序结果设计引物,从紫苏中克隆得到紫苏茉莉酸羟基甲基转移酶基因的DNA和cDNA序列,命名为PfJMT,通过生物信息学分析该基因的结构、稳定性、亲水性、亚细胞定位及保守结构域等,利用系统进化树分析PfJMT和其他物种JMT蛋白的进化关系。取开花期的紫苏根、茎、叶、花等组织用于组织特异性表达分析。取开花后5、10、15、20、25和30 d的种子用于JMT在种子不同发育时期表达模式的研究。用25μmol·L~(-1)茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)和1 mmol·L~(-1)水杨酸(salicylic acid,SA)喷洒处理具有4片真叶的紫苏幼苗并浇灌根部,分别于处理0、2、4、8、16、24和48 h后取样,研究JMT在不同胁迫下的表达模式。【结果】PfJMT的ORF长1 050 bp,编码349个氨基酸。生物信息学分析表明,PfJMT为不稳定的亲水蛋白,亚细胞定位于细胞质,含有一个甲基转移酶-7(Methyltransf-7)保守结构域。通过与其他物种的JMT蛋白多序列比对发现,紫苏JMT和丹参JMT的序列一致度最高,为80.5%,和水稻的序列一致度最低,为36.8%。在对多种不同植物基于JMT蛋白构建系统进化树的分析中发现紫苏和拟南芥、丹参等双子叶植物亲缘关系较近,而与建兰、水稻等单子叶植物亲缘关系较远,说明JMT在单子叶和双子叶植物的进化过程中可能存在较大的差异。荧光定量PCR结果表明,PfJMT在紫苏根和茎中的相对表达量最低,叶和花中的相对表达量比根和茎中略高,在开花后5d的种子中的表达量最高,并且随着种子的发育表达逐渐下调,说明JMT在种子发育中起着重要作用。在使用外源MeJA和SA处理的紫苏根、叶组织中,PfJMT表达均显著下调,这一结果支持JMT可能不直接参与防御反应,而是通过调节JA水平间接参与植物防御的理论。【结论】成功克隆获得PfJMT,随着种子的发育PfJMT表达量逐渐下调,并在外源MeJA、SA胁迫下表达量显著下调。

【目的】肌纤维类型及其转化的调节是改善肉质的重要途径，最新研究表明，m6A RNA甲基化修饰在肌肉的分化中发挥着重要作用。以优良的地方品种——广西麻鸡作为研究对象，研究其性成熟日龄不同部位肌纤维类型的组成差异，探究m6A甲基化转移酶相关基因甲基化转移酶样蛋白3/14 (methyltransferase like 3/14, METTL3/14)、Wilm肿瘤1-相关蛋白（Wilms’ tumor 1-associating protein,WTAP）和病毒样m6A甲基转化酶（vir like m6A methyltransferase associated,VIRMA，也称KIAA1429）在不同部位肌肉组织和成肌细胞分化前后的表达差异，为阐明肌纤维类型组成及转换的调控机理提供参考。【方法】采用ATPase染色法比较广西麻鸡胸部、腿部和背部肌肉群7个部位肌纤维类型、直径和密度等肌纤维性状差异，采用比色法检测成肌细胞分化前后不同时间点内源性m6A甲基化水平，采用实时荧光定量PCR方法检测上述4个基因在广西麻鸡7个部位肌肉以及成肌细胞分化前后的表达差异，并将其与肌纤维性状和m6A甲基化水平进行相关性分析。【结果】广西麻鸡性成熟日龄胸部肌肉群的胸大肌和胸小肌全部由白肌纤维组成，腿部肌肉群的耻坐骨肌内侧头、腓肠肌内侧头和缝匠肌均以红肌纤维为主，而髂胫外侧肌以白肌纤维为主，背部肌肉群的背阔肌则以红肌纤维为主；总体上，红肌纤维比例多的肌肉肌纤维密度显著高于白肌纤维比例多的肌肉。METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1429基因表达存在显著的组织和时间特异性，总体上，在红肌纤维为主的肌肉中的表达量高于白肌纤维为主的肌肉，在分化期成肌细胞中的表达量要显著高于增殖期成肌细胞。肌肉中METTL3、METTL14和WTAP具有相似的表达模式，均在背阔肌中表达量最高，显著高于其他肌肉组织；在耻坐骨肌内侧头和腓肠肌内侧头的表达量次之，显著高于缝匠肌、胸大肌、胸小肌和髂胫外侧肌。KIAA1429基因在腓肠肌内侧头的表达量最高，显著高于其他组织；在背阔肌中的表达量次之，显著高于耻坐骨肌内侧头、缝匠肌、胸大肌、胸小肌和髂胫外侧肌；在胸大肌中表达量最低，但与在胸小肌和髂胫外侧肌中的表达量差异不显著。在鸡成肌细胞中，METTL3和METTL14基因表达变化趋势较为一致，均表现出先持续升高后下降的趋势，在刚分离0 h细胞中的表达量最低，在诱导分化后2 d(D2)细胞中的表达量最高，显著的高于增殖期和诱导分化当天（D0）细胞中的表达量。WTAP和KIAA1429基因表达变化趋势也较为一致，均呈现持续上升的趋势，在刚分离细胞中的表达量最低，显著低于其他时间点，至19 h显著上升，D0天略有增加，接着显著上升至D5天达到高峰。同时发现，随着成肌细胞的分化，内源性RNA m6A甲基化水平逐步上升，分化期的水平显著高于增殖期，在D2天甲基化水平最高，显著高于其他各时间点，随后在D5天显著下降，但略高于D0天。肌肉和成肌细胞中，METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1429基因的表达两两之间均表现出极显著的正相关关系；肌肉中4个基因的表达与红肌纤维比例存在显著的正相关关系，与白肌纤维比例则呈显著的负相关关系；成肌细胞中4个基因的表达与m6A甲基化水平之间也存在正相关关系。【结论】广西麻鸡不同部位肌肉肌纤维类型组成存在差异，所研究的m6A甲基化转移酶4个基因之间协同表达，并可能对鸡肌纤维类型组成、维持及成肌细胞分化具有一定的调控作用。

为了发掘利用茶树（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）富硒关键酶硒代半胱氨酸甲基转移酶（ｓｅｌｅｎｏＣｙｓｔｅｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ｓｍｔ）基因Ｃｓ ｓｍｔ，基于宁州２号转录组测序结果，通过ｒａＣｅ克隆该基因的Ｃ Ｄｎａ全长，并通过原核表达和蛋白质印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）验证该基因，然后构建超表达载体，转化至根癌农杆菌。结果表明：该基因Ｃ Ｄｎａ全长为１２７７ ｂｐ，开放阅读框（ｏｐｅｎ ｒｅａＤｉｎｇ ｆｒａｍｅ，ｏｒｆ）为１ ０５０ ｂｐ，与ｎＣｂｉ公布的茶树该基因ｏｒｆ序列有８个点突变，且缺少ｇｔＣｇｔＣ序列。Ｃｓ ｓｍｔ基因编码３４９个氨基酸，其氨．．．

为了解甲基法呢酯(methyl farnesoate,MF)在中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)卵巢发育中的调控作用,采用离体方法研究了中华绒螯蟹大颚器(mandibular organ,MO)以及X-器官窦腺复合体(X-organ-sinus gland,XO-SG)对卵巢发育的作用。将MO与离体卵母细胞共培养作为实验组1,将MO和XO-SG与离体卵母细胞共培养作为实验组2,仅添加培养液的卵母细胞作为对照组。实验发现,蟹去眼柄(eyestalk ablation,ESA)后的第1、3、6、14天,同对照组相比,MO对其卵母细胞的发育均有极显著促进作用。ESA处理第6天,MO对...

【目的】克隆龙眼咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(DLCCoAOMT)基因,分析其序列特征和在低温胁迫下不同组织中的表达情况并进行原核表达研究。【方法】采用RT-PCR和RACE技术从龙眼叶片中克隆DLCCoAOMT基因,用生物信息学方法对获得的氨基酸序列进行分析,利用荧光定量PCR研究DLCCoAOMT基因在不同组织中的表达。【结果】克隆得到DLCCoAOMT基因,GenBank登录号为JN093023。该cDNA全长993 bp,具有1个744 bp的完整开放阅读框(ORF),编码247个氨基酸。序列分析表明,DLCCoAOMT编码的氨基酸序列与其它植物的CCoAOMT蛋白有很高的相似性。系统...

黄烷酮-3-羟基转移酶(F3H)是植物黄酮合成途径上游的一个关键酶,它催化黄烷酮C3位羟化,形成二氢黄酮醇。构建长叶红砂Rt F3H3基因酵母表达载体,为进一步研究Rt F3H3基因功能奠定基础。基于高通量转录组测序结果,利用RT-PCR技术克隆获得长叶红砂F3H3(Rt F3H3,GenBank登录号LC055546)基因,其开放阅读框长1 014 bp,编码338个氨基酸,推测蛋白分子量为38.46 k Da,理论等电点为5.7。通过定量RT-PCR研究发现,Rt F3H3在茎中表达量较高,在根和叶中表达量较低。不同程度Na Cl(100,300,500 mmol/L)和不同时间UV(12...

半胱氨酸蛋白酶是一类重要蛋白水解酶,其广泛参与植物的生长发育及各种生物与非生物胁迫的应答。根据EST序列信息设计引物,从橡胶树的根中分离到1条1 056 bp的c DNA。该序列包含1个1 023 bp的开放阅读框(ORF),13 bp的5'UTR和20 bp的3'UTR。ORF预测编码340个氨基酸,相对分子质量为37 350,等电点为5.24,属于液泡定位的分泌型蛋白。该蛋白含有1个Inhibitor_I29和1个Peptidase_C1A结构域,可归为木瓜蛋白酶C1家族。该蛋白与蓖麻(Ricinus communis)和杨树(Populus trichocarpa)中同源蛋白的相似性都在...