[目的]本文旨在分析苹果差异表达NBS-encoding基因的特征,挖掘在苹果斑点落叶病菌侵染过程中的潜在响应基因。[方法]通过苹果斑点落叶病菌侵染‘红星’后的RNA-seq数据筛选出差异表达的NBS-encoding基因,并利用ProtParam、Pfam、SMART等网站分析了其理化性质;利用R studio软件构建表达热图并分析其表达模式;利用Fast Tree 2软件构建苹果NBS-encoding基因家族的系统进化树,并利用MEGA 6.0软件计算差异表达的NBS-encoding基因所在系统进化支的Ka/Ks值,研究NBS-encoding基因在进化过程中受到的选择压力;利用Cytoscape 3.0软件构建共表达网络图,分析NBS-encoding基因之间的关联性。[结果]共筛选得到了19个差异表达NBS-encoding基因。表达模式分析表明,有3个基因(登录号为MDP0000259862、MDP0000304378和MDP0000292810)可能在响应苹果斑点落叶病的过程中起了关键作用。19个差异表达基因分布在系统进化树的15个进化支中,其中进化支10、12、14、15的平均Ka/Ks值均大于1,说明这些进化支中的基因受到正选择压力的作用,尤其是登录号为MDP0000210357、MDP0000751628、MDP0000147704和MDP0000372663的基因;而其余15个NBS-encoding基因的平均Ka/Ks值均小于1,说明它们受到纯化选择的作用。此外,有16个基因处于同一个共表达网络中,登录号为MDP0000210357、MDP0000240537和MDP0000291205的基因扮演着重要的角色。[结论]19个苹果NBS-encoding基因参与苹果斑点落叶病菌侵染后的响应过程,其中登录号为MDP0000259862、MDP0000304378、MDP0000292810、MDP0000210357、MDP0000240537和MDP0000291205的基因可作为候选基因进行苹果抗病品种选育。

【目的】苹果斑点落叶病在我国各苹果主产区均有发生,给苹果产业造成了严重的经济损失。苹果斑点落叶病是由链格孢苹果专化型(Alternaria alternata f. sp. mali)侵染引起的一种气传病害。本研究旨在探明我国苹果斑点落叶病菌携带dsRNA的情况,为田间防治斑点落叶病提供新的生防资源,并为病毒的多样性以及进化研究提供新的认识。【方法】从全国8个省份采集有典型症状的组织样本,通过组织分离和单孢分离法获得纯培养;通过dsRNA的提取及凝胶电泳明确我国苹果斑点落叶病菌携带dsRNA的情况;通过菌株培养特性、菌丝生长速率、在果实及叶片上的致病力测定揭示携带dsRNA病原菌的生物学性状;通过高通量测序技术、分子克隆技术对QY-2菌株携带的dsRNA病毒进行全基因组序列、基因组结构和系统进化分析。【结果】自我国苹果产区获得102株苹果斑点落叶病菌菌株的纯培养,通过dsRNA的提取及凝胶电泳明确了5个菌株带有明显的dsRNA条带,携带的dsRNA分为4种类型,类型Ⅰ(菌株YT-3-7)dsRNA在8、2.5和1.5 kb左右;类型Ⅱ(菌株SJZ-4)dsRNA在8 kb左右;类型Ⅲ(菌株QY-2)dsRNA在3和0.8 kb左右;类型Ⅳ(菌株CL-2-6和SQ-1-1)dsRNA在2.5和1.5 kb左右。含有dsRNA的菌株培养性状多样,菌落特征、生长速率与dsRNA携带与否及类型没有明显的关系,含有dsRNA的菌株大多属于弱致病力菌株。QY-2在叶片和果实上的致病力均最弱,确定其携带的dsRNA病毒基因组包括5个dsRNA片段,分别为dsRNA1—dsRNA5,片段大小依次为3 665、3 054、2 824、2 819、831 nt,提交至GenBank,登录号分别为MK672910、MK672913、MK672912、MK672911、MK836314。编码蛋白的分子量依次为124、83、84、83、13 kD。经系统进化关系分析,与Alternaria alternata chrysovirus 1遗传关系最近,确定其为产黄青霉病毒科(Chrysoviridae)、β产黄青霉病毒属(Betachrysovirus)的Alternaria alternata chrysovirus,暂定命名为Alternaria alternata chrysovirus 2(AaCV2)。【结论】我国苹果斑点落叶病菌携带dsRNA群体多样,dsRNA的有无及类型与寄主病原菌培养性状没有明显相关性,携带dsRNA的菌株多为弱致病力菌株,致病力最低的QY-2菌株携带AaCV2。该菌株的弱致病力可能具有潜在的应用价值,可为苹果斑点落叶病提供新的生防资源。

采用孢子萌发法和生长速率法分别测定了多菌灵与代森锰锌混配对梨黑星病菌和苹果斑点落叶病菌的增效作用。结果表明 ,5种不同比例的多菌灵与代森锰锌混配制剂对 2种病原菌均具有显著增效作用 ,多菌灵∶代森锰锌为 1∶ 1～ 1∶ 4的混配组合均表现出协同增效作用 ,SR值均 >1.5 ,仅 1∶ 5的混配组合 SR值

为挖掘与叶锈菌萌发及早期侵染相关的关键基因，利用PacBio SMRT和Illumina HiSeq测序技术对叶锈菌夏孢子萌发0、2、4、8、12和24h的孢子和芽管进行转录组测序，通过全长转录本基因表达差异分析和生物信息学分析进行候选基因筛选，利用qRT-PCR技术对候选基因在不同毒力菌系与小麦的亲和/非亲和互作中的表达模式进行系统分析。结果表明：1）综合分析筛选出差异显著且功能相关的4个候选基因，其中，PTTG＿1050为SNARE蛋白的编码基因，可能参与SNARE介导的囊泡运输；PTTG＿4765属于ABC转运蛋白基因家族PDR亚族；PTTG＿1823属于PKc＿Like超基因家族；PTTG＿1279为候选分泌蛋白编码基因。2)4个候选基因在侵染早期受到强烈诱导或抑制，且在亲和互作中表达量高于非亲和互作，说明其在叶锈菌的早期侵染和扩展中发挥了重要作用，可能是早期成功侵染的关键基因。

为了探索植物响应黄萎病病原菌侵染的作用机制，以黄萎病高感野茄材料大理野茄(M239)为研究对象，通过人工接种黄萎病病原菌大丽轮枝菌的方法，首先测定M239在接种大丽轮枝菌后0,6,12,24,48 h的根部4个关键生理指标，即过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性和可溶性蛋白(SP)含量的变化。结果确定接种大丽轮枝菌后12,24 h为蛋白组分析取样的关键时间点；在此基础上，利用iTRAQ技术分析M239在接种大丽轮枝菌后根部蛋白的变化。结果发现，与清水接种(CK)相比，M239接种大丽轮枝菌后12 h有463个差异表达蛋白(DEPs),其中305个下调，158个上调；接种后24 h,有456个DEPs被病原菌诱导表达，包括296个下调，160个上调。这些蛋白主要富集在碳代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、次生代谢物的生物合成、丙酮酸代谢、新陈代谢等途径。通过与已报道的黄萎病抗性材料的研究结果进行对比分析发现，M239在响应大丽轮枝菌的侵染过程中，参与防御响应的蛋白数量和代谢通路较少，未能形成有效的防御网络，最终表现为感病。

【目的】揭示水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)在侵染水稻叶组织早期的基因表达谱差异。【方法】采用GDPs-Finder计算法,设计了能够覆盖KACC10331基因组全部ORFs的定向引物(GDPs),对Xoo与水稻互作1、3和7d的总RNA进行反转录,对病菌cDNA探针进行Cy3/Cy5选择性标记,与含有371个Xoo致病相关基因的芯片进行杂交。【结果】在水稻侵染的不同时期,Xoo致病相关基因表达谱存在差异。与在NBY中生长相比,Xoo在侵染1、3和7d时分别有42个(18个上调和23个下调)、51个(29个上调和22个下调)和33个(16个上调...

目的发掘陆地棉Dirigent-like蛋白基因家族,明确不同黄萎病抗性品种间该基因家族成员的多态性及表达差异。方法利用Illumina Hiseq 2000测序平台,通过RNA-Seq测序技术,获得黄萎病菌侵染陆地棉抗病品种和感病品种的Dirigent-like蛋白基因家族成员Unigene序列;采用生物信息学软件对其进行核苷酸序列及编码蛋白的多重比对和系统进化分析;针对该家族成员设计特异的quantitative real-time PCR引物,在Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System上使用SYBR green PCR试剂盒标记反应产物,棉...

【目的】筛选适合出芽短梗霉菌株PA-2侵染藜的稳定表达的最适内参基因，并进行PA-2侵染下藜光合作用相关基因的表达分析验证。【方法】分别以菌株PA-2孢子侵染0、1、3、5、7 d的藜叶片和正常生长藜的根、茎、叶为供试材料，通过qRT-PCR技术和Ct值评估3个候选内参基因GAPDH、β-ACTIN、β-TUBULIN的表达稳定性，并利用筛选出的内参基因，对藜光合作用相关基因（LFRN、MDH、PetC、psaA、CAB40、psaN、BHY和MO2）的表达水平进行定量分析。【结果】在菌株PA-2侵染藜不同时间点和不同组织的样本中，藜最适内参基因为GAPDH，可用于后续分析光合作用相关基因的表达水平。以GAPDH作为内参基因检测8个光合作用相关基因的表达水平，在不同侵染时间点，8个光合作用相关基因的表达量均出现不同程度的下调，除MDH基因外，其余基因均在5 d时达到最低水平。其中PctC、psaN、CAB40、BHY、MO2基因在藜受侵染0～1 d中下调表达，在3 d达到较高水平，后期表达量下调；pasA先上调表达后下调表达；LFRN在受侵染后持续下调表达；MDH在受侵染后先显著下调，在3 d达到较低水平，后上调表达。在藜受侵染的不同组织中，8个基因在藜叶中均有大量表达，其中MDH基因在茎中大量表达，PctC和CAB40在根中表达量最低，除MDH基因外，7不同组织中基因表达量高低排序为：叶>茎>根。【结论】本研究为后续利用qRT-PCR分析藜基因表达及研究PA-2致病机理奠定基础。

试验采用小麦单基因系TcLr19,感病对照Thacher(Tc)及叶锈菌小种366和165,利用组织化学方法,对接种后不同时间点叶锈菌在亲和和不亲和寄主上的发育情况进行观察,并对表现不同侵染型的TcLr19-叶锈菌组合中的2种防御酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)和过氧化物酶(PO)的活性变化及发生过敏性死亡(HR)的细胞面积进行测定。结果表明,伴随着叶锈菌的侵染,TcLr19接种叶锈菌小种366(侵染型为0;)后PAL的活性分别在24,72 h出现高峰,PO活性在48 h达到最高峰,发生HR的细胞面积从接种后24 h逐渐增加直至96 h达到高峰;而接种叶锈菌小种165(侵染型为1)后2种酶活性变化及...

为探究IbWRKY7基因在甘薯响应蔓割病病原菌侵染过程中的表达模式，以高抗蔓割病品种‘鄂薯11’为供试材料，克隆到1个新的WRKY家族基因IbWRKY7，进行生物信息学分析；并对‘鄂薯11’和蔓割病敏感品种‘栗子香’在蔓割病病原菌侵染后IbWRKY7基因的表达模式进行分析。结果显示，IbWRKY7的CDS序列全长为945bp，编码314个氨基酸；推测其编码不稳定的亲水性蛋白，蛋白分子质量为33.92kU,pI 9.82，含有1个WRKY七肽保守序列和1个C2HC型锌指结构。IbWRKY7基因上游2 000bp的启动子区域内存在多种类型的顺式作用元件，如植物激素应答元件Myb、胁迫响应元件MYC和MYB等。多序列比对及系统进化树分析结果表明，IbWRKY7蛋白与日本牵牛花InWRKY7和三裂叶薯ItWRKY7亲缘关系最近。亚细胞定位预测显示IbWRKY7蛋白定位于细胞核。实时荧光定量PCR结果表明，与蔓割病病原菌侵染0h相比，侵染2、4、12、24、48、72、96和120h后，‘鄂薯11’的IbWRKY7基因表达量均显著提高（P

[目的]在全基因组水平鉴定番木瓜(Carica papaya L.) WRKY(CpWRKY)转录因子家族基因,并对其在短孢炭疽菌侵染下的表达量进行分析,为CpWRKYs家族的功能研究和利用奠定基础。[方法]采用生物信息学方法,鉴定和筛选CpWRKYs转录因子家族基因成员,并对其进行系统进化分析、基因结构分析、蛋白保守基序预测和启动子顺式作用元件分析;同时以番木瓜炭疽病耐性品种和敏感性品种为材料,利用短孢炭疽菌侵染采后果实,于0,24,48 h取样,对其转录组学数据进行分析,筛选2个品种中差异表达的CpWRKY基因,并利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)试验对筛选结果进行验证。[结果]经系统分析从番木瓜中共鉴定出48个CpWRKYs成员,分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3类;其中第Ⅱ类成员最多,可分为Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd和Ⅱe5个亚类。CpWRKYs家族成员的氨基酸残基数目为97～747个,等电点为4.83～9.71,为亲水性蛋白,大部分CpWRKYs的结构域高度保守,但有个别蛋白保守域缺失。在CpWRKYs家族中共预测到10个保守基序,其中包括含有WRKY七肽结构域的基序1、含锌指结构的基序2和同时含有七肽序列和锌指结构的基序3,其中基序3为大多数I类CpWRKY转录因子N端WRKY结构域所特有。Cp WRKYs含有1～6个外显子,同一家族或亚家族成员在基因结构上表现出一定的相似性,同时在Cp WRKYs启动子中检测到大量与生物胁迫和非生物胁迫相关的元件。对短孢炭疽菌侵染番木瓜的转录组数据进行分析,在番木瓜耐性品种中筛选出了特异表达的CpWRKY22、CpWRKY11、Cp WRKY2、CpWRKY33和CpWRKY25,RT-qPCR检测结果显示,这些基因在耐性品种中特异上调表达,在敏感性品种中的表达量无明显变化。[结论]番木瓜WRKY家族共包括48个成员,该家族基因结构和蛋白基序具有组间差异性和组内保守性。CpWRKYs家族成员强烈响应炭疽菌侵染,其中CpWRKY22、CpWRKY11、CpWRKY2、CpWRKY33和CpWRKY25是有潜力的抗炭疽病候选基因。

采用实时定量RT-PCR方法研究斑点叉尾在不同病原(链球菌、嗜水气单胞菌、迟钝爱德华菌、斑点叉尾病毒)感染后TICAM基因在mRNA水平的组织和时空表达特征。感染嗜水气单胞菌可引起TICAM基因在肝脏和脾脏中的上调表达,在注射后24h和12h后上调最大分别为2.3倍和1.9倍;而在头肾和后肠中的表达则下调到感染后48h的0.15倍和24h的0.53倍;感染链球菌后则导致在肝脏、脾脏、后肠和头肾中TICAM基因表达的强烈上调,最大上调幅度为感染后7d肝脏中表达提高了23倍,其次,在脾脏和头肾中基因表达最大可上调到感染前的10倍左右;在感染迟钝爱德华菌后,TICAM基因在肝脏、脾脏、后肠和头肾中表...

大麦受白粉菌侵染后，抗病品种和感病品种中草酸氧化酶ＲＮＡ转录物诱导表达，并伴随着酶活性的增加和蛋白质的积累。抗病品种Ｓｕｌｔａｎ－５在接种后２４ｈ酶活性开始明显增加，而感病品种在接种后３６ｈ才开始增加。接种４８ｈ后所有品种酶活性增加达到了高峰，酶活性大约为对照的４倍。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ酶活性染色及Ｗｅｓｔｅｒｎ杂交表明受白粉菌侵染后酶活性上升，蛋白质积累增多。草酸氧化酶有２条活性带，分子量分别为９５ｋＤ和１００ｋＤ，用ＤＴＴ还原后只有１条大约２７ｋＤ的单带。用草酸氧化酶ｃＤＮＡ（ｐＨｖＯｘＯａ）探针作Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交的结果表明：抗病品种和感病品种中草酸氧化酶ＲＮＡ转录物积累型不一致。接种４８...

【目的】研究黄瓜花叶病毒病(CMV)侵染胁迫下黄瓜重要功能基因表达和代谢途径响应。【方法】在结合气体交换和叶绿素荧光参数及抗性相关酶活性测定的基础上,应用农业部园艺植物生长发育与品质调控重点开放实验室自主开发的黄瓜cDNA芯片研究黄瓜在CMV侵染胁迫下的基因表达谱变化,并对其中5个具有代表性的基因通过实时荧光定量PCR(QRT—PCR)进行检测,以验证cDNA芯片杂交结果的可靠性。【结果】共获得67个差异表达显著的基因,其中42个基因下调表达,25个基因上调表达。这些差异表达的基因涉及了许多重要代谢途径。许多与光合作用、氮同化相关的基因受到明显的抑制;而一些防御相关基因和信号传导相关基因则诱导...

【目的】明确csi-miR399响应柑橘溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）侵染的表达模式，筛选其靶基因，进而分析csi-miR399与寄主Xcc抗性的相关性，为柑橘溃疡病抗性种质的创制打下基础。【方法】分别以柑橘溃疡病抗性品种四季橘（Citrus microcarpa）和感病品种纽荷尔脐橙（Citrus sinensis）为试材，通过茎环qPCR方法分析csi-miR399在叶片离体注射Xcc 1、3和5 d时的表达量变化，明确抗/感品种中csi-miR399响应Xcc侵染的表达模式；利用在线软件psRNATarget预测csi-miR399的靶基因，并通过qPCR分析候选靶基因在接种Xcc柑橘叶片和瞬时表达csi-miR399叶片中表达量的变化；克隆csi-miR399前体基因序列，通过同源重组方法构建病毒表达载体pCLBV202-MIR399，根癌农杆菌介导的真空浸润法接种尤力克柠檬（Citrus limon），通过qPCR分析csi-miR399表达量；进而采用离体叶片针刺法接种Xcc，观察发病症状，统计病情指数，分析csi-miR399过表达对Xcc抗性的影响。【结果】接种Xcc后，csi-miR399在抗病品种四季橘中的表达呈现先下降再上升的趋势，而在感病品种纽荷尔脐橙中的表达呈持续下降趋势。接种Xcc 5 d时，csi-miR399在四季橘与纽荷尔脐橙中的表达量分别是健康对照的4.64倍和7.61%，初步表明csi-miR399与柑橘的溃疡病抗性相关。从13个预测靶基因中筛选鉴定了csi-miR399的3个靶基因Cs2g06030、Cs7g03830、Cs8g18800，分别编码泛素偶联酶PHO2、未知蛋白和漆酶。利用构建的病毒表达载体pCLBV202-MIR399获得过表达csi-miR399的柠檬植株（Y37、Y41和Y57），与空载体对照pCLBV202接种植株（L35）相比，Y37、Y41和Y57中csi-miR399表达量显著增加，接种Xcc后的溃疡病病斑面积显著减小，病情指数显著降低（P<0.01），表明csi-miR399过表达显著提高了柠檬的溃疡病抗性。【结论】csi-miR399与柑橘的溃疡病抗性密切相关，过表达csi-miR399显著提高柑橘对溃疡病的抗性，可应用于柑橘抗溃疡病的分子育种。