【目的】CAP(Cysteine-rich secretory protein,Antigen 5 and Pathogenesis related protein 1)超家族蛋白广泛存在于真菌、细菌、动植物等物种,并且参与病原菌的致病过程。本研究旨在鉴定苹果树腐烂病致病菌——苹果黑腐皮壳菌(Valsa mali)的CAP超家族基因并明确CAP超家族基因在病菌致病方面的作用。【方法】通过BLASTP在苹果黑腐皮壳菌全基因组中检索具有CAP保守结构域的基因;利用特异性引物对鉴定到的CAP基因进行PCR扩增和凝胶电泳检测;使用生物信息学软件和在线数据库进行蛋白序列特征和系统发育分析;利用RT-qPCR分析基因在病菌侵染过程中的表达模式;使用特异性引物扩增CAP基因上、下游片段并从PDL2质粒上扩增筛选标记基因;利用Double-joint PCR构建基因敲除盒并通过PEG介导的原生质转化技术进行基因敲除和基因回补;以遗传霉素(G418)抗性为筛选标记并利用4对引物PCR检测获得基因敲除突变体;以潮霉素(HPH)抗性为筛选标记获得基因回补菌株;通过对菌株进行培养皿内生长试验明确基因对病菌营养生长的影响;通过离体苹果枝条接种试验分析该病菌CAP超家族基因的毒性功能。【结果】在苹果黑腐皮壳菌中鉴定到3个具有CAP保守结构域的基因,分别命名为VmPR1a、VmPR1b和VmPR1c。序列特征分析发现,3个CAP蛋白均包含4个保守区:N端信号肽、N端延伸区(NTE)、CAP保守功能域和C端延伸区(CTE)。系统发育分析显示,3个CAP蛋白聚于不同的进化支,VmPR1a聚于clade2进化支并与粗糙链孢霉(Neurospora crassa)CAP蛋白进化关系较近;VmPR1b聚于clade3且与镰孢菌属(Fusarium spp.)CAP蛋白的进化关系更近;VmPR1c聚于clade1,并且也与粗糙链孢霉的CAP蛋白进化关系较近。RT-qPCR分析结果显示,VmPR1a、VmPR1b和VmPR1c在病菌侵染早期(6 h和12 h)均显著上调表达。利用PEG遗传转化技术获得VmPR1a、VmPR1b和VmPR1c敲除突变体(ΔVmPR1a-7/23、ΔVmPR1b-20/31和ΔVmPR1c-26/40);营养生长观察发现,所有敲除突变体生长表型与野生型菌株03-8均无明显差异;致病力检测发现,ΔVmPR1b-20/31致病力较野生型无明显变化,而ΔVmPR1a-7/23和ΔVmPR1c-26/40致病力较野生型显著下降。将VmPR1a和VmPR1c分别回补至ΔVmPR1a和ΔVmPR1c,回补菌株(VmPR1a/C和VmPR1c/C)致病力恢复至野生型水平。【结论】苹果黑腐皮壳菌中存在3个CAP超家族基因(VmPR1a、VmPR1b和VmPR1c),其中VmPR1a和VmPR1c是苹果黑腐皮壳菌重要的毒性因子。

【目的】获得飞蝗（Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ）表皮蛋白ｏｂｓｔｒｕｃｔｏｒ（ｏｂｓｔ）家族基因的ｃ ＤＮａ序列，并研究其序列特征和ｍ ｒＮａ表达特性，探讨其生物学功能，为害虫防治提供新的分子靶标。【方法】采用生物信息学方法搜索飞蝗转录组数据库获得ｏｂｓｔ家族基因ｃ ＤＮａ片段，并进行ｂＬａｓｔ分析得到ｏｂｓｔ家族基因的ｃ ＤＮａ序列；采用ｒａｃＥ技术扩增该家族基因的３′ｃ ＤＮａ序列，拼接后获得全长；ｓｉｇＮａＬ Ｐ在线软件分析蛋白的信号肽，ｓｍａｒｔ网站预测其功能域，并使用ｍＥｇａ ５．１０软件中ＮＥｉｇｈｂｏｒ－ＪｏｉＮｉＮｇ方法，与黑腹果蝇（ＤｒｏｓｏＰｈｉＬａ ｍＥＬａＮｏｇ．．．

【目的】获得飞蝗(Locusta migratoria)表皮蛋白Obstructor(Obst)家族基因的c DNA序列,并研究其序列特征和m RNA表达特性,探讨其生物学功能,为害虫防治提供新的分子靶标。【方法】采用生物信息学方法搜索飞蝗转录组数据库获得Obst家族基因c DNA片段,并进行BLAST分析得到Obst家族基因的c DNA序列;采用RACE技术扩增该家族基因的3′c DNA序列,拼接后获得全长;Signal P在线软件分析蛋白的信号肽,SMART网站预测其功能域,并使用Mega 5.10软件中Neighbor-Joining方法,与黑腹果蝇(Drosophila melanog...

为了研究桃钙调磷酸酶B类似蛋白(CBLs)基因家族在桃中如何发挥作用。利用桃基因组数据库,通过生物信息学手段,鉴定桃CBL家族基因的基因结构、染色体定位和编码蛋白,通过序列比对进行进化和分类分析。结果表明,桃基因组中含有8个CBL家族基因,分布于桃的5条染色体上。MEME和Pfam保守结构域分析显示,桃CBL蛋白均含有4个保守的EF结构域。进化树分析表明CBLs可分为4个亚家族。TMHMM 2.0Server分析显示仅PpCBL1含有1个跨膜区。PlantsPFeatureScan分析显示PpCBL2、3

为了分析马铃薯扩展蛋白基因家族的进化与功能,鉴定了马铃薯的扩展蛋白基因家族,分析了其基因结构特征、系统发育及表达模式等。结果表明,马铃薯基因组包含33个扩展蛋白基因,包括A(21)、B(5)、LA(1)和LB(6)4个亚家族,分布在马铃薯11条染色体上。扩展蛋白氨基酸长度为194488 aa,编码蛋白质具有保守的结构域,蛋白质亚细胞定位预测结果表明所有蛋白均定位于细胞外。基因结构分析表明,马铃薯扩展蛋白家族有23个基因(69.7%)含有23个内含子。基因表达分析发现,该家族基因在马铃薯根、茎、匍匐茎、果实

旨在获得CIDEB、CIDEC基因的CDS,检测该家族基因在山羊不同组织中的表达量，预测其互作蛋白，为进一步揭示CIDE家族基因在脂代谢中的调控网络提供参考。主要利用RT-PCR克隆获得山羊CIDEB、CIDEC基因序列并利用在线工具分析CIDE家族蛋白的生物学特性，并预测其互作蛋白。利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测了CIDE家族基因在山羊不同组织中的表达水平，并检测各互作蛋白在其表达水平最高的组织中的表达量，利用SPSS分析其表达量之间的相关性。克隆获得了CIDEB基因CDS区660 bp,共编码219个氨基酸，CIDEC基因CDS区714 bp,编码237个氨基酸。进化树分析显示，山羊CIDEA、CIDEB、CIDEC均与绵羊亲缘关系最近。RT-qPCR检测发现CIDEA、CIDEB、CIDEC基因分别在山羊瘤胃、肝脏、小肠中表达量最高。CIDEA与DFFB和ELOVL3在瘤胃中的表达量具有极显著相关性(P<0.01),与DIO2、TMEM26、PRDM16、PLIN1具有显著相关性(P<0.05)。CIDEB与DFFA和SDR39U1在肝脏中的表达量具有显著相关性(P<0.05)。CIDEC与PLIN2、GPLD1、ADIPOQ在小肠中的表达量具有显著相关性(P<0.05)。通过分析发现了与CIDE家族表达量具有相关性的基因，可为进一步揭示CIDE基因在脂质代谢中的作用及其调控网络提供理论基础，且CIDE家族蛋白均为脂滴相关蛋白，也可为进一步研究精确的脂滴形成机制提供参考。

【目的】鉴定桑树中MaCWIN （Cell wall invertase， CWIN）和MaCIF （Cell wall invertase inhibitor， CIF）家族基因，为揭示桑树MaCWIN与MaCIF家族基因的功能及筛选优质种质资源奠定基础。【方法】以拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）和杨树（Populus trichocarpa L.）的CWIN和CIF家族基因为参考，在MorusDB数据库中筛选桑树的MaCWIN和MaCIF家族基因，用PCR基因克隆技术对其进行克隆，并进行motif分析、多序列比对分析、系统发生分析、蛋白特征分析、亚细胞定位预测，通过RT-qPCR技术分析MaCWIN和MaCIF家族基因在不同组织和果实不同发育时期的表达谱，分析MaCWIN和MaCIF之间的相关性，通过病毒诱导的基因沉默技术在桑树体内敲低MaCWIN和MaCIF家族基因的表达量并观察表型。【结果】筛选出MaCWIN和MaCIF家族基因各5个，成功克隆出4个MaCWIN基因和3个MaCIF基因，MaCWIN家族基因CDS区域长度为1722～1989 bp；MaCIF家族基因CDS区域长度为537～582 bp；MaCWIN1、MaCWIN2、MaCWIN4、MaCWIN5为酸性转化酶，MaCIF1、MaCIF3和MaCIF4为酸性转化酶抑制子；MaCWIN1、MaCWIN2和MaCWIN4属于细胞壁转化酶，MaCWIN5是液泡转化酶。MaCWIN1在幼叶表达量最高，MaCWIN2表达量随果实成熟逐渐积累，其他基因均表现出组织特异性；病毒诱导的基因沉默试验结果显示，MaCWIN1和MaCIF1基因的敲低导致相应植株发育延迟。【结论】MaCWIN和MaCIF基因家族是桑树体内重要的功能基因，首次克隆了MaCWIN和MaCIF基因编码区，确定其分类，其中MaCWIN1和MaCIF1是影响桑树生长发育的关键基因。为了解MaCWIN和MaCIF家族基因在桑树中的功能及培育桑树新品种提供理论基础。

【目的】对油松JAZ基因家族特征及其与赤霉素负调控因子DELLA蛋白互作的功能域深入分析，旨在为解析针叶树以JAZ-DELLA为核心模块、茉莉酸（JA）-赤霉素（GA）介导的生长/防御平衡策略奠定基础。【方法】以油松全基因组数据为基础，筛选鉴定油松全部的JAZ家族基因成员，并分析其基本特征；构建多物种JAZ基因家族系统发育进化树，解析油松JAZ基因家族在系统进化过程中的特点；利用酵母双杂交技术，明确油松中JAZ与DELLA蛋白互作的功能域。【结果】油松中共鉴定得到53个JAZ基因家族成员，均具有TIFY和Jas保守结构，而且在degron序列中进化出了更丰富的变异。多个油松JAZ基因家族成员启动子区域包含响应JA和GA的顺式作用元件，并与模式植物中多个JAZ蛋白有着较近的进化距离。进一步实验发现，油松中5个JAZ蛋白（TIFY4、TIFY11、TIFY16、TIFY25、TIFY59）的Jas结构域与油松DPL(DELLA-like)蛋白存在相互作用，明确了油松中Jas结构域是JAZ蛋白与DELLA蛋白互作的功能域。【结论】明确了油松JAZ基因家族的基本序列特征，确定了油松中JAZ与DELLA蛋白互作的Jas功能域，为针叶树JAZ基因家族及JA-GA信号转导通路的深入研究提供了重要依据。

【目的】基于飞蝗(Locusta migratoria)转录组数据库获得内表皮蛋白(endocuticle structural glycoprotein)基因Lm Abd-5的c DNA序列,分析该基因的序列特征和m RNA表达特性,采用RNAi方法分析其生物学功能,探讨其在飞蝗表皮形成中的作用,为害虫防治提供新的分子靶标。【方法】采用生物信息学方法搜索飞蝗转录组数据库,获得Lm Abd-5 c DNA全长序列并克隆验证;采用Signal P在线软件分析蛋白的信号肽,利用SMART网站预测其功能域,使用

【目的】基于飞蝗(Locusta migratoria)转录组数据库搜索并克隆获得飞蝗表皮蛋白基因LmNCP1(nymph cuticle protein 1),分析其序列特征和表达特性,通过蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)诱导和干扰20E受体基因LmEcR表达研究其表达调控,并基于RNA干扰(RNAi)方法分析其生物学功能,为阐明该基因在飞蝗表皮发育过程中的作用提供理论依据。【方法】依据飞蝗转录组数据库获得表皮蛋白基因LmNCP1,结合RT-PCR技术克隆获得其全长开放阅读框(O

糖转运蛋白(Sugar transporter protein,STP)基因家族在植物单糖分配中具有重要作用,并参与植物生长和发育过程中的许多代谢进程。为探究STP基因家族在高粱生长发育中的潜在功能,对高粱STP基因家族进行了全基因组鉴定、分类和组织表达分析。从高粱基因组中共鉴定出19个包含Sugar_tr结构域的STP基因,不均匀分布于9条染色体上,其中有4个基因位于基因组重复区。19个SbSTP根据其系统发育特征可以分为5组,同组的家族成员具有相同或类似的基序类型和排列顺序,但在内含子和外显子数量上存在较大差异。RNA-Seq数据分析显示,至少有18个SbSTP基因可以表达,不同的基因在不同的组织中具有不同的表达模式,其中SbSTP11特异性在花中表达,SbSTP4、SbSTP5在特定组织中受ABA和PEG的诱导表达。为进一步研究单个SbSTP基因的生物学功能,挖掘SbSTP家族的应用潜力奠定了基础。

腺苷三磷酸结合盒转运蛋白(ATP binding cassette transporter， ABC transporter)家族是最古老的膜蛋白家族之一，广泛存在于原核生物和真核生物体内，利用ATP水解释放的能量对氨基酸、脂质、抗生素等物质进行跨膜运输，参与生物体内多种生理活动。目前，对软体动物ABC转运蛋白家族的鉴定，仅在虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)、栉孔扇贝(Chlamys farreri)和长牡蛎(Crassostrea gigas) 3种双壳类中有系统研究，对缢蛏(Sinonovacula constricta) ABC转运蛋白家族的鉴定和表达模式分析尚未见报道。利用缢蛏基因组和转录组数据，运用本地及NCBI在线BLAST程序、FGENESH+、SMART、ExPASy、MEGA X、Mev 4.90和MapInspect等生物信息学分析工具，在全基因组水平系统地鉴定出52个缢蛏ABC转运蛋白，并对转运蛋白基因外显子数目、染色体定位等信息进行分析；通过系统进化分析，将缢蛏ABC转运蛋白家族分为8个亚家族，即ABCA～ABCH；通过比较分析不同物种ABC转运蛋白家族，推测基因串联复制事件对软体动物ABC转运蛋白家族成员数目的增加有影响。ABC转运蛋白基因在缢蛏不同发育时期和组织的表达分析显示，ABCC和ABCG亚家族多个基因在缢蛏稚贝时期表达量达到最高值，ABC转运蛋白基因在鳃、肝胰腺与性腺中表达种类较多。软体动物作为第二大动物类群，目前仅有3个物种的ABC转运蛋白得到了系统分类，缢蛏ABC转运蛋白基因家族的系统鉴定与表达模式分析为研究软体动物ABC转运蛋白基因的进化和缢蛏ABC转运蛋白功能提供了基础资料。

【目的】鉴定克隆家蚕组织蛋白酶L基因BmCathepsin L(BmCat L),分析其序列和表达特征。分析家蚕组织蛋白酶L在大肠杆菌诱导下m RNA表达量的变化趋势,为进一步研究家蚕组织蛋白酶L的功能打下基础。【方法】基于家蚕基因组数据库(Silk DB)中序列BGIBMGA006893设计引物,利用RACE技术克隆家蚕组织蛋白酶L基因的cDNA全长序列,通过在线工具对基因结构和蛋白质分子量及等电点进行预测;在NCBI数据库下载其他物种组织蛋白酶L同源序列,利用Clustalx(1.83)和MEGA 6

脱落酸(ABA)是一种内源性激素,在调节植物的生长发育、非生物胁迫和生物胁迫反应方面发挥着重要作用。Pyrabactin resistance 1-like(PYR/PYL)蛋白在ABA信号传导途径中起核心调控作用。然而,在蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)中并没有关于这个家族的细节。本研究根据拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的14个PYL基因,利用BLAST方法鉴定蒺藜苜蓿基因组中的PYL家族成员。结果表明,鉴定得到14个蒺藜苜蓿PYL基因家族成员,且所有成员均含有PYR-PYL-RCAR-like功能域。预测启动子中的顺式元件发现所有蒺藜苜蓿PYL基因家族成员均含有与胁迫以及激素相关的元件。基因本体论(GO)富集分析与KEGG通路分析显示其主要参与到脱落酸信号通路及对外界刺激的反应。基因表达模式分析显示,其在逆境胁迫下表现出特定的表达模式。本研究为进一步研究蒺藜苜蓿PYL基因奠定了基础。

了解异源四倍体甘蓝型油菜中AMT基因家族的功能,为进一步克隆和利用基因改良甘蓝型油菜的氮素利用效率和铵毒抗性提供一定的理论基础。利用生物信息学的方法鉴定出20个BnaAMTs基因,其中14个为AMT1亚家族成员,6个为AMT2亚家族成员,它们不均匀地分布在油菜的12条染色体上。进化与保守基序分析结果表明,BnaAMTs蛋白亚家族内的蛋白质序列保守性较高,但亚家族之间的差异较大。BnaAMTs基因在油菜不同组织中的表达谱显示,该基因家族表达具有组织特异性。利用转录组测序结果分析发现,根部在供应高浓度的铵态氮和硝态氮时,BnaA7.AMT1;3表达量最高;在硝态氮缺乏条件下,BnaA5.AMT1;1表达量最高;在上述几种处理下,BnaC6.AMT1;1都是地上部表达量最高的拷贝。在缺硼或缺磷条件下,油菜BnaAMTs基因整体呈现表达上升的趋势;但在盐胁迫条件下,表达量下降;镉胁迫对BnaAMTs基因的表达影响较小。这些基因可能在铵态氮与其他必需营养元素的互作、镉胁迫、盐胁迫等逆境响应中发挥一定的作用;并为进一步深入解析甘蓝型油菜AMT家族基因的分子功能奠定了基础。