为分析苜蓿素对脂多糖诱导下体外培养奶牛乳腺上皮细胞抗炎和乳蛋白合成相关基因表达的影响,本研究将体外培养的奶牛乳腺上皮细胞分成4组,即基础培养基(对照)和基础培养基中分别加入1μg·m L-1LPS(L)、1μg·m L-1LPS+10μg·m L-1苜蓿素(L+T)和10μg·m L-1苜蓿素(T)。结果显示,1)与对照组相比,L组奶牛乳腺上皮细胞的活性显著下降(P<0.05),而T组则显著升高(P<0.01)。2)L+T组细胞的超氧化物歧化酶(SOD)活性显著高于L组(P<0.01),而一氧化氮(NO)

[目的]本试验旨在探讨去乙酰化蛋白7(sirtuin 7,SIRT7)对奶牛乳腺上皮细胞(DCMEC)合成乳蛋白、乳脂和乳糖关键基因表达的影响。[方法]以体外原代培养的中国荷斯坦奶牛DCMEC为试验材料,纯化后转染质粒p CDNA3.1-SIRT7,继续培养48或72 h后收集细胞。采用RT-qPCR和Western blot法检测乳蛋白、乳脂和乳糖合成关键基因mRNA和蛋白的表达;通过特异性试剂盒检测胞内和培养基中甘油三脂(TG)含量。[结果]1)乳蛋白:与对照组相比,过表达SIRT7可显著提高αs1-酪蛋白基因(CSN1S1)、β-酪蛋白基因(CSN2)和ETS转录因子基因(ELF5) mRNA水平,促进CSN2蛋白合成,激活雷帕霉素靶蛋白(m TOR)磷酸化; 2)乳脂:与对照组相比,过表达SIRT7可显著提高乳脂合成关键因子过氧化物酶增殖体激活受体γ(PPARγ)、固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1) mRNA和蛋白水平,显著增加细胞内甘油三酯(TG)含量; 3)乳糖:与对照组相比,过表达SIRT7可显著提高乳糖合成关键因子葡萄糖转运蛋白1(GLUT1) mRNA表达。[结论]在体外培养条件下,过表达SIRT7可促进DCMEC中乳蛋白、乳脂和乳糖合成关键基因的表达。

【目的】硒(Se)能否通过Nod2/MAPK/mTOR途径调控金黄色葡萄球菌诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤,有待于进一步研究。因此本研究将探究硒对金黄色葡萄球菌(S. aureus)感染的奶牛乳腺上皮细胞(bMECs)Nod2/MAPK/mTORs信号通路中关键蛋白表达的影响,从而为阐明硒的免疫调控机制提供理论依据。【方法】首先将bMECs以106细胞/孔接种于6孔板中,当细胞超过80%的汇合度时,用含2、4和8μmol·L~(-1)浓度硒的培养基替换原来的培养基,继续孵育12 h,然后用PBS洗涤每孔3次,将S. aureus按MOI=1:1的比例加入6孔板中,继续培养0.5 h,然后收集bMECs细胞进行相关蛋白的检测。本试验共分3大组,即对照(Con)组(bMECs)、模型(Mod)组(bMECs+S. aureus)和试验组。其中试验组又分3个亚剂量组,即Low组(bMECs+2μmol·L~(-1) Se+S. aureus)、Mid组(bMECs+4μmol·L~(-1) Se+S. aureus)和Hig组(bMECs+8μmol·L~(-1) Se+S. aureus),每组设3个重复。利用BCA蛋白测定试剂盒对收集的bMECs细胞进行总蛋白提取。应用Western blotting技术检测bMECs中Nod2和RIP2蛋白表达水平及JNK,AKT和mTOR蛋白磷酸化水平。将蛋白样品加到10%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中,上样量为20μg/孔,之后将蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。将PVDF膜用5 mL 5%脱脂乳阻断2 h,脱脂乳脱脂后用TBST清洗后,分别用5 mL的Nod2、RIP2、JNK、AKT、mTOR和β-actin的一抗孵育过夜,回收一抗。之后在PVDF膜中分别加入5 mL上述蛋白的二抗,室温孵育2 h,回收二抗。PVDF用TBST洗涤5次,最后在暗室条件下进行化学显影。【结果】S. aureus能显著提高bMECs中Nod2和RIP2蛋白表达水平及JNK,AKT和mTOR蛋白磷酸化水平(P<0.01)。在培养基里添加2μmol·L~(-1)的硒可极显著抑制Nod2蛋白的表达(P<0.01),在培养基里添加8μmol·L~(-1)的硒可显著抑制Nod2的表达(P<0.05),而在培养基里添加8μmol·L~(-1)硒可显著抑制RIP2蛋白的表达(P<0.01)。在培养基里添加4μmol·L~(-1)的硒能显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平(P<0.05),在培养基里添加8μmol·L~(-1)的硒能显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平(P<0.01)。在培养基里添加4μmol·L~(-1)硒可极显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平(P<0.01),在培养基里添加8μmol·L~(-1)硒可显著抑制AKT蛋白的磷酸化水平(P<0.01)。在培养基里分别添加4μmol·L~(-1)和8μmol·L~(-1)硒均能显著抑制mTOR蛋白磷酸化水平(P

【背景】奶牛乳腺炎是奶牛中危害最严重的疾病之一，严重影响乳品质，不仅造成经济损失，甚至危及人类健康。已有研究表明，lncRNAs广泛参与人和动物的炎症和免疫调节。lncRNA RRAS2-AS1是我们在前期研究中新发现的差异表达lncRNA，其表达模式和功能尚不清楚。【目的】通过探究lncRNA RRAS2-AS1在奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells, bMECs）炎症反应中的作用机制，为奶牛乳腺炎的分子调控机制解析和抗乳腺炎分子选育提供理论依据。【方法】利用RT-PCR和RACE等技术进行了lncRNA RRAS2-AS1的克隆，并通过生物信息学方法进行lncRNA RRAS2-AS1的靶基因预测及功能富集分析；利用细胞免疫荧光技术鉴定bMECs，利用细胞核质分离及半定量PCR技术检测了lncRNA RRAS2-AS1的亚细胞定位情况；采用qRT-PCR检测了lncRNA RRAS2-AS1在脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导bMECs炎症反应和乳腺炎奶牛乳腺组织中的表达模式；利用LPS诱导bMECs构建了炎症细胞模型，在此基础上，通过lncRNA超表达、qRT-PCR和ELISA等技术研究了lncRNA RRAS2-AS1对炎性bMECs内的促炎细胞因子基因、增殖相关基因和凋亡相关基因在mRNA和（或）蛋白质水平表达的影响，同时采用EdU、CCK-8和流式细胞术进一步验证了lncRNA RRAS2-AS1对bMECs增殖、活力和凋亡的影响。【结果】lncRNA RRAS2-AS1基因的长度为363 bp，主要定位于细胞质中。表达量检测结果表明，与对照组相比，lncRNA RRAS2-AS1在LPS诱导炎症的bMECs和乳腺炎组织中的表达量显著下调（P<0.05）;lncRNA RRAS2-AS1超表达试验结果表明，与对照组相比，lncRNA RRAS2-AS1超表达组的炎症信号通路关键基因（TLR4和NF-κB1）、促炎细胞因子基因（IL-1β、IL-6和IL-8）、促凋亡基因（BAD、CASP3和BAX等）的表达量显著下调（P<0.01），而增殖标志基因（CDK2、CDK4和PCNA）的表达量显著上调（P<0.05）。此外，lncRNA RRAS2-AS1超表达组的细胞活力显著增加（P<0.05），而bMECs的凋亡率极显著降低（P<0.01）。【结论】lncRNA RRAS2-AS1在LPS诱导bMECs的炎症反应和乳腺炎奶牛的乳腺组织中均显著下调；超表达lncRNA RRAS2-AS1可下调促炎细胞因子IL-6、IL-8和IL-1β在mRNA和蛋白质水平的表达，并促进细胞活力和增殖、抑制细胞凋亡，从而减轻LPS诱导的bMECs炎症反应，该结果可为解析奶牛乳腺炎的分子调控网络奠定了基础。

[目的]本试验旨在研究不同剂量的重组牛脂多糖结合蛋白(rb LBP)作用于脂多糖(LPS)诱导的奶牛乳腺炎模型,探讨rb LBP对奶牛乳腺炎症反应的影响及其作用机制。[方法]选4头泌乳中后期、体质量为(500±25)kg的健康经产荷斯坦奶牛,采用4×4拉丁方设计,试验分为对照组、LPS(0.2μg·kg-1)模型组、低剂量rb LBP(1μg)处理组、高剂量rb LBP(20μg)处理组,分4期进行,每期15 d。[结果]灌注LPS后,奶牛发生乳腺炎症反应;与LPS模型组相比,低剂量rb LBP加剧LPS诱导的炎症反应,表现为组织髓过氧化物酶(MPO)活性明显升高(P<0.05),炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的基因及蛋白表达量显著升高(P<0.05),TLR4和NF-κB的表达明显上调(P<0.05),炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达量显著降低(P<0.05),TLR4和NF-κB的表达显著下调(P

旨在探索不同浓度玉米赤霉烯酮(ZEN)对奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)生长和乳脂合成相关基因表达的影响。首先，用不同剂量ZEN处理MAC-T细胞36 h,血细胞计数板统计细胞数量，染色并分析细胞凋亡与坏死情况，筛选ZEN添加的合适剂量；接着，试剂盒检测ZEN对MAC-T细胞中活性氧(ROS)以及线粒体膜电位的影响；最后，利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术，分析ZEN对MAC-T细胞增殖、凋亡、氧化应激和乳脂合成相关基因表达的影响。结果表明，低剂量ZEN(0.01～1.00μmol/L)有促进MAC-T生长的趋势，而高剂量ZEN(5.00～10.00μmol/L)显著降低MAC-T细胞数量；0.10μmol/L ZEN对MAC-T中ROS和线粒体数量无明显影响，但10.00μmol/L ZEN显著增加了MAC-T中ROS水平，降低了线粒体数量；RT-qPCR结果表明，0.10μmol/L ZEN显著促进增殖基因(CDK1、CCND2)、抗氧化基因(DHODH、GPX4)和抗凋亡基因(BCL-2)表达，但同时提高了凋亡基因(CAS-3、BAX)表达量；10.00μmol/L ZEN显著抑制增殖基因(PCNA、CDK1、CCND2)、抗氧化基因(DHODH、GPX4、AIFM2)和抗凋亡基因(BCL-2)表达，但显著促进凋亡基因(CAS-3、BAX)表达；值得注意的是，0.10μmol/L ZEN显著促进了乳脂合成相关基因(PPARγ、FASN、JAK-2),但10.00μmol/L ZEN显著抑制了这些基因表达。上述结果提示，不同浓度ZEN对MAC-T细胞的作用存在差异：0.10μmol/L ZEN可以促进MAC-T细胞生长和乳脂合成相关基因表达的同时，也会诱导凋亡基因表达；10.00μmol/L ZEN会诱导MAC-T细胞氧化应激、降低线粒体数量，抑制增殖、抗氧化、抗凋亡和乳脂合成相关基因表达，同时促进凋亡基因表达，导致细胞死亡。

[目的]本文旨在了解瘦素(LEP)对牦牛乳腺上皮细胞(YMEC)中细胞信号转导抑制因子3(SOCS3)和信号传导及转录激活蛋白3(STAT3)蛋白表达的作用特点及催乳素(PRL)对LEP功能发挥可能产生的影响。[方法]以牦牛乳腺上皮细胞为载体，以添加和不添加催乳素(500 ng·mL~(-1))为前提，用不同剂量瘦素(0、50、100、200、400、800 ng·mL~(-1))作用YMEC 48 h以及添加JAK2/JAK3信号通路阻滞剂AG490作用48 h,采用Western blot技术检测SOCS3和STAT3蛋白的相对表达水平及STAT3蛋白磷酸化水平。[结果]无催乳素时，除50 ng·mL~(-1)瘦素外，其余各剂量均抑制SOCS3蛋白的表达，而各浓度LEP均抑制STAT3蛋白的表达，STAT3蛋白磷酸化水平高于蛋白表达水平。有催乳素时，SOCS3蛋白除了在100 ng·mL~(-1) LEP下被抑制之外，其余各剂量均有促进作用；800 ng·mL~(-1) LEP对STAT3蛋白表达有显著抑制作用，STAT3磷酸化水平除100 ng·mL~(-1)组外，均有所升高。添加AG490之后，SOCS3与STAT3都主要是通过JAK2激活诱导。[结论]高浓度瘦素会抑制SOCS3及STAT3蛋白的表达，瘦素主要通过JAK2/STAT3通路发挥生理功能，而SOCS3是JAK2/STAT3通路的负反馈调节因子；PRL能够缓解高浓度LEP导致的瘦素抵抗作用，并且能促进SOCS3和STAT3蛋白的表达。

【目的】为探究2个候选lncRNA（lncRNA TCONS-72171和lncRNA TCONS-62349）在奶牛乳腺上皮细胞炎症模型中的表达与功能分析。【方法】利用基因克隆和测序技术验证候选lncRNA的真实性；并进行候选lncRNA序列同源性、亚细胞定位、靶基因预测及KEGG信号通路分析。此外，利用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导奶牛乳腺上皮细胞产生炎症反应；采用RT-qPCR技术检测LPS诱导0、3、6和12 h的奶牛乳腺上皮细胞内上述2个候选lncRNAs的表达情况。【结果】奶牛lncRNA TCONS-72717和lncRNA TCONS-62349真实存在，且在部分物种间高度保守；上述2个lncRNA在LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞中表达均呈极显著上调（P＜0.01），且分别主要位于细胞质与细胞核。靶基因预测与KEGG信号通路分析预测结果显示，上述2个lncRNA的潜在靶基因（LCP2、ALOX12和ASGR1等）可能通过JAK-STAT、NF-κB和MAPK等炎症相关的信号通路而发挥调控细胞炎症的作用。【结论】表达上调的lncRNA TCONS-72171和lncRNA TCONS-62349可能在LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎症中发挥重要的调控作用，该结果可为深入研究奶牛乳腺炎分子调节机制奠定基础。

【目的】探讨TGF-β1对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡和HSP70蛋白表达的影响。【方法】TGF-β1作用乳腺上皮细胞不同时间,收集细胞及培养液,应用MTT检测细胞增殖、流式细胞术检测细胞凋亡率、比色法检测LDH活性、琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性、Western bolt技术分析HSP70蛋白的表达量。【结果】1、5、10ng·ml-1的TGF-β1均能抑制乳腺上皮细胞的增殖,且随浓度增加抑制作用加大,呈现剂量依赖性,其中10ng·ml-1TGF-β1组与对照组差异显著(P<0.05);10ng·ml-1TGF-β1作用于乳腺上皮细胞,随着作用时间的延长,细胞凋亡率逐渐升高,其中6、12和24...

[目的]本试验旨在研究黄芪多糖(APS)对H_2O_2诱导的奶牛乳腺上皮细胞凋亡、氧化损伤及相关基因、蛋白表达的影响。[方法]体外培养奶牛乳腺上皮细胞并用H_2O_2(600μmol·L~(-1),2 h)诱导建立乳腺上皮细胞氧化应激模型;试验分组:空白对照组、H_2O_2组、H_2O_2+APS组(8 mg·mL~(-1)APS)。[结果]与空白对照组相比,H_2O_2组细胞活力显著下降(P<0.05);与H_2O_2组相比,H_2O_2+APS组的细胞凋亡率和细胞中的活性氧(ROS)含量均显著降低(P<0.05),而超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性显著升高(P<0.01),Bax蛋白表达水平显著降低(P<0.05),且APS降低了H_2O_2诱导细胞凋亡率。[结论]APS能够提高H_2O_2诱导的奶牛乳腺上皮细胞抗氧化酶活性,并减缓氧化损伤引起的奶牛乳腺上皮细胞凋亡。

【目的】采用real-time PCR方法检测体外激素处理对奶牛乳腺上皮细胞FcRn(neonatal Fc receptor,FcRn)mRNA表达的影响。【方法】在乳腺上皮细胞培养液中添加不同浓度胰高血糖素(0.01、0.1和1μmol.L-1)、胰岛素(0.005、0.1和0.5μmol.L-1)、甲状腺素T4(0.01、0.1和1μmol.L-1),体外培养并收集细胞,提取细胞mRNA后,利用real-time PCR检测FcRn mRNA的相对丰度。【结果】在一定添加剂量范围内,随着添加剂量的增加,甲状腺素和胰高血糖素能够显著地促进FcRn mRNA表达量升高(P<0.05),胰岛素...

为阐明甲状腺素及胰高血糖素对高温体外培养奶牛乳腺上皮细胞内热休克蛋白(HSPs)mRNA转录和蛋白表达的影响。本试验对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞添加不同浓度的甲状腺素、胰高血糖素,分别于42℃培养12 h。采用RT-qPCR方法检测细胞内HSF-1、HSP27、HSP70和HSP90的mRNA表达丰度,ELISA方法检测HSP27、HSP70和HSP90的蛋白质表达。各浓度的甲状腺素、胰高血糖素均能显著降低高温条件下奶牛乳腺上皮细胞中HSP27、HSP70和HSP90 mRNA表达丰度(P<0.05);各浓度的胰高血糖素能极显著的降低高温条件下HSP27、HSP70和HSP90的蛋白表达(P<...

[目的]本试验旨在揭示胆碱对热应激诱导的奶牛乳腺上皮细胞凋亡的抑制作用。[方法]奶牛乳腺上皮细胞系(MAC-T细胞)于含10%胎牛血清的DMEM培养基中进行体外培养,将细胞分为对照组、胆碱组(100μmol·L~(-1))、热应激组(42℃,2 h)、热应激+胆碱组。采用CCK-8法分析添加胆碱对MAC-T细胞的药物毒性及细胞增殖活性的影响,采用Western blot分析蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)磷酸化水平及激活转录因子4(ATF-4)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)和Bcl-2关联X(Bax)蛋白表达水平,RT-qPCR检测GRP78、CHOP、ATF-4、Bax、Bcl-2、Caspase-3(胱氨酸蛋白3基因)mRNA水平。[结果]与对照组相比,热应激组MAC-T细胞的相对存活率极显著降低(P<0.01),p-PERK、ATF-4、CHOP、GRP78和Bax蛋白表达量极显著升高(P<0.01),Bcl-2表达量极显著下降(P<0.05),p-PERK、ATF-4、CHOP、GRP78和Bax蛋白表达量均极显著下降(P<0.01),Bcl-2蛋白表达量升高(P

【目的】研究中药复方灌注液及其中的单味中药提取物对原代培养的奶牛乳腺上皮细胞增殖及总蛋白含量的影响。【方法】采用原代组织块贴壁法获得奶牛乳腺上皮细胞,以质量浓度为5,10,15和20mg/mL的中药复方灌注液以及紫花地丁、黄芪、泽兰、鸡血藤、诃子提取物,分别作用于对数生长期的奶牛乳腺上皮细胞,确定最适宜中药质量浓度,采用该质量浓度提取物处理对数生长期的乳腺上皮细胞,并分别在处理的1,3和5d时取样,采用四甲基偶氮唑盐法(MTT法)检测细胞活性,并测定细胞分泌的总蛋白含量。【结果】通过组织块贴壁与胰蛋白酶消化法相结合,得到较纯化的奶牛乳腺上皮细胞。泽兰、鸡血藤、复方灌注液在质量浓度为10mg/m...

【目的】固醇调节元件结合蛋白１（ＳＲＥＢＰ１）作为核转录因子，对于细胞脂肪合成酶基因的表达发挥着重要的调控作用。论文旨在奶牛乳腺上皮细胞中研究ＳＲＥＢＰ１对于ＳＣＤ１基因启动子的转录调控作用，为进一步明确ＳＲＥＢＰ１对于靶基因的转录调控机制提供理论基础。【方法】以荷斯坦奶牛乳腺组织的Ｃ ＤＮＡ为模板，采用分段克隆的方法获得ＳＲＥＢＰ１基因的编码序列，通过重组酶与ＰＣ ＤＮＡ３．１载体进行重组环化构建ＰＣ ＤＮＡ３．１－ＳＲＥＢＰ１表达载体，将构建的载体测序验证后提取质粒，转染奶牛乳腺上皮细胞。以ＥＩＦ３Ｋ基因为内参基因，采用荧光定量ＰＣＲ检测ＳＲＥＢＰ１基因ｍ ＲＮＡ的表达差异；采用免疫荧光的．．．