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[期刊] 中国农业科学
[作者]
赵海霞 肖欣 董玘鑫 吴花拉 李成磊 吴琦
【目的】建立和优化苦荞愈伤组织遗传转化体系，为苦荞基因功能验证及分子育种提供研究工具。【方法】以苦荞品种“西荞二号”为材料，对苦荞愈伤遗传转化条件进行优化，包括苦荞外植体类型、诱导愈伤的激素比例、继代培养基的激素比例及农杆菌类型。利用苦荞类黄酮生物合成关键酶基因FtCHS1的过表达验证优化后的遗传转化体系。通过PCR筛选和荧光观察鉴定阳性株系，采用紫外分光光度法和高效液相色谱法（high performance liquid,HPLC）测定花青素及黄酮醇支路代谢物含量，使用实时荧光定量PCR分析类黄酮合成相关基因的表达，比较FtCHS1过表达愈伤组织与对照组的差异。【结果】苦荞诱导愈伤组织的最佳外植体为下胚轴，其最适诱导培养基为MS+0.8 mg·L-1 6-BA+3.5 mg·L-1 2,4-D，诱导率达72%；最优继代培养基为MS+3 mg·L-1 6-BA+1 mg·L-1 KT，愈伤组织增殖率与增殖系数分别为98%和1.09；转化过程中的最佳农杆菌是GV3101，转化效率达31.3%;FtCHS1过表达愈伤组织中，花青素、芦丁和杨梅素的含量显著高于对照（P<0.05），山奈酚和槲皮素的含量极显著高于对照组（P0.05），而FtCHI、FtF3H、FtFLS1、FtFLS2、FtFLS3和FtDFR1等黄酮合成途径关键酶基因均上调表达（P<0.05）。此外，特异性正调控黄酮醇合成的转录因子基因FtMYB5和FtMYB6上调表达，而花青素合成抑制子基因FtMYB8的表达降低（P<0.05）。【结论】建立了苦荞愈伤组织遗传转化体系，过表达FtCHS1的苦荞愈伤组织通过上调黄酮合成相关基因的表达增加类黄酮物质的积累。
关键词：
苦荞 愈伤组织 遗传转化 查尔酮合酶基因
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
苏振琪 韩莹琰 李雅博 刘然 刘超杰 郝敬虹 范双喜
为研究叶用莴苣中Hsp70基因的功能,以提高其耐热性,构建LsHsp70-3701过表达载体,农杆菌介导法转化叶用莴苣。从叶用莴苣中克隆得到LsHsp70-3701,利用NcoⅠ和SpeⅠ双酶切LsHsp70-3701和植物表达载体pCAMBIA1304,回收目的片段并连接,经鉴定后获得过表达载体。以‘P-S11'叶用莴苣为转化材料,针对遗传转化关键因素:苗龄、植物激素浓度、预培养时间、侵染液OD值、侵染时间和共培养时间进行优化。试验结果表明最佳转化条件为:苗龄5d的子叶,6-BA 0.2mg/L+NAA
关键词：
莴苣 过表达载体 农杆菌 遗传转化
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
令狐斌 侯思宇 孙朝霞 黄可盛 路阳 韩渊怀 许冬梅
通过正交试验设计,比较苦荞序列相关多态性-聚合酶链式反应(Sequence related amplified polymorphism-polymerase chain reaction,SRAP-PCR)扩增反应体系的组合,选出最佳扩增体系用于苦荞SRAP分子标记进行遗传多样性分析。其中最佳SRAP-PCR反应扩增体系为Taq DNA聚合酶2 U、Mg2+1.5 mmol/L、DNA模板75ng、引物0.5μmol/L。从238对SRAP引物组合中筛选出20对多态性较高的引物组合,并对15个苦荞品种进行遗传多样性分析。结果表明:20对引物组合共扩增出128个位点,其多态性信息量(Polym...
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
龙萃 庞晓明 曹冠琳 刘颖 张志毅
为了建立农杆菌介导的高效毛白杨遗传转化体系,并大量获得转MdSPDS1基因的转基因毛白杨,对MdSPDS1基因导入毛白杨的遗传转化体系中关键转化因子进行了优化。获得的优化转化体系如下:叶片预培养3d后,用OD600为0.4的菌液侵染7min,再共培养3d。卡那霉素抗性芽的二次筛选中,卡那霉素的选择压分别为20和50mg/L。实验获得毛白杨卡那霉素抗性植株共43株,经PCR检测,其中9株呈阳性,占抗性植株总数的20.9%,优化转化系统的阳性植株转化率达到9.38%。本研究为下一步鉴定基因功能和转基因植株耐盐性的分析奠定了基础。
关键词：
MdSPDS1 遗传转化 毛白杨 农杆菌
[期刊] 中国农业科学
[作者]
殷冬梅 杨海棠 台国琴 杨秋云 崔党群
【目的】培育高油酸的花生新种质。【方法】以根癌农杆菌为介导将含有油酸脱氢酶基因的植物双元表达载体pFGC/2nd转入花生外植体丛生芽,通过卡那霉素筛选,器官发生再生转化植株;荧光定量PCR检测转基因植株。【结果】丛生芽外植体于OD600为0.6的农杆菌菌液中浸泡8～10min后,在MS培养基上暗培养3d效果较好。诱导筛选培养3个月左右,共得到16株转化植株,其中11个转基因植株经PCR检测呈阳性,说明外源基因已整合进入受体植物。进一步的荧光定量PCR检测显示,有4个植株基本上不表达或表达量很低。【结论】建立花生丛生芽遗传转化体系;RNA干扰对内源的油酸脱氢酶基因产生了抑制作用。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
高帆 张宗文 吴斌
【目的】从分子水平优化并构建用于中国苦荞种质资源遗传多样性分析的SSR分子标记体系,为综合评价中国苦荞种质资源提供依据。【方法】以50份苦荞种质为试验材料,用正交设计法[L16(45)]筛选适用于苦荞SSR标记分析的PCR反应体系,浓度梯度检测最佳胶分离效果,并从250对不同科属作物SSR引物中筛选出19对引物进行苦荞遗传多样性分析。【结果】优化的苦荞SSR反应体系为DNA模板30 ng,Taq酶2.0 U.L-1,dNTP、引物和Mg2+终浓度分别为150μmol.L-1、0.1μmol.L-1、2.0 mmol.L-1,总体积为25μL,6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。SSR引物筛选率为7.6...
关键词：
苦荞 SSR 遗传多样性
[期刊] 中国农业科学
[作者]
侯思宇 王欣芳 杜伟 冯晋华 韩渊怀 李红英 刘龙龙 孙朝霞
【目的】全基因组鉴定苦荞WOX(WUSCHEL-related homeobox)基因,揭示其基因家族成员序列特征、基因表达模式及与出愈率的相关性,为突破苦荞再生及遗传转化难题提供理论基础。【方法】基于同源性搜索策略,以拟南芥WOX基因蛋白为参考序列,进行苦荞全基因组比对,获得苦荞WOX基因家族成员蛋白及核酸序列。基于蛋白同源性及保守结构域分析,鉴定出苦荞WOX基因家族所有成员。同时使用TBtools软件展示FtWOXs家族成员基因结构、保守结构域及启动子顺式作用元件特征。比较分析WOX基因家族成员在苦荞与拟南芥之间的基因组共线性。基于邻近法,利用MEGA X软件构建苦荞、拟南芥和水稻WOX基因家族成员蛋白序列系统进化树。以MS+2,4-D 3.0 mg·L~(-1)+6-BA 1.0 mg·L~(-1)为愈伤诱导培养基,下胚轴为外植体,选取70份苦荞品种诱导愈伤组织,评价不同基因型的出愈率。qRT-PCR比较分析高、低出愈率苦荞品种间FtWOXs基因表达水平。基于Pearson相关系数分析出愈率与FtWOXs基因家族成员表达相关性。【结果】共鉴定出30个苦荞WOX基因成员,在苦荞8条染色体上呈现不均匀分布。系统进化树表明30个苦荞WOX基因可划分为3大类,不同类群中WOX基因包含不同的保守结构域,主要的保守结构域为HD(Homeodomain)、START和MEKHLA结构域。保守基序分析表明,FtWOXs基因家族成员所含保守基序数目的范围为2—10个。基因结构分析表明,FtWOXs基因家族成员所含外显子数目的范围为2—18个。顺式作用元件分析表明FtWOXs基因启动子富含26个不同种类的顺式作用元件。系统进化分析表明,30个苦荞、15个拟南芥和12个水稻WOX基因家族成员可分为3类,其中第3类为苦荞独有。基因组共线性分析表明,6个WOX基因在苦荞和拟南芥之间存在基因组共线性。表达模式及相关性表明,FtWOX1/FtWOX12/FtWOX22/FtWOX23/FtWOX24与苦荞出愈率存在正相关性。【结论】苦荞FtWOXs成员存在丰富的序列变异特征,不同苦荞基因型中WOX基因表达水平及出愈率存在明显差异和一定的相关性,揭示不同苦荞WOX基因具有潜在的功能多样性。
关键词：
苦荞 WOX基因 愈伤组织 基因表达
[期刊] 林业科学研究
[作者]
吴晓娟 鲁俊倩 常英英 钟姗辰 苏晓华 张冰玉
[目的]研究拟南芥甲基化转移酶基因AtMET 1在银腺杨84K(Populus alba×P. glandulosa ‘84K’)中的诱导表达特性,为建立杨树甲基化诱导变异体系、进而实现杨树品种改良等奠定基础。[方法]以白杨派优良品种84K杨的无菌苗叶片为受体材料,采用农杆菌介导法将化学诱导启动子与AtMET1基因导入84K杨基因组中;经潮霉素筛选获得抗性植株,通过常规PCR检测、DNA测序等方法对抗性植株进行鉴定。通过化学诱导剂17-β-雌二醇对随机挑选的1个转基因株系离体叶片进行诱导处理,处理时间为0、3、6、12、24、48、96、144 h,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测外源基因AtMET1表达量变化。[结果]本研究共获得了潮霉素抗性芽648个,经生根筛选获得18株抗性植株,经分子检测证实全部为转基因植株,分别标号为AM-1～18#。qRT-PCR结果显示:化学诱导剂17-β-雌二醇处理3 h时,目的基因AtMET1的表达量即达到最大值,随后在处理6 h时表达量下降,处理12 h时有所回升,处理24 h后表达量降低至不足12 h时的一半。[结论]化学诱导剂17-β-雌二醇能迅速有效地调控转基因杨树中AtMET1基因的表达,为进一步研究MET1基因在杨树基因组甲基化调控方面的作用机制奠定基础,也为今后杨树化学诱导表达研究及品种改良提供新思路、新方法。
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘雪华 宋琎楠 张玉喜 侯丽霞 于延冲 赵方贵 刘春英 董春海 杨洪兵
为深入研究液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白在植物耐盐中的作用,以耐盐苦荞麦品种川荞1号为材料,利用同源克隆方法得到NHX基因,命名为FtNHX1,并在Gen Bank中注册,登录号为KY438929;序列分析表明,该基因开放阅读框1 662 bp,共编码553个氨基酸,预测蛋白分子量61.24 kDa,等电点5.15。系统进化树分析表明,FtNHX1与拟南芥(AtNHX1)、水稻(OsNHX1)和小麦(TaNHX1)的亲缘关系较近,氨基酸同源率分别为60.22%,58.95%和57.30%;荧光定量PCR分
[期刊] 中国农业科学
[作者]
屈洋 周瑜 王钊 王鹏科 高金锋 高小丽 冯佰利
【目的】了解苦荞产区种质资源遗传多样性和遗传结构，为苦荞资源的有效利用提供参考。【方法】采用相关性分析、主成分分析方法对苦荞８个植株性状进行分析；温室内培养苦荞资源，于３叶期，每个资源选取１０株新鲜叶片，采用ＣＴＡＢ方法提取苦荞基因组ＤＮＡ，结合ＳＳＲ分子标记方法进行ＰＣＲ扩增，然后对扩增产物进行电泳检测并照相保存，根据ＳＳＲ检测位点构建［０，１］矩阵，最后利用ＰｏｗｅＲ ＭＡＲｋｅＲ３．２５和ＳＴＲｕＣＴｕＲｅ２．３．４软件对８３份苦荞种质资源进行遗传多样性和群体遗传结构分析。【结果】８个植株性状分布较分散，大部分植株性状间呈现显著相关，植株性状的前４个主成分累计贡献率达到８５．２２％，基本．．．
[期刊] 中国农业科学
[作者]
侯雅君 张宗文 吴斌 李艳琴
【目的】从分子水平研究苦荞种质资源的遗传多样性,为综合评价苦荞种质资源提供依据。【方法】用筛选出的20对AFLP引物,对14个不同地理来源的165份苦荞种质进行遗传多样性分析。【结果】共扩增出938条清晰的条带,其中314(33.48%)条呈多态性,平均每对引物组合的条带数和多态性带数分别为46.9个和15.7个。不同地理来源苦荞种质的Shannon-Weaver多样性指数为0.1093～0.2661,四川资源群最高,青海、云南和甘肃/宁夏等资源群次之,湖南资源群最低。利用Popgen Ver.1.32软件,依不同地理来源苦荞资源群间Nei′s遗传一致度可聚类成5个组,聚类结果与苦荞地理分布相...
关键词：
苦荞 AFLP 种质资源 遗传多样性
[期刊] 中国水产科学
[作者]
李亚亚 陈松林 林帆 王娜 刘洋 黄进强
利用半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)dmrt1基因和青鳉(Oryzias latipe)dmrt1基因构建过表达载体,采用显微注射技术将两种载体分别导入青鳉受精卵中,比较异源和同源dmrt1基因对青鳉胚胎孵化率的影响以及两种dmrt1基因在青鳉体内的基因整合率、基因表达率及对芳香化酶基因(cyp19a)表达的影响。结果表明,注射48 h后,两种载体均在胚胎内大量表达,注射青鳉同源性dmrt1载体的受精卵孵化率(69.5%)要显著高于注射异源性dmrt1载体的受精卵(36.5%)。30 dph(days post hatching)两组被注射稚鱼均能检测到基因整合,注射同...
[期刊] 华北农学报
[作者]
李洪有 张素芝 陈庆富
CorA/MRS2/MGT-型镁离子转运蛋白在维持植物镁离子平衡中具有重要作用。为探讨一个表达受缺镁胁迫诱导的玉米MRS2/MGT-型镁离子转运蛋白基因ZmMGT10在缺镁胁迫中的功能,构建了ZmMGT10的过表达载体并遗传转化拟南芥,获得了转基因拟南芥株系。同野生型拟南芥植株相比,过表达ZmMGT10增加了低镁胁迫生长下转基因植株的生物量、根长和叶绿素浓度。进一步研究表明,在低镁生长条件下,转基因植株的根和叶中积累的镁离子含量均明显高于野生型植株。此外,在低镁生长条件下,转基因植株根对镁离子的吸收能力明
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘义杰 陈四龙 程增书 王瑾 宋亚辉 郝军会 张朋娟 李玉荣
为了明确花生ＡｈＰＬＤα基因在响应干旱胁迫信号传导中的功能和作用机制，以ＡＢＡ处理的冀花４号花生叶片ｃ ＤＮＡ为模板，用ＲＴ－ＰｃＲ方法扩增ＡｈＰＬＤα１和ＡｈＰＬＤα２的全长ｃＤＳ片段，采用酶切－连接的方法分别将这２个基因定向克隆到植物表达载体Ｐ ＢＡＲ－Ｆ３上，冻融法将重组子转入根癌农杆菌ＧＶ３１０１，利用改良ＦＬｏＲＡＬ－ＤｉＰ法将过表达质粒转入拟南芥。菌落ＰｃＲ和酶切结果表明，ｃＡ ＭＶ３５Ｓ启动子驱动的过表达载体重组质粒Ｐ ＢＡＲ－ＡｈＰＬＤα构建正确。通过ＲＴ－ＰｃＲ和ｑＲＴ－ＰｃＲ验证，表明ＡｈＰＬＤα１和ＡｈＰＬＤα２基因整合到拟南芥基因组中并能过量表达，获得了阳性转基因纯合株．．．
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
蔡英卿 赖钟雄 陈义挺 林玉玲 李惠华 张妙霞
分离克隆了龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织Leafy Cotyledon 1(LEC1)基因,并分析该基因在龙眼体细胞胚胎(简称体胚)发生过程中的表达情况.采用RT-PCR结合RACE法及TAIL-PCR法,获得龙眼胚性愈伤组织LEC1基因的cDNA全长序列,运用生物信息学方法对该序列进行分析,并通过实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)研究该基因在龙眼体胚发生过程中的表达.克隆得到LEC1基因803 bp的cDNA全长序列(GenBank检索号为GU584089.2),该cDNA的开放阅读框推定的氨基酸序列(含222个氨基酸)与其他植物LEC1具有较高同源性...
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