该文以优系短枝富士为主要试材，采用木本指示植物和间接酶联免疫（ＰＡＳ－ＥＬＩＳＡ）两种方法，对苹果褪绿叶斑病毒（ＣＬＳＶ）、苹果茎沟病毒（ＳＧＶ）和苹果茎痘病毒（ＳＰＶ）进行了检测．试验表明，俄罗斯苹果Ｒ１２７４０－７Ａ、司派２２７和弗吉尼亚小苹果３种指示植物可作为上述３种潜在病毒的鉴定植物．植物生长状况对鉴定结果有重大影响．间接酶联免疫检测速度快，准确度高．该试验所用最佳抗体工作浓度ＣＬＳＶ：第一抗体１／６０００，第二抗体１／２０００；ＳＧＶ：第一抗体１／５０００，第二抗体１／３０００．

通过试管微嫁接,分别将苹果褪绿叶斑病毒和苹果茎沟病毒接种到小金海棠组培苗上,并用PAS-ELISA法检测其带毒率。结果表明:接穗小金海棠苹果褪绿叶斑病毒的带毒率为60.0％,其苹果茎沟病毒带毒率为73.3％,从而证明用此方法可以对组培苗进行快速病毒接种而得到带毒的实验材料。

【目的】建立一种反转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermalamplification,RT-LAMP)检测柑橘衰退病毒(Ctrus tristeza virus,CTV)的一步法检测技术。【方法】根据CTV保守的p25设计2对特异性引物,对RT-LAMP体系的最佳反应条件、特异性、灵敏度等进行研究。【结果】建立了一种特异性检测CTV的RT-LAMP方法,该方法的灵敏度比RT-PCR方法高100倍,产物通过Acc I酶切得到验证,而且反应产物中加入SYBR Green I可直接观察样品是否感染CTV。【结论】RT-LAMP法...

为了快速提取植物叶片的总RNA,并对烟草病毒进行检测,对提取及检测方法进行了研究。结果表明:以黄瓜叶片、白肋烟叶片为试材,用TRIzol试剂盒在1 h内提取到纯度高、完整性好的总RNA。设计烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒和马铃薯X病毒的特异性引物,RT-PCR检测,从感病叶片中分别扩增出313,326,392 bp的目的片断,而健康叶片中无此扩增带。构建这3种病毒重组质粒,对核苷酸序列与GeneBank中报道的进行比较,同源性分别为99.36%,97.55%,98.21%。用这种方法快速、可靠,为烟草病毒的检测提供科学依据。

采用TR IZOL试剂盒和异硫氰酸胍法2种方法提取了带PVX马铃薯试管苗的总RNA。根据设计好的1对特异性引物,运用反转录PCR技术对提取的总RNA进行了体外扩增。结果表明,所用2种方法都能有效地提取马铃薯RNA,并适合于反转录合成病毒cDNA,得到了与预期大小相一致的720 bp片段,而对照未得到任何产物。但利用TR IZOL试剂盒进行RNA提取价格较贵,而异硫氰酸胍法所用试剂可自己配制,方法灵活,价格较TR IZOL试剂盒便宜。从而建立了经济简便的PVX RT-PCR检测体系,为PVX的防治、脱毒种薯和核心种苗的检测提供有效手段。

采用酶联免疫吸附试验(ELISA)快速诊断病毒性疾病,由于具有灵敏度高、特异性强和简便等优点,已在医学和兽医学上得到了广泛的应用。在鱼类病毒检测方面,Dixon,P.F.和Hill,B.J.用ELI-SA方法(1983)快速检测传染性胰脏坏死症病毒(IPNV)和(1984)几种鱼类弹状病毒,江育林等(1990)曾报道用此技术快速检测IPN病毒,1990年在我国本溪虹鳟鱼苗中分离出一株弹状病毒,暂称之为传染性造血器官坏死症病毒中国本溪株(IHNV-B),由于该病毒对虹鳟(rainbow trout)鱼苗危害极为严重,为预防和控制其蔓延,本文报道了应用ELISA方法对感染的鱼苗、鱼卵和细胞...

【目的】建立一种利用反转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)技术简便、快速检测苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)的方法。【方法】在ACLSV基因组序列的3个保守区域设计3组引物,每组引物包括一对外引物(F3/B3)和一对内引物(FIP/BIP),从3组引物中筛选出一组效果最好的引物。对RT-LAMP反应体系,即Mg~(2+)、d NTPs、Betaine、FIP/BIP、B3/F3浓度进行优化,Mg~(2+)浓度梯度设置为0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mmol·L~(-1),d NTPs浓度为0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol·L~(-1),Betaine浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol·L~(-1),FIP/BIP浓度为0.8、1.2、1.6、2.0、2.4μmol·L~(-1),F3/B3浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.4μmol·L~(-1);优化RT-LAMP反应条件,采用已优化的反应体系,设置65、63、61、59、57℃5个不同的反应温度,反应时间设定为90 min。在引物筛选和反应体系反应条件优化过程中,使用荧光定量PCR仪,在反应体系中加入荧光染料,利用荧光信号积累实时监测整个反应过程,根据扩增曲线判断反应结果。以携带苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)、苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)、苹果花叶病毒(Apple mosaic virus,Ap MV)的植株叶片中提取的总RNA为模板测试RT-LAMP检测方法的特异性。将含ACLSV的叶片总RNA原液进行10倍梯度稀释,以RNA原液和10~(-1)、10~(-2)、10~(-3)、10~(-4)、10~(-5)、10~(-6)稀释液作为模板,进行RT-LAMP反应,测试RT-LAMP检测方法的灵敏性。随机采集23株苹果树的叶片,同时进行RT-LAMP和RT-PCR检测,加入SYBR GreenⅠ进行可视化检测。【结果】建立了ACLSV RT-LAMP检测方法,优化的检测体系为:6.0 mmol·L~(-1) Mg~(2+)、1.2 mmol·L~(-1) d NTPs、0.2 mol·L~(-1) Betaine、1.6μmol·L~(-1) FIP/BIP和0.2μmol·L~(-1) F3/B3引物,最佳反应条件为59℃,60 min。特异性检测中,仅ACLSV检测结果为阳性,对照组均为阴性。灵敏性检测中,RT-LAMP方法最低可检测到10-3 RNA稀释液,灵敏度是RT-PCR方法的100倍。随机采取的23株苹果叶片样品RT-PCR阳性检出率为52.2%,RT-LAMP阳性检出率为65.2%,RT-LAMP的检出率高于RT-PCR。【结论】建立的ACLSV RT-LAMP检测方法具有简便、快速、灵敏性高、成本低等特点,可满足基层、科研部门在田间调查、种苗繁育和海关检疫中快速检测ACLSV。

【目的】建立一种快速、灵敏的逆转录环介导等温扩增方法(RT-LAMP)检测寄主植物和传毒介体体内的水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)。【方法】合成4条针对RBSDV S10核苷酸序列6个位点的特异性引物。分别对引物浓度、MgSO4浓度、反应温度和时间进行优化。将感病水稻总RNA梯度稀释后进行灵敏性检验并与RT-PCR比较分析。选择RBSDV和南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)验证该方法的特异性。用本RT-LAMP方法检测田间病株。【结果】RT-LAMP检测方法可排除SRBSDV的干扰而特异地检测植物和飞虱体内的RBSDV,与RT-P...

为建立快速、简便、灵敏度高、特异性强的RT-PCR检测马铃薯病毒技术,依据马铃薯X病毒、马铃薯S病毒、马铃薯A病毒以及马铃薯卷叶病毒的基因组RNA保守序列设计特异性引物对,从反转录和PCR等方面优化双重RT-PCR反应条件,同步扩增出上述四4种病毒,分别得到620(PVX)、435(PVS)、300(PVA)、222 bp(PLRV)大小的扩增片段。结果表明,反转录反应中引物浓度比例、dNTPs浓度和PCR反应中Mg2+浓度对双重RT-PCR检测多种马铃薯病毒的影响较大。优化的双重RT-PCR反应体系可以同步快速检测田间自然感染的马铃薯病毒,此方法还适合检测马铃薯脱毒种薯及试管苗,对马铃薯病毒...

【目的】甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)侵染甘薯造成重要危害,本研究旨在利用反转录环介导等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)建立一种快速、高效检测SPFMV的方法。【方法】从Gen Bank上获得SPFMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因的核苷酸序列,利用Primer Explorer V4设计4条RT-LAM

【目的】建立猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR快速鉴别检测方法。【方法】根据Gen-Bank中36株猪瘟病毒(CSFV)强毒株和兔化弱毒疫苗株的基因序列,分别设计了针对CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的特异性引物,建立了一种能区分CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR检测方法。【结果】建立的RT-PCR检测方法可以从CSFV强毒株和兔化弱毒疫苗株中分别扩增出大小为187和492 bp的特异性片段,对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等猪源性病毒的检测结果均为阴性,说明该方法具有较好的特异性。对10份疑似猪瘟临床样品进行检测...

该文应用热处理、热处理加茎尖组织培养以及在培养基中加入抗病毒药剂等方法，脱除了苹果优系短枝富士的苹果褪绿叶斑病毒（ＣＬＳＶ）和苹果茎沟病毒（ＳＧＶ），从而获得无潜隐病毒苗木。

在GenBank中搜寻虹彩病毒蛙病毒属主衣壳蛋白(MCP)基因序列并进行多重比较后,利用其中的保守序列,设计引物和Taqman探针,建立了虹彩病毒蛙病毒属实时荧光PCR检测方法。对荧光PCR反应条件进行优化,评估该检测方法的特异性、稳定性和重复性,利用10倍系列稀释法检验其灵敏度并与常规PCR做了比较。结果显示,该方法对虹彩病毒蛙病毒属成员(新加坡石斑鱼虹彩病毒除外)的检测有高度的特异性,与淋巴囊肿病毒、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒、真鲷虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒等其他水生动物病毒之间均无交叉反应,有良好的特异性,检测总DNA灵敏度为4.5×10-3pg/μL,比传统PCR的敏感度高出100倍,可对低病...

【目的】搞清苹果茎痘病毒在梨树组织中的分布,为茎尖脱毒提供直接的理论依据和技术支撑。【方法】以库尔勒香梨茎尖、叶片为材料,利用非放射性标记物地高辛(DIG),通过RT-PCR反应体系,合成了苹果茎痘病毒的cDNA探针,利用核酸探针斑点杂交检测方法对该探针特异性及灵敏度进行验证。研究制作了适合原位PCR及原位杂交的石蜡切片,利用原位反转录酶聚合酶链式反应(IS-RT-PCR)技术检测石蜡切片组织中苹果茎痘病毒RNA的定位及分布,并对影响实验结果的重要因素进行优化。【结果】梨树中的苹果茎痘病毒RNA阳性信号主要位于叶片的叶肉细胞、茎尖的外围皮层组织及相应的初生维管束。蛋白酶K消化时间以20 min...

为了调查天津地区种植梨的已知病毒病的发病情况,以雪花梨叶片为材料,采用改良的CTAB法对梨的嫩叶进行总RNA提取,并通过RT-PCR对天津3个地区70株不同品种的梨树所带的潜隐性病毒进行鉴定,包括苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)、苹果锈果类病毒(ASSVd)、苹果茎痘病毒(ASPV)、苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果凹果类病毒(ADFVd)。结果表明,改良方法 1-巯基乙醇法是提取梨叶片总RNA较为理想的方法,可获得的RNA杂质含量较少,总RNA得率较高,平均质量分数可达73. 880μg/g,获得的总RNA符合后续试验要求;利用RT-PCR法在70个检测样品中,上述5种病毒病的平均发生率依次为47. 1%,11. 4%,10. 0%,8. 6%,1. 4%,复合侵染率平均为28. 6%,种植年份越高的植株带毒率越高,不同品种对病毒的敏感性也不相同。研究结果表明,天津地区梨病毒病发病普遍,其中苹果褪绿叶斑病毒是主要带毒种类,而且具有一定比例的多种病毒复合侵染现象。梨树种植管理水平低,地区间梨树引种缺乏规范的检测监控均可导致梨病毒病的发生和扩散,这对于天津梨产业的健康发展十分不利。