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[期刊] 华北农学报
[作者]
冯静静 郭巍 刘廷辉 孙永祥 孙伟明 徐大庆
克隆对鞘翅目害虫有毒力的B t新菌株GW S7的cry7Ab8基因,并对该基因进行表达和杀虫活性的研究。利用全长PCR方法克隆cry7Ab8基因,将cry7Ab8基因插入到表达载体pET28b,获得重组质粒pETcry7Ab8,转化E.coliBL21(DE3),诱导后表达130 kDa的蛋白。将cry7Ab8基因连接到大肠杆菌-苏云金杆菌的穿梭载体pSXY422b,获得重组穿梭质粒pScry7Ab8,电激转化到苏云金杆菌无晶体突变株HD73-(cry-),获得工程菌B ioHD7Ab8,表达蛋白后进行生物活性测定。生物活性测定结果显示Cry7Ab8蛋白对马铃薯瓢虫二龄幼虫有较强的杀虫活性,L...
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘兴龙 程林友 李天龙 李长友 李国勋
根据已知Btcry8类基因的全长序列设计一对特异性引物JJX5和JJX3,以Bt菌株B-DLL的质粒DNA为模板扩增出3.5 kb大小的片段;将该片段插入大肠杆菌表达载体pET-21b中,并完成了该片段的全序列测定。该基因编码区为3 495 bp,编码的蛋白质由1 164个氨基酸残基组成,相对分子质量为131.8 kDa,等电点为pH 4.71,为弱酸性蛋白。该基因(GenBank:EU047597)编码的氨基酸序列与Cry8Ea1的氨基酸序列同源性高达99.31%,被国际Bt基因命名委员会正式命名为cry8Ea2。经IPTG诱导后该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中能够正常表达130 kDa...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
杨兆辉 汪子洋 杨文涛 蔡瑜婷 谭伟龙 黄恩炯 张灵玲
乙酰化是蛋白质翻译后修饰的一种重要方式,可参与多种细胞进程,但迄今未见有关乙酰化修饰在Bt中发挥作用的报道.本课题组前期通过对高效杀虫Bt菌株LLP29的基因组进行测序分析,发现该菌株也存在编码乙酰转移酶的基因(如ykkB).为探讨乙酰化修饰在Bt菌株中的作用,以ykkB为靶标,利用无缝克隆技术成功克隆与测序了ykkB基因.通过生物信息学分析,发现该基因编码的蛋白可能是一类N-乙酰转移酶,赖氨酸和亮氨酸含量最高,半胱氨酸含量最低,是一种亲水性蛋白质,且无跨膜区;同时,成功表达、纯化了YkkB蛋白,通过体外自乙酰化分析,证实该蛋白可发挥乙酰基转移的作用.
[期刊] 华北农学报
[作者]
岳润清 铁双贵 齐建双 韩小花 燕树锋
对苏云金芽孢杆菌Cry1Ab野生型基因的编码区序列进行改造,以获得密码子优化的抗虫基因,构建原核表达载体后,将重组载体转入大肠杆菌进行诱导表达并对诱导蛋白进行抗虫试验。首先根据植物密码子的偏好性及使用频率,优化、改造并人工合成了Cry1Ab基因,序列分析表明:改造后的Cry1Ab基因全长1 848 bp,与原始序列同源性为66%,G+C含量由原来的37.34%提高到63.04%。将改造后的Cry1Ab基因与原核表达载体p ET28b(+)连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),阳性菌液进行诱导表达后,SDS-PAGE分析结果显示:Cry1Ab蛋白在BL21(DE3)细胞中得到高效表达,分子量为7...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
赵直 吴钢 王闵霞 朱旭东 蒲志刚 张志勇 彭正松 蔡平钟
以分离的3株苏云金芽孢杆菌质粒为模板,通过设计一对特异引物,PCR扩增得到3条全长3.6 kb的基因序列,其各自都包含一个完整的开放阅读框,编码序列全长分别是3468、3450、2697 bp(Genebank登录号分别为GQ385073,GQ385074,GQ385075);它们与cry1A类基因同源性都高达95%以上;分别编码1159、1150和902个氨基酸。并在此基础上采用生物信息学方法对这3个基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、跨膜结构域、疏水性/亲水性、亚细胞定位、跨膜结构域以及功能域等方面进行了预测和分析。为转基因抗虫植物和微生物杀虫工程菌的构建提供了基因来源。
[期刊] 华北农学报
[作者]
臧大康 郑桂玲 周洪旭 张媛 李国勋 李长友
以本实验室分离的Bt菌株B-DLL质粒DNA为模板,利用cry8类基因特异性引物JJX5和JJX3扩增出3.5kb的片段,将该片段插入克隆载体pMD 18-T中,筛选获得一个含新基因的克隆pMD-cry8new。序列测定表明,该基因编码区为3 525 bp,编码的蛋白质由1 174个氨基酸残基组成,理论分子量为133.05 kDa,等电点为pH4.69,为弱酸性蛋白。该基因核苷酸序列已在GenBank登录(Accession number:HQ174208),编码的氨基酸序列与Cry8Fa1的同源性最高达99.8%,被国际Btδ-内毒素命名委员会正式命名为Cry8Fa2。将cry8Fa2基因插...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
邵铁梅 宋福平 李卓夫 张杰 姜声华 刘大群 黄大昉
通过PCR方法筛选160株苏云金芽孢杆菌,其中94株含有zmaR基因。测定了含zmaR基因的菌株培养物上清液对草生欧文氏杆菌(Erwiniaherbicola)的抑菌活性,结果表明有67株菌有抑菌活性,其中21株抑菌活性较高。经鉴定,抑菌活性较高的G03菌株含有cry1Ac、cry1Aa、cry1Ca和cry2Ab等高毒力杀虫基因,并从G03中克隆了zmaR全长基因,完成了序列测定。该基因编码区为1125bp,由核苷酸序列推导的氨基酸残基组成为375个,分子量为43.5kD,等电点pI4.945。通过载体pET-21b将zmaR基因导入大肠杆菌BL21,可正常表达43.5kD蛋白,并使宿主菌产...
[期刊] 林业科学
[作者]
王学聘 戴莲 陈倩 田颖川
四株表达苏云金杆菌δ－内毒素蛋白基因的大肠杆菌对林业主要害虫杨扇舟蛾Ｃｌｏｓｔｅｒａａｎａｃｈｏｒｅｔａ（Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ），马尾松毛虫Ｄｅｎｄｒｏｌｉｍｕｓｐｕｎｃｔａｔｕｓ（Ｗａｌｋｅｒ），舞毒蛾Ｌｙｍａｎｔｒｉａｄｉｓｐａｒ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ），杨尺蠖Ａｐｏｃｈｅｉｍａｃｉｎｅｒａｒｉｕｓ（Ｅｒｓｃｈｏｆｆ）幼虫作用进行了室内生物测定，结果表明：该四株菌对上述四种昆虫幼虫均表现出较高的杀虫活性，而且能显著抑制昆虫幼虫的生长发育。
关键词：
苏云金杆菌,δ-内毒素,生物测定
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
熊帅 张军科 谌悦
【目的】从富士苹果幼果果实中克隆多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因,并进行原核表达,为进一步研究PGIP的生物学功能奠定基础。【方法】根据Genbank中已经发表的苹果PGIP基因序列设计引物,采用RT-PCR从苹果果实中扩增PGIP基因cDNA,回收目的基因片段并连接到pMD18-T载体,鉴定后进行测序。然后将PGIP全长cDNA和去信号肽的cDNA导入到pET-32a(+)表达载体中,分别获得融合表达质粒pET-PGIP和pET-PGIP-X,将其分别转化大肠杆菌BL21感受态细胞,用不同终浓度IPTG进行诱导表达,收集表达产物并进行SDS-PAGE电泳。对pET-PGIP-X基因工...
[期刊] 浙江林学院学报
[作者]
马良进 张立斌 崔永三 冯炎龙
在用5种农药的不同浓度处理后的马铃薯+蛋白胨+葡萄糖+琼脂(PPDA)培养基上培养苏云金杆菌Bacillusthuringiensis,结果表明在农药释稀5000倍时,对苏云金杆菌的生长没有影响。而苏云金杆菌与5种农药按1∶1和3∶1比例混配后的杀虫效果试验表明,苏云金杆菌菌体浓度为1012个·L-1与绿植(稀释浓度5000倍)或虫螨杀星(稀释浓度5000倍)的混配杀虫效果最好。表2参5
关键词：
苏云金杆菌 农药 混配 杀虫效果
[期刊] 华北农学报
[作者]
王伟 郭巍 徐大庆 孙伟明 刘大群 李瑞军
Cry8Ea2蛋白是一种新型苏云金杆菌杀虫晶体蛋白。通过穿梭载体pSXY422b将cry8Ea2导入Bt无晶体突变菌株中,获得工程菌HD8Ea2。Cry8Ea2蛋白在工程菌中获得表达。通过分子筛层析,成功获得纯化的130 kDa活性毒素蛋白。用改进的生物活性测定方法进行Cry8Ea2蛋白对华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟一龄幼虫的杀虫活性测定,LC50分别为0.267 9μg/mL和0.071 9μg/mL。研究首次发现Cry8Ea2蛋白对华北大黑鳃金龟具有较高毒力,拓展了该蛋白的杀虫谱,为转基因工程提供了新资源。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
李晶晶 赵德明 徐广贤 周向梅 尹晓敏
为观察重组MPB83蛋白的免疫活性,揭示该蛋白在牛结核病的诊断和防治中的作用,克隆了牛分枝杆菌MPB83基因,构建了克隆载体pGEM-MPB83和表达载体pET30a-MPB83,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,用SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并进行蛋白纯化。试验结果表明:牛分枝杆菌MPB83基因体外扩增产物与预期值相符,约600 bp;所构建表达质粒pET30a-MPB83经测序,结果与预期一致;SDS-PAGE分析表明,该融合蛋白以包涵体的形式表达,其分子质量约为26 ku,蛋白表达量占菌体总蛋白的20%;该蛋白经电洗脱纯化后,纯度达95%以上;免疫印迹分析表明,...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
张雪寒 何孔旺 茅爱华 周俊明 俞正玉 温立斌 倪艳秀 郭容利 吕立新
【目的】克隆、表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7转位紧密素受体(Tir)基因,并研究其抗原性。【方法】选用pET28原核表达载体,体外构建Tir原核表达重组菌,并在大肠杆菌中获得高效表达。选用家兔制备高滴度多克隆抗体,Western blot分析其免疫原性。选用HEp-2细胞进行粘附和粘附抑制试验,通过光镜、电镜和荧光显微镜进行观察。选用Balb/c小鼠进行免疫试验。【结果】成功获得高效表达重组Tir蛋白,并制备了兔源Tir多克隆抗体,Western blot分析此抗体能与Tir发生特异性抗原抗体反应。表达Tir蛋白能够抑制O157:H7对HEp-2细胞的粘附和A/E损伤。二免后B...
[期刊] 华北农学报
[作者]
宋萍 郭丽伟 苏俊平 王勤英
苏云金杆菌XPZ-9菌株是从土壤中分离的对鳞翅目幼虫有特异杀虫活性的新菌株。光学显微镜下观察到该菌株可产生菱形和圆形伴胞晶体,SDS-PAGE检测表达的主要蛋白条带分子量约为70 kDa。PCR-RFLP分析结果表明该菌株含有新基因cry1Ah。生物活性测定表明该菌株对鳞翅目害虫棉铃虫、小菜蛾、亚洲玉米螟和美国白蛾的二龄幼虫都具有较强的杀虫活性。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
蒋冬花 邓日强 庞义 余健秀 龙綮新
选用土壤新分离株Ｓ１８－４为供体菌，以ＰＨＴ３１０１穿梭质粒为载体，载体和供体ＤＮＡ用Ｐｓｔｌ酶切后进行连接，用电激法将重组质粒转入苏云金芽孢杆菌无晶体突变株Ｂｔｋ·ＢＥ２０中。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳及扫描电镜观察，证明δ－内毒素基因得到了表达，并具有很高的表达量。生物测定结果显示，重组株对夜蛾科幼虫具有比野生株Ｓ１８－４更强的杀虫毒性。
关键词：
苏云金芽孢杆菌 δ-内毒素 克隆 表达
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