为了在烟草中合成咖啡碱,将咖啡碱合成酶(Tea caffeine synthase,TCS)基因cDNA全序列克隆到双元载体pBI121中,通过农杆菌叶盘转化法将TCS基因成功转入烟草,结果得到72株转基因烟草植株。对其中3株转基因植株进行PCR检测和PCR-Southern检测,证实TCS基因已整合到基因组中;RT-PCR和Northern分析显示,TCS在这些植株中均能正常转录。用从转基因植株中提取的粗酶液进行体外酶促反应,能催化7-甲基黄嘌呤和可可碱向咖啡碱的转变,由此表明,转基因烟草植株中能产生具有正常生物学活性的TCS,但从3株转基因烟草中均未检测到咖啡碱。

通过RT PCR法扩增出茶树咖啡碱合酶 (TCS)cDNA编码区全序列 ,并将其克隆到表达载体pET 32a (+)中 ,得到重组质粒pET TCS ,在表达宿主菌BL2 1trxB (DE3)中高效表达 ,产生相对分子质量约为 6 2 0 0 0的融合蛋白。该融合蛋白包括 112个氨基酸残基的硫氧还原蛋白及 370个氨基酸残基的茶树TCS蛋白。实验结果表明 ,随着诱导时间的延长 ,表达的融合蛋白产量逐渐增加 ,表达蛋白总量最高可达到菌体总蛋白的 39 14 % ;在 15、 2 5和 37℃ 3个不同的诱导温度下 ,均能诱导产生融合蛋白 ,而且产生的总量及其可溶性部分所占比例均随诱导温度升高...

【目的】比较七舍古茶等19份茶树资源的咖啡碱合成酶活性,为选育低咖啡碱茶树品种奠定基础。【方法】以19份茶树资源的鲜叶为试材,粗提咖啡碱合成酶,体外进行咖啡碱合成的酶促反应并用高效液相检测各反应体系的咖啡碱含量,比较不同茶树嫩叶的咖啡碱合成酶的活性。【结果】七舍古茶的咖啡碱合成酶活性最高,为0.386 U/mL;其次是保靖黄金茶、黄金叶,分别为0.661和0.090 U/mL;盘县古茶的咖啡碱合成酶活性最低,为0.038 U/mL;龙井长叶等其余15份茶树资源的咖啡碱合成酶活性差异不大,在0.043~0.07 U/mL。【结论】盘县古茶树可以作为低咖啡碱品种选育的基础材料。

【目的】茶树咖啡碱合成酶1(TCS1)是山茶属(Camellia)茶组植物咖啡碱合成的关键酶,TCS1具有丰富的等位变异。从我国丰富的茶树种质资源中发掘TCS1稀有等位变异并研究其功能,深入解析茶树咖啡碱合成机制,为低咖啡碱育种提供新的基因资源。【方法】利用特异引物TCS1P InDel F/R对673份茶树资源中的TCS1等位变异进行鉴定;使用引物TCS1cDNAF/R,从含有新稀有等位变异的茶树资源中克隆基因的cDNA全长序列;利用生物信息学、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和原核表达等方法研究新发现稀有等位基因的功能。【结果】在部分大理茶(C.taliensis)资源中鉴定到一个新的TCS1稀有等位变异,命名为TCS1g。从大理茶资源‘龙陵17’(LL17,含有的TCS1等位变异为TCS1a和TCS1g)中克隆了TCS1g。TCS1g的编码区序列全长为1 098 bp,编码365个氨基酸,编码蛋白的分子量和理论等电点分别为40.9 kD和5.1。序列比对结果表明,TCS1g与TCS1a、TCS1b、TCS1c、TCS1d、TCS1e、TCS1f的相似度在94.1%—99.2%;与具有可可碱合成酶活性(TS)的TCS1b和TCS1c编码蛋白序列相似度均大于96.7%,而与同时具有TS和咖啡碱合成酶(CS)活性的TCS1a、TCS1d、TCS1e、TCS1f相似度都小于95.4%,且TCS1g第221位氨基酸残基与TCS1b、TCS1c同为组氨酸(His),而TCS1a、TCS1d、TCS1e、TCS1f为精氨酸(Arg)。第221位氨基酸残基位于TCS1g蛋白活性中心,该位点的突变(His突变为Arg),可以导致TCS1g的等电点(5.05变为5.06)和亲水性(-0.119变为-0.123)发生改变。此外,5′上游调控区域的比对结果显示TCS1g、TCS1b、TCS1c起始密码子(ATG)比TCS1a、TCS1d、TCS1e、TCS1f延后了15 bp。原核表达发现TCS1g具有TS活性,活性为44.3 pkat/mg,但未检测到CS活性。qRT-PCR的结果表明LL17中等位变异TCS1g有表达。LL17的咖啡碱和可可碱的含量分别为40.3 mg·g~(-1)和5.4 mg·g~(-1)。【结论】鉴定并克隆了一个新的TCS1稀有等位变异TCS1g,其在LL17中具有一定的表达水平,且其表达蛋白具有TS活性,而未检测到CS活性;推测决定TCS1g仅具有TS活性的关键位点是第221位氨基酸残基。

对保存于勐海国家茶树种质分圃100份茶树资源的农艺性状、生化成分、加工品质进行鉴定评价,筛选出2份低咖啡碱茶树种质,咖啡碱含量分别为0.07%、0.06%,植物学分类上属厚轴茶(C.crassicolumna);其鲜叶加工的绿茶品质正常,可直接利用或作为低咖啡碱茶树杂交育种的优良亲本。

研究了咖啡碱和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对茶树主要叶部病原真菌生长的抑制作用。结果表明:咖啡碱对茶树4种主要叶部病原真菌(茶炭疽病原菌、茶云纹叶枯病原菌、茶轮斑病原菌、茶赤叶斑病原菌)具有显著的抑制作用,当培养基中咖啡碱质量浓度为1～10mg.mL-1时,抑制率为33.0%～100.0%,对4种病原真菌的有效中浓度EC50分别为0.917、1.860、0.937、1.889mg.mL-1;而EGCG在试验设计浓度下没有明显的抑制作用。为了筛选茶叶中的主要抑菌物质,将咖啡碱、茶粉、茶叶水提物、脱咖啡碱茶叶水提物和茶渣分别添加到PDA培养基中,在培养基上分别接种3种茶树叶部病原真菌(茶轮...

低咖啡碱茶是指在茶叶生产过程中,采取各类咖啡碱脱除手段,使茶制品中的咖啡碱含量降低至一定水平而得到的茶叶精深加工产品。近20年来,国内外针对茶叶脱除咖啡碱进行了系统深入的研究工作,提出了溶剂萃取法、膜分离法、酸洗脱法、离子交换树脂法、热水脱除法和超临界CO2萃取法,以及培育低咖啡碱茶树品种等多种方法降低茶叶中咖啡碱。目前,研究低咖啡碱茶已成为茶叶资源利用、茶叶精深加工及有机食品开发等领域的重要课题。笔者在分析相关文献的基础上,结合正在开展的工作,综述了低咖啡碱茶的研究现状与进展,并展望了其发展前景。

【目的】从茶树中克隆甜菜碱(GB)合成途径中的关键酶——胆碱单加氧酶CsCMO,研究不同逆境胁迫和不同抗寒茶树品种间GB合成中关键基因的表达模式,并分析茶树体内GB的含量,为茶树抗性育种奠定基础。【方法】采用反转录PCR结合RACE技术,从茶树中克隆CsCMO的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析,结合前期克隆得到的茶树甜菜碱醛脱氢酶CsBADH,用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法分析这2个基因的表达模式,紫外分光光度计测定GB含量。【结果】克隆得到茶树CsCMO(GenBank登录号:JX050146)的cDNA全长1 558 bp,包含1 305 bp的完整开放阅读框(ORF...

【目的】探究YUCCA10基因在正常花和不育花中的表达规律,为深入探索YUCCA10基因和生长素合成对茶树花器官发育的调控机制提供理论基础。【方法】前期研究茶树正常花与不育花转录组差异时,获得一条与YUCCA10基因高度同源的基因序列,利用‘云茶1号’茶树全长转录组数据库以及PCR技术克隆验证茶树YUCCA10基因,并对其生物信息学特征进行分析,同时运用qRT-PCR技术研究其表达特征。【结果】经验证YUCCA10基因含有1个1137 bp的开放阅读框,编码379个氨基酸,分子量为42.63 kDa,等电点为8.88,茶树YUCCA10蛋白具有NADPH结合位点和FAD结合位点,与多种植物YUCCA10蛋白同源。qRT-PCR分析CsYUCCA10在正常花中随着花的生长发育表达量增加,而在不育花的花瓣、雄蕊、雌蕊以及不同发育期中的表达均低于正常花。【结论】茶树CsYUCCA10基因在不育花中不能正常合成,从而影响了花的发育导致不育。

咖啡碱(1,3,7-三甲基黄嘌呤)是茶叶中嘌呤碱的主体成份,摄入过量的咖啡碱会对人体产生短期的负面作用,也限制了以保健和治疗为目的茶和茶制品的摄入剂量。近20年来,国内外系统研究了茶叶脱除咖啡碱技术,开发了溶剂萃取法、热水脱除法、超临界CO2萃取法等理化方法,并开始培育低咖啡碱茶树品种等,尤其是通过基因工程创造低咖啡碱茶叶新材料的分子育种呼之欲出。本文是对该领域的一个综述和展望。

【目的】通过转基因烟草验证茶树CsCBF1基因抗寒性功能,为发掘、筛选茶树重要功能基因提供理论依据。【方法】利用根癌农杆菌介导法将构建的表达载体pBI121-CsCBF1导入烟草,通过PCR、RT-PCR和GUS活性染色鉴定外源CsCBF1基因是否导入并整合到烟草基因组上转录表达。然后将转pBI121-CsCBF1型、转pBI121型和野生型烟草分别置于25,4和0℃下处理48h后,检测其膜质通透性、丙二醛(MDA)含量和叶绿素荧光参数Fv/Fm,并将0℃处理3d的转pBI121-CsCBF1型和野生型烟草置于25℃下培养1周后观测恢复表型和统计死亡率。【结果】成功构建表达载体pBI121-C...

为探寻从绿茶中提取咖啡碱的工艺,以二氯甲烷为萃取剂,以咖啡碱得率与纯度为考察指标,采用单因素试验得出较佳茶汤质量分数、料液比(茶汤与二氯甲烷的体积比)、摇匀时间、静置萃取时间、萃取温度、萃取次数和茶汤pH值,选取料液比、摇匀时间、静置萃取时间、萃取温度等4个主要影响因素设计正交试验,并对正交试验结果进行验证。结果表明,以咖啡碱得率为主要考虑因素时,最优工艺参数为茶汤质量分数10%、萃取温度45℃、摇匀时间40 min、静置萃取时间80 min、料液比1∶2.5、萃取2次,此条件下的咖啡碱得率、纯度分别为92.93%、39.58%;以咖啡碱纯度为主要考虑因素时,最优工艺参数为茶汤质量分数10%、...

利用高效液相色谱对5份茶树资源中的咖啡碱、可可碱组分进行测定,发现咖啡碱含量高的茶树资源可可碱含量低,而咖啡碱含量低茶树资源的可可碱被积累。利用RT-PCR分析了S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(sAMS)、次黄嘌呤苷-5-单酸脱氢酶基因(TIDH)、咖啡碱合成酶基因(TCSI)在咖啡碱含量不同的茶树品种间的表达水平差异,并结合咖啡碱含量数据发现,sAMS和TIDH的表达水平对咖啡碱含量变化影响不明显。TCSI在高咖啡碱和低咖啡碱材料中均有表达,且TCSI在高咖啡碱材料中的表达比在低咖啡碱材料中高。推测可能是低咖啡碱茶树资源中咖啡碱合成酶活性低或者存在其他的调控机制,导致咖啡碱的生物合成受阻,使得可...

为探讨生长素过度合成对植物韧皮部发育的影响,利用韧皮部特异表达的拟南芥蔗糖合成酶基因启动子与色氨酸单加氧酶基因(iaaM)重组,构建载体,通过根癌农杆菌介导的叶盘转化法将其转入烟草,获得了转化的烟草植株。大多转基因烟草都表现出叶片卷曲、植株生长异常的生长素过度表型。转基因烟草植株生长较野生型烟草(对照)植株明显迟缓,但其茎横切面韧皮部细胞显著增多,排列更加紧密整齐,木质部也较早开始分化。转基因烟草茎段有大量不定根分化,其根部则在韧皮部薄壁细胞处诱生大量根原基,在不定根上有大量侧根和根毛的分化。

【目的】对茶树GDP-甘露糖-3′,5′-异构酶(GDP-Mannose-3′,5′-epimerase,GME)基因cDNA全长进行克隆分析及原核表达。【方法】以茶树品种"乌牛早"叶片的cDNA为模板,用RT-PCR和RACE技术克隆GME,并对其进行生物信息学分析。利用pETiteTM N-His SUMO Vector构建GME原核表达载体pET-GME,在大肠杆菌HI-Control BL21(DE3)中进行原核诱导表达。采摘同一茶树嫩茎、芽、叶片以及不同品种茶树叶片样品,提取其RNA,反转录合成cDNA后,通过荧光定量PCR分析GME在不同茶树组织和品种中的表达谱。【结果】克隆获得了...