【目的】前期转录组分析表明苹果树腐烂病菌（Ｖａｌｓａ ｍａｌｉ）两个多聚半乳糖醛酸酶（ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅ，ｐｇ）基因Ｖｍｐｇ７和Ｖｍｐｇ８在病菌侵染定殖过程中显著上调表达。论文旨在分析Ｖｍｐｇ７和Ｖｍｐｇ８在病菌营养生长、致病力、果胶酶活性、对果胶的利用等方面的作用及基因双敲除对同家族内其他基因表达水平的影响，明确Ｖｍｐｇ７和Ｖｍｐｇ８在病菌致病过程中的生物学功能，为进一步解析苹果树腐烂病菌致病分子机理提供基础。【方法】通过ｑ ｒｔ－ｐｃｒ检测基因在病菌侵染过程中的表达水平及基因双敲除后ｐｇ家族内其他ｐｇ基因的表达量；利用ｄｏｕｂｌｅ－ｊｏｉｎｔ ｐｃｒ构建基因敲除载体并通过ｐ．．．

根据白菜花粉特异的多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因BcMF2(EU181170)的全长序列设计特异引物,通过PCR扩增的方法从荠菜中克隆了一个新的BcMF2的同源基因CbPG。该基因与BcMF2在核酸水平上的相似性高达99%。CbPG基因DNA全长为1 563 bp,由4个外显子和3个内含子构成,外显子总长为1 263 bp,编码420个氨基酸。序列比对结果表明,该基因具有所有PG基因特有的4个保守结构域,并且与花粉中特异表达的PG基因聚为一类,表明该基因可能是与花粉发育相关的PG基因,在花粉萌发和花粉管伸长中起作用。

为探究苹果树腐烂病菌β-葡萄糖苷酶基因VmGluI的序列特征及其在病菌侵染致病过程中的表达,以强致病力菌株LXS080601为材料,利用RT-PCR技术克隆基因c DNA序列,通过生物信息学软件对VmGluI编码蛋白的系统进化关系、理化性质和二级结构进行分析,采用实时荧光定量PCR技术测定VmGluI的表达量。结果显示,苹果树腐烂病菌VmGluI的开放阅读框为1 689 bp(GenBank登录号KY646110),编码562个氨基酸,蛋白分子量62.7 k Da。VmGluI编码的蛋白具有糖基水解酶1家

用香蕉枯萎病菌4号生理小种(Foc 4)接种巴西香蕉,香蕉枯萎病菌1号生理小种(Foc 1)接种粉蕉,均能检测到PG、PMG、PGTE、PMTE和Cx 5种细胞壁降解酶活性,其中PG活性均最高。在7种不同碳源培养条件下,Foc 4的菌丝干质量都比Foc 1的大,说明Foc 4的生长更快,能更适应多种营养条件。在PG诱导方面,有柑桔果胶或PGA存在时,2个生理小种的PG活性明显加强。在葡萄糖或CMC作为唯一碳源时,2个生理小种的PG活性很低。以香蕉维管束组织培养2个生理小种后发现,Foc 4的PG活性比Foc 1高。以粉蕉维管束组织培养2个生理小种后发现,Foc 1的PG活性比Foc 4高。以柑...

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)是植物抗病防御系统的重要组成部分。在前期研究中,从三七中分离得到一个编码PGIP蛋白的基因PnPGIP,PnPGIP在转录水平响应三七根腐病菌茄腐镰刀菌的侵染。为深入分析PnPGIP的功能,构建PnPGIP的原核表达载体,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行大量表达,纯化获得PnPGIP的重组蛋白,并进行体外平板抑菌试验;构建PnPGIP的植物超表达载体,通过根癌农杆菌介导产生了PnPGIP转基因烟草,分析T2转基因烟草离体叶片对茄腐镰刀菌的抗性。PnPGIP原核重组蛋白对茄腐镰刀菌、胶孢炭疽菌、核盘菌和轮枝状镰刀菌的菌丝生长具有很强的抑制作用,并且随着蛋白量的增加,抑制活性也逐渐增强。q RT-PCR分析结果显示,PnPGIP在T2转基因烟草中大量表达。此外,与野生型烟草相比,转基因烟草对茄腐镰刀菌的抗性显著增强。PnPGIP是三七中参与茄腐镰刀菌防御反应的重要抗病基因。

　研究优化了樟疫霉多聚半乳糖醛酸酶基因9(Pcpg9)和Pcpg10基因克隆的PCR条件,并对其进行了克隆、测序和遗传转化研究。克隆获得了2个基因,其大小前者1059bp,后者1290bp;通过构建表达载体和遗传转化获得了2个基因的转基因菌系;2个基因均能指导合成相应的PG酶蛋白,其中转化Pcpg10基因的酵母菌所分泌的PG酶活性最强,对照Anpg 的PG酶活性次之,Pcpg9的PG酶活性最弱。Westernblotting表明,所克隆的2个基因所指导合成的PG酶蛋白均有不同程度的糖基化。

【目的】内切多聚半乳糖醛酸酶(endo polygalacturonases,endoPGs)是重要的致病因子之一。论文从烟草靶斑病菌(Rhizoctonia solani)强致病力菌株YC-9和弱致病菌株LF-2中克隆该致病基因,分析比较该基因的序列特征、进化关系和表达特性,研究其在与烟草互作过程的致病作用。【方法】通过比较GenBank中不同植物病原真菌的endoPGs序列设计简并引物,首先获得菌株YC-9及LF-2的endoPGs基因片段,再采用RACE技术克隆获得其cDNA全长序列;生物信息学分析比较其保守结构域及序列特征;采用MEGA 4.0软件构建endoPGs的系统进化树;通过r...

【背景】microRNA-like RNA(milRNA)是真菌中普遍存在的一类与动植物microRNA具有相似生成和作用机制的调控因子，广泛参与其生长、发育，以及植物病原真菌的侵染致病等生命活动。苹果树腐烂病菌（苹果黑腐皮壳Valsa mali）引起的腐烂病是影响苹果生产的最具毁灭性的病害。【目的】探究Vm-milRN7调控苹果树腐烂病菌致病的功能及机理，为苹果树腐烂病的靶向性抗病育种提供理论依据。【方法】以03-8菌株基因组DNA为模板扩增Vm-milRN7前体序列并构建Vm-milRN7前体过表达载体；扩增Vm-milRN7前体上下游序列并利用Double-joint PCR技术构建Vm-milRN7前体敲除盒。利用PEG介导的原生质体转化法构建Vm-milRN7前体过表达及敲除突变体。通过培养皿内生长试验及离体枝条、叶片接种试验分析Vm-milRN7前体过表达及敲除突变体对病菌营养生长及致病的功能。利用qRT-PCR以及烟草共转化试验验证Vm-milRN7对其靶标基因Vm-09496的调控作用；使用生物信息学软件对Vm-09496进行蛋白序列特征和系统发育分析。为解析其功能，创制Vm-09496的敲除突变体以及回补菌株，并鉴定其表型。【结果】利用PEG介导的遗传转化技术获得Vm-milRN7过表达转化株以及敲除突变体。营养生长观察发现，与野生型菌株相比，Vm-milRN7过表达转化株生长表型无明显差异，而敲除突变体营养生长速率显著降低；致病力检测发现，Vm-milRN7过表达转化株对苹果叶片的致病力显著增强，敲除突变体对苹果叶片和枝条的致病力均显著降低。qRT-PCR和烟草共转化试验分析发现，Vm-milRN7能够抑制其候选靶标基因Vm-09496的表达。生物信息学分析发现该基因编码一个假想蛋白，且与梨黑腐皮壳（V. pyri）中的VP1G＿09956进化关系最近。创制Vm-09496的敲除突变体和回补菌株，发现与野生型菌株相比，敲除突变体对枝条和叶片的致病力均显著提高，而回补菌株营养生长速率及致病力恢复至野生型水平。【结论】Vm-milRN7通过调控靶标基因Vm-09496的降解参与苹果树腐烂病菌致病过程。靶标基因Vm-09496是影响腐烂病菌侵染的重要内源基因，在苹果树腐烂病菌内负向调控致病力。

　研究优化了樟疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶Pcpg16和Pcpg17基因克隆的PCR条件,并对其进行了克隆、测序和遗传转化研究。克隆获得了2个基因,其大小均为996bp;通过构建表达载体和遗传转化获得了2个基因的转基因菌系;这2个基因均能指导合成相应的PG酶。与对照Anpg 相比,转化Pcpg17基因的酵母菌所分泌的多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性较弱,而Pcpg16基因指导合成的PG酶无活性。Westernblotting表明,所克隆的2个基因指导合成的PG酶均有不同程度的糖基化。

【目的】腐烂病是苹果树的重要枝干病害,主要造成死枝、死树。论文旨在明确低温等环境因子和枝条龄期等寄主因子对腐烂病菌(Valsa mali)侵染致病的影响,分析腐烂病流行成灾的原因,为腐烂病的流行预测和防控提供依据。【方法】通过人工控制环境条件下的接种试验,检测腐烂病菌在苹果枝干各部位的定殖率,观测腐烂病菌在伤口内的定殖部位,测试低温冷冻、枝条浸水后冰冻、枝条失水、枝条龄期等因子对接种腐烂病菌侵染致病的影响。【结果】8月份用分生孢子喷雾接种的苹果树,次年3月份检测,7个枝位的带菌率都接近或超过90%;接种到伤口上的腐烂病菌主要定殖于伤口坏死组织内,并在死组织内生长扩展,但没有穿透伤口外围的愈伤木栓层而侵入活体的皮层组织致病;在检测的6个枝位中,新鲜伤口对腐烂病菌侵染致病最为敏感,接种发病率最高,果柄痕次之,叉丫、芽眼和果苔枝的敏感性稍差,发病率稍低,皮孔抗病性最强,接种病菌不能致病;低温冷冻和浸水后冰冻(枝条上形成冰晶)都能增加枝条芽眼部位对接种腐烂病菌的感病性,其中-25和-18℃两个温度下处理枝条的接种发病率显著高于-10、-7和0℃3个温度处理枝条的接种发病率,浸水后冰冻枝条(模拟冬季降水后结冰的枝条)的接种发病率显著高于相同温度处理未结冰枝条的发病率;在低温冷冻和浸水后冰冻处理的枝条中,一年生枝条的接种发病率显著高于二年生枝条的发病率;一年生枝条经浸水冰冻处理后,梢部的接种发病率显著高于同一枝条基部的发病率;浸水后冰冻再经失水处理枝条(模拟枝条越冬后因大风、高温等失水),对腐烂病菌的侵染致病更加敏感,接种发病率显著高于浸水后冰冻枝条的发病率,而且失水量越大,接种发病率越高,芽眼部位的接种发病率最高可达85%。【结论】腐烂病菌易在苹果枝干上定殖,定殖病菌主要在伤口或枝干表层死组织内存活并生长,定殖病菌能否侵染致病关键取决于环境因子对枝条栓皮层的破坏;低温冷冻,尤其低于-15℃的低温冻害能破坏枝条的栓皮层和皮层,增加苹果枝条对腐烂病菌侵染致病的敏感性;与低温冷冻相比,浸水后冰冻对枝条栓皮层的破坏作用更大,结冰枝条对腐烂病更加敏感;枝条浸水冰冻后再失水,对枝条的破坏作用尤为严重,枝条越冬后失水能显著增加其对腐烂病菌侵染致病的敏感性;枝条的龄期不同,栓皮层的发育成熟度、强度和韧度各不相同,受不良环境因子的影响后,其受到破坏的程度也不同;树体不同部位栓皮层的结构不同,对腐烂病菌侵染致病的敏感性也存在明显差异。

为了研究多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)在烟草中的生物学功能,运用生物信息学方法,结合RT-PCR和SMART RACE技术,从烟草中克隆到2个多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因c DNA和DNA全长序列,分别命名为Nt PGIP1(Gen Bank登录号:KF317203)和Nt PGIP2(Gen Bank登录号:KF317204)。Nt PGIP1基因全长为1 413 bp,编码338个氨基酸;Nt PGIP2基因全长为1 185 bp,编码329个氨基酸;两基因均没有内含子序列,核苷酸序列有50%的一致性,编码的氨基酸序列有54%的一致性。两基因编码蛋白均含有植物PGIP蛋白...

【目的】探索苹果树腐烂病菌致病力与胞外果胶酶的关系,筛选最佳产酶的碳、氮源,为揭示该病菌致病机理提供依据。【方法】用MS培养基培养苹果树腐烂病菌野生型菌株03-8及其2个突变体(致病力增强突变体X907,致病力丧失突变体T1)菌株,于5,10,15和20d取样,用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定其培养滤液中果胶酶的活性,探讨致病力与酶活性的关系。以野生型菌株03-8为供试菌株,改变MS培养基中的碳(葡萄糖、麦芽糖、根皮苷、果胶、可溶性淀粉)、氮(硫酸铵、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、L-天门冬酰胺)源培养03-8菌株,于5,10,15和20d取样,分别测定各培养滤液中果胶酶的活性,确定最佳碳...

【目的】探索苹果树腐烂病菌致病力与胞外果胶酶的关系，筛选最佳产酶的碳、氮源，为揭示该病菌致病机理提供依据。【方法】用MS培养基培养苹果树腐烂病菌野生型菌株03-8及其2个突变体(致病力增强突变体X907，致病力丧失突变体T1)菌株，于5，10，15和20 d时取样，用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定其培养滤液中果胶酶的活性，探讨致病力与酶活性的关系。以野生型菌株03-8为供试菌株，改变MS培养基中的碳(葡萄糖、麦芽糖、根皮苷、果胶、可溶性淀粉)、氮(硫酸铵、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、L-天门冬酰胺)源培养03-8菌株，于5，10，15和20 d时取样，分别测定各培养滤液中果胶酶的活性，确...

通过对酶活性的分析,研究证实苹果树腐烂病菌在活体外和寄主体内均能分泌一系列的细胞壁降解酶:多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、纤维素酶(Cx)、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶。不同碳源培养条件下,腐烂病菌产生细胞壁降解酶的活性及达到酶活性高峰的时间存在显著差异;诱导酶液对苹果愈伤组织具有明显的浸解作用,其中木聚糖为碳源产生的细胞壁降解酶,破坏能力最强。此外,研究发现,腐烂病菌在寄主体内产生细胞壁降解酶的活性变化规律不同,PMG和木聚糖酶在接种后最先被检测到活性显著升高,PMG酶活性于接种后第13天达到高峰,随后活性降低,而木聚糖酶和其他3种酶活性则随接种天数的增加活性不断增强;...