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[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
李今煜 肖水华 黄天培
以苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki)8010为研究材料,通过PCR技术获得Bt 8010菌株NAD(P)H:醌氧化还原酶基因上下游2个片段,以含有卡那霉素抗性基因的pDG780质粒为中间载体,通过酶切、连接和PCR,构建含待敲除NAD(P)H:醌氧化还原酶基因上下游片段、卡那霉素抗性基因的重组质粒pRN5101DKU,为后续Bt8010菌株NAD(P)H:醌氧化还原酶基因的敲除做准备.
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
李今煜 潘智雄 黄天培
以苏云金芽孢杆菌(Bt)库斯塔克亚种(subsp.kurstaki)8010为研究材料,通过PCR技术获得Bt 8010的外孢囊蛋白基因上下游序列,以含有卡那基因的pDG780质粒为中间载体,通过酶切、连接和PCR,构建含外孢囊蛋白基因上游序列、卡那基因、外孢囊蛋白基因下游序列的基因敲除载体pRN5101UKD,为后续外孢囊蛋白基因敲除工作做准备.
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
黄天培 潘洁茹 李今煜 洪永聪 黄志鹏
通过设计蛋白酶基因引物,对苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)库斯塔克亚种菌株8010蛋白酶基因进行克隆,获得了6个蛋白酶基因片段,即中性蛋白酶A、色氨酸合成酶β链、色氨酸合成酶α链、碱性蛋白酶A、磷酸化水解酶和糖原磷酸化酶基因,以及1个未知功能的DNA片段(可能是编码蜡质芽孢杆菌组特有蛋白的基因).
关键词：
苏云金芽孢杆菌 克隆 蛋白酶 序列分析
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
刘卿 梁运祥 葛向阳
在腊样芽胞杆菌DNF409中,narGHJI基因负责编码呼吸过程中硝酸盐还原酶基因nar的α、β、γ、δ四个亚基。通过基因同源重组的方法,利用一段带有终止序列和Ω环的链霉素抗性片段,取代nar中的部分基因片段,实现硝酸盐还原酶的基因敲除,从而得到专一降解亚硝酸盐的突变体菌株,其硝酸盐还原酶的活性降低了80%。该菌与DNF409共同使用,可解除DNF409单独使用时亚硝酸盐严重积累的现象。
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
杨兆辉 汪子洋 杨文涛 蔡瑜婷 谭伟龙 黄恩炯 张灵玲
乙酰化是蛋白质翻译后修饰的一种重要方式,可参与多种细胞进程,但迄今未见有关乙酰化修饰在Bt中发挥作用的报道.本课题组前期通过对高效杀虫Bt菌株LLP29的基因组进行测序分析,发现该菌株也存在编码乙酰转移酶的基因(如ykkB).为探讨乙酰化修饰在Bt菌株中的作用,以ykkB为靶标,利用无缝克隆技术成功克隆与测序了ykkB基因.通过生物信息学分析,发现该基因编码的蛋白可能是一类N-乙酰转移酶,赖氨酸和亮氨酸含量最高,半胱氨酸含量最低,是一种亲水性蛋白质,且无跨膜区;同时,成功表达、纯化了YkkB蛋白,通过体外自乙酰化分析,证实该蛋白可发挥乙酰基转移的作用.
[期刊] 中国农业科学
[作者]
邵铁梅 宋福平 李卓夫 张杰 姜声华 刘大群 黄大昉
通过PCR方法筛选160株苏云金芽孢杆菌,其中94株含有zmaR基因。测定了含zmaR基因的菌株培养物上清液对草生欧文氏杆菌(Erwiniaherbicola)的抑菌活性,结果表明有67株菌有抑菌活性,其中21株抑菌活性较高。经鉴定,抑菌活性较高的G03菌株含有cry1Ac、cry1Aa、cry1Ca和cry2Ab等高毒力杀虫基因,并从G03中克隆了zmaR全长基因,完成了序列测定。该基因编码区为1125bp,由核苷酸序列推导的氨基酸残基组成为375个,分子量为43.5kD,等电点pI4.945。通过载体pET-21b将zmaR基因导入大肠杆菌BL21,可正常表达43.5kD蛋白,并使宿主菌产...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
蒋冬花 邓日强 庞义 余健秀 龙綮新
选用土壤新分离株Ｓ１８－４为供体菌，以ＰＨＴ３１０１穿梭质粒为载体，载体和供体ＤＮＡ用Ｐｓｔｌ酶切后进行连接，用电激法将重组质粒转入苏云金芽孢杆菌无晶体突变株Ｂｔｋ·ＢＥ２０中。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳及扫描电镜观察，证明δ－内毒素基因得到了表达，并具有很高的表达量。生物测定结果显示，重组株对夜蛾科幼虫具有比野生株Ｓ１８－４更强的杀虫毒性。
关键词：
苏云金芽孢杆菌 δ-内毒素 克隆 表达
[期刊] 西南农业学报
[作者]
赵直 吴钢 王闵霞 朱旭东 蒲志刚 张志勇 彭正松 蔡平钟
以分离的3株苏云金芽孢杆菌质粒为模板,通过设计一对特异引物,PCR扩增得到3条全长3.6 kb的基因序列,其各自都包含一个完整的开放阅读框,编码序列全长分别是3468、3450、2697 bp(Genebank登录号分别为GQ385073,GQ385074,GQ385075);它们与cry1A类基因同源性都高达95%以上;分别编码1159、1150和902个氨基酸。并在此基础上采用生物信息学方法对这3个基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、跨膜结构域、疏水性/亲水性、亚细胞定位、跨膜结构域以及功能域等方面进行了预测和分析。为转基因抗虫植物和微生物杀虫工程菌的构建提供了基因来源。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
冯纪年 李陇梅 张兴
根据GenBank中cry2Ad基因序列设计1对特异性引物,以苏云金芽孢杆菌新菌株S249质粒 DNA为模板,应用PCR扩增技术得到了1条大小约为2．0 kb的DNA片段(cry2Ad2)。通过引物步行法测定该片段长1919 bp,其中开放阅读框(ORF)长1902 bp,编码633个氨基酸;经DNASTAR软件分析,预测其蛋白分子量为70．72 ku,等电点pI=8．26。序列比较结果表明,该基因与cry2Ad类基因高度同源(同源性达99%)。该基因已在GenBank中登录,登录号为DQ219823,并被Bt δ-内毒素基因国际命名委员会正式命名为cry2Ad2。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
洪玉枝 刘子铎 汤江武 喻子牛
将苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白ＣｒｙⅠＡ基因的高保守区ＥｃｏＲＩ－Ｆ片段重组到ｐＳＥＬＥＣＴ－１载体的ＥｃｏＲＩ位点，构建出能够高效转录ＲＮＡ的探针载体ｐＳＢＰＬ－１。该载体在Ｔ７ＲＮＡ聚合酶作用下，通过ＤＩＧ体外标记转录制备的ＲＮＡ探针，具有灵敏度高，背景清楚，省时等优点，为苏云金芽胞杆菌分子生物学研究，及对鳞翅目有特异毒性高效菌株的筛选提供了一种方便而有效的方法。
关键词：
苏云金芽胞杆菌 体外转录 RNA探针载体
[期刊] 华北农学报
[作者]
胡苗清 姚明泽 张耀华 付月君 梁爱华
对分离得到的两个菌株(B.H和B.M)进行鉴定,并对它们在芽孢杆菌培养基和淀粉富集培养基上的形态进行观察,通过对其16S rDNA序列的分析,构建系统进化树,确定B.H为枯草芽孢杆菌,B.M为解淀粉芽孢杆菌。根据已报道的枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌淀粉酶基因保守区域设计引物,分别以两个菌株的基因组DNA为模板,采用PCR扩增的方法成功获得两个淀粉酶基因,其编码区的长度分别为1 434 bp和1 563 bp,为该菌株的进一步利用开发提供了数据支持。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
黄莎莎 何鹏飞 何月秋 李兴玉 吴毅歆
【目的】二斑叶螨是一种分布于世界各温带、亚热带地区的害螨，其防治成已为农作物虫害亟待解决的重要问题之一。W1菌株是从自然死亡二斑叶螨虫体内分离出来，对二斑叶螨有高致死性的解淀粉芽孢杆菌。研究拟通过构建W1菌株突变体及其杀螨抑菌活性检测以从分子水平探究并验证此菌株的杀螨机理，为二斑叶螨的防治提供一种新的微生物资源和防治策略，为后续开发利用更多微生物资源奠定基础，也为新型微生物杀螨剂的研发与应用提供理论基础。【方法】前期对解淀粉芽孢杆菌W1的次级代谢产物的活性化合物进行研究，已确定其对二斑叶螨的杀虫活性物质为二酮哌嗪类，大环内酯类及巨杆菌素类等化合物。大环内酯类化合物中以大环内酯A为主要杀螨活性物质，而大环内酯A是由mln基因簇调控合成。通过构建敲除整合载体pBS-mlnB-kan~(R)转化导入W1菌株自然感受态细胞等操作，获得了其杀螨活性化合物——大环内酯生物合成缺陷突变体W1 △mlnB::kan~(R)，利用PCR扩增及产物测序和HPLC-MS/MS技术证实敲除突变体的成功构建，并检测其杀螨抑菌活性。【结果】mlnB基因的敲除不仅导致W1菌株无法合成大环内酯A，还削弱了其对大白菜软腐病菌、柑橘溃疡病菌、大白菜黑腐病菌及茄科青枯菌的拮抗活性，相比W1野生型菌株二斑叶螨的致死率73.33%～77.22%，大环内酯合成缺陷突变体的杀螨活性也下降了46.66%～50.55%。【结论】解淀粉芽孢杆菌W1菌株合成的大环内酯A具有杀二斑叶螨活性，同时还能抑制大白菜软腐病菌、柑橘溃疡病菌、大白菜黑腐病菌以及茄科青枯病菌。大环内酯A合成受阻后，W1菌株的活性均明显地被削弱。
[期刊] 华北农学报
[作者]
王志鑫 束长龙 申培立 苏旭东 李志辉 于妍 张先舟 马雯 檀建新
为发掘对蛴螬有防治作用的苏云金芽孢杆菌及其cry基因,在河北省各县市共采集土壤样品254份,采用温度筛选法分离出Bt菌株42株,经PCR-RFLP方法鉴定,其中10株含有cry8型基因。这些菌株有如下特点:同一菌株含1种或多种质粒;PCR-RFLP鉴定证明有多种cry8基因存在,多数菌株中含2种cry8基因,如cry8E和cry8F常共存于同一菌株中;Cry8杀虫晶体蛋白分子量约为130~140 k Da,晶体形态均为球形。这10株菌采样地点分布于保定、衡水、邯郸、廊坊、唐山和邢台等地,植被类型多样化,说明cry8型Bt菌株在河北省分布广泛,可为蛴螬类害虫的防治提供丰富的Bt资源。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
季思思 朱义广 彭东海 阮丽芳 孙明
利用特异引物从基因组BAC文库筛选到1个35kb的片段,对该片段测序比对分析发现可能含有p26的复制区。为了验证该片段中是否含有p26的复制区,首先,将大肠杆菌和苏云金芽胞杆菌穿梭载体pHT304用EcoRⅠ酶切切掉苏云金芽胞杆菌复制子后自连,获得复制子克隆载体pHT304E;随后,将12kbEcoRⅠ片段亚克隆到载体pHT304E上电转化无晶体突变株BMB171,获得具有抗性的转化子,证明该片段具有复制功能。缺失实验证明最小复制功能区包含2个必需的ORF。经过40代无抗培养,最小复制区复制稳定性达到90%以上。
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
黄天培 潘洁茹 姚帆 黄张敏
利用pMD18-T克隆载体从苏云金芽胞杆菌菌株WB12中克隆了酰基高丝氨酸内酯酶基因(AHL-lactonase,aiiA).测序结果表明,该基因(GenBank登录号为DQ000642)由753个碱基组成,编码含有250个氨基酸残基的蛋白质.推测该蛋白质分子质量为28 ku,等电点为4.2,不含信号肽序列.利用DNAMAN软件构建同源关系树.结果表明,该蛋白与已报道具有减弱欧文氏菌胡萝卜亚种致病力的11个A iiA蛋白酶氨基酸序列总相似性为81.2%,并含有相同的氨基酸序列保守区.核苷酸序列的BLAST分析结果表明,与之同源性较高的基因均为蜡质芽孢杆菌组aiiA基因(86%-99%).
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