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[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘建新 喻春明 唐守伟 朱爱国 王延周 朱四元 马雄风 熊和平
【目的】分离和克隆苎麻果胶合成关键酶GalAT基因部分序列,了解其在不同组织部位的表达情况。【方法】采用简并引物RT-PCR法克隆基因,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定氨基酸序列进行分析,并用荧光实时定量PCR法研究GalAT基因在不同组织中的表达。【结果】克隆了986bp的GalAT基因部分序列(GenBank注册号:EU131377),可编码328个连续的氨基酸序列;核苷酸序列和推定的氨基酸序列与拟南芥的Galacturonosyltransferase4同源性最高,分别为77%和83%;推定的氨基酸序列与拟南芥的Galacturonosyltransferase4可聚为一类;G...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
朱伟溢 陈建荣 彭彦 张学文 郭清泉 赵燕
采用PCR结合RACE技术克隆苎麻栽培种湘苎3号CAD基因全长cDNA序列;再运用qRT–PCR技术对木质素含量不同的代表性苎麻品种湘苎1号、湘苎3号、湘潭大叶白和城步青麻的CAD基因在其茎秆韧皮部和木质部的表达进行定量分析;使用1%间苯三酚和25%盐酸对4种苎麻茎横切片进行特异染色,观察品种间木质素染色度。结果表明,获得的苎麻CAD基因cDNA序列全长为1 378 bp(GenBank登录号,KF758396),编码359个氨基酸,推导为苎麻肉桂醇脱氢酶(BnCAD)。该推导蛋白质与已报道的几种植物木质素合成酶CAD的同源性均达90%以上,其中与蒺藜苜蓿的同源性达97%。运用qRT–PCR方...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
薛丽君 周精华 邢虎成
【目的】克隆苎麻中的一个ACO基因(BnACO1),并对其进行生物信息学分析、表达分析、胁迫应答分析。【方法】通过RT-PCR结合RACE技术从湘苎3号中克隆该基因的全长cDNA序列,利用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白质序列进行分析。利用实时荧光定量PCR分析BnACO1在苎麻不同部位的表达量以及在ABA、干旱和高盐胁迫下的应答。【结果】BnACO1的cDNA序列全长为1 476 bp,其开放阅读框为981 bp,编码326个氨基酸多肽,预测其分子量和等电点分别为36.81 kD和4.95,基因登录号为JX878855。与无花果(AB307720)、香叶天竺葵(U19856)、柿树...
关键词：
苎麻 乙烯 ACC氧化酶 表达
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘峰 黄妤 郭清泉 张学文 李良勇 邓晶 谢玲玲
【目的】分离苎麻尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶(UDPGDH)基因。【方法】通过简并引物RT-PCR结合RACE技术和半定量RT-PCR。【结果】成功克隆苎麻Boehmeria nivea(Linn.)Gaud.尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶(UDPGDH)基因cDNA序列,序列长1837bp,编码一480个氨基酸的蛋白质(GenBank No.EF178294)。半定量RT-PCR分析显示,UDPGDH在苎麻根、皮、茎和叶组织中均有表达,其表达量为茎>皮>叶>根,相对表达量依次为0.7075,0.3051,0.2651,0.1490。【结论】苎麻UDPGDH与其它植物相应序列具有较高同源性,在苎麻茎中有较高...
[期刊] 华北农学报
[作者]
徐欢 段盛文 冯湘沅 郑科 杨琦 汪启明 成莉凤 彭源德
为使苎麻生物脱胶果胶裂解酶PelG403高效表达。将pelG403从重组质粒pEASY-Blunt E1-G403更换至质粒拷贝数更高的pET28a载体中,导入Escherichia coli BL21(DE3)后进行诱导表达。采用DNS法进行酶活力测定,通过SDS-PAGE和Western Blot分析检验PelG403表达效果,并对其序列进行分析鉴定。结果表明:pET28a-G403/BL21的果胶裂解酶活力为335.8 U/mL,较pEASY-Blunt E1-G403/BL21提高了3.05倍;工程菌pET28a-G403/BL21表达产物分子量比预测带His标签的融合蛋白分子量(43.6 ku)略小;PelG403含387个氨基酸,N末端前35个氨基酸为信号肽;理论pI值为7.64,有4个半胱氨酸,不稳定系数为27.42;其蛋白结构域含有典型的右手β-螺旋结构,属于Pec lyase C家族。因此,将pelG403从重组质粒pEASY-Blunt E1-G403更换至pET28a载体中,并导入E.coli BL21(DE3)进行诱导表达,是苎麻脱胶果胶裂解酶基因pelG403高效表达的方法和途径,同时对其序列进行分析鉴定,为果胶裂解酶的纯化、关键位点分析、分子改造及其脱胶功能特性研究奠定基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
王丹丹 刘晓红 宫远航
为进一步研究SQS基因在鹿角灵芝三萜合成途径中的作用机制及茉莉酸甲酯(MeJA)对GaSQS基因的表达调控,采用RT-PCR结合RACE技术,克隆鹿角灵芝鲨烯合酶基因GaSQS,采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行数据分析,采用MeJA对GaSQS基因诱导表达。结果显示,该基因全长1 969 bp,开放阅读框(ORF)长度为1 515 bp,编码504个氨基酸,分子量为58.2 ku,具有1个跨膜结构域和3个保守区,为无信号肽的亲水性蛋白;GaSQS蛋白二级结构包括α-螺旋(59.52%)、无规则卷曲(28.37%)、延伸链(8.53%)和β-转角(3.57%);系统进化分析显示,鹿角灵芝GaSQS蛋白与灵芝SQS蛋白(ABF57213.1)具较高的同源性(99%);String蛋白互作网络分析显示,GaSQS蛋白互作的蛋白质共有10个,均为三萜、甾醇等萜烯类生物合成过程的重要物质;qRT-PCR分析表明,鲨烯合酶(SQS)的表达量与产量在原基和子实体初期高于其他发育阶段;在不同浓度MeJA诱导下,SQS蛋白均能高效表达,在200μmol/L时达到峰值效果最佳。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
曹红利 岳川 郝心愿 王新超 杨亚军
【目的】从茶树中克隆甜菜碱(GB)合成途径中的关键酶——胆碱单加氧酶CsCMO,研究不同逆境胁迫和不同抗寒茶树品种间GB合成中关键基因的表达模式,并分析茶树体内GB的含量,为茶树抗性育种奠定基础。【方法】采用反转录PCR结合RACE技术,从茶树中克隆CsCMO的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析,结合前期克隆得到的茶树甜菜碱醛脱氢酶CsBADH,用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法分析这2个基因的表达模式,紫外分光光度计测定GB含量。【结果】克隆得到茶树CsCMO(GenBank登录号:JX050146)的cDNA全长1 558 bp,包含1 305 bp的完整开放阅读框(ORF...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
周精华 揭雨成 邢虎成 钟英丽 余伟林
【目的】克隆苎麻转录因子基因BnbZIP1,分析其序列及表达特征,同时进行原核表达以及亚细胞定位分析。【方法】根据苎麻转录组测序中的Unigene48047片段序列,采用RT-PCR结合RACE技术克隆该基因的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;利用Real-time PCR分析该基因在不同组织和不同胁迫条件下表达特征;构建原核表达载体,进行原核表达;构建含EGFP的融合表达载体,观察其亚细胞定位情况。【结果】苎麻BnbZIP1的cDNA全长为2 071 bp,开放读码框为1 407 bp,编码468个氨基酸,推导该多肽的等电点和分子量为7.12和51.57kD,与毛果杨(XP_00230...
[期刊] 华北农学报
[作者]
王力 张娜 张秀清 孙君社
自然条件下金丝桃素在植物中的含量较低且不稳定,提取工艺受其他物质的影响较大,在一定程度上限制了金丝桃素在医药、食品等领域的应用。为了研究金丝桃素合成途径并实现其体外转化,以贯叶连翘愈伤组织总RNA为模板,经RT-PCR扩增得到了编码金丝桃素合成酶的全长cDNA,即Hyp基因。将该基因克隆到原核表达载体pET30a中,成功构建金丝桃素合成酶表达载体pET30a-Hyp,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。含有重组质粒的克隆在IPTG诱导下,表达出金丝桃素合成酶融合蛋白,利用Ni柱纯化菌体裂解上清中表达的融合蛋白,对纯化产物进行SDS-PAGE分析,结果Hyp基因得到了高效表达,大小约为20 k...
关键词：
金丝桃素 贯叶连翘 金丝桃素合成酶
[期刊] 中南林业科技大学学报
[作者]
曹阳 袁澍 徐飞 张中伟 薛立薇 林宏辉
以美洲黑杨Populus deltoides新萌叶片为材料,通过自行设计引物,用RT—PCR的方法克隆了美洲黑杨木质素合成关键基因4CL和CAD基因部分序列。测序结果表明:这两个基因片段长度分别为859 bp和493 bp。此外,人工合成了4CL基因木质部特异表达启动子4CLp,长度为1 180 bp。分别用限制性内切酶Hind III/BamH I、BamHI/Sma I和Sma I/Sac I对4CLp、4CL和CAD基因序列进行双酶切,同时用Hind III/Sac I对pBI121表达载体进行双酶切,回收了目的片段。酶切回收后用T4DNA连接酶克隆到植物表达载体pBI121中,并转化至...
[期刊] 水产学报
[作者]
卢志杰 叶成凯 Sarath Babu V 张晓君 刘晓丹 赵丽娟 潘淦 林蠡
谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)是一种广泛分布在动植物体内的酶,并参与细胞多种代谢调控。在甲壳动物中,GS在能量代谢和渗透压调节过程中起着重要作用。实验克隆了罗氏沼虾GS基因。GS基因cDNA全长1 965 bp,开放读码框(ORF)为1 086 bp,编码361个氨基酸(aa),分子量大小为40.75 ku,等电点为5.81。进化树分析发现,罗氏沼虾GS基因与凡纳滨对虾、斑节对虾和中国明对虾GS聚为一支,氨基酸相似性达到95%。氨基酸多序列比对分析结果显示,罗氏沼虾GS属于无脊椎动物分支的GSⅡ群,有5个保守区域。实验对罗氏沼虾GS蛋白进行表达并制备了多克隆抗体。采用荧光定量PCR技术(qRT-PCR)和免疫印迹(Western blot)对罗氏沼虾蜕壳前后的不同组织GS表达进行检测。qRT-PCR结果显示,GS基因在所检测的8个组织中均有表达;蜕壳前,其相对表达量顺序为:肝胰脏>肌肉>胃>肠>鳃>心脏>脑>血淋巴。蜕壳后和蜕壳前GS基因在组织中的差异表达比较结果显示,除了在肝胰脏表达下调外,其他7个组织都表达升高,其相对表达量的差异顺序为:脑>鳃>胃>肠>肌肉>心脏>血淋巴。Westernblot结果显示,蜕壳后GS蛋白在鳃和肌肉组织表达量上调,与其mRNA表达一致。此外,罗氏沼虾蜕壳后肝胰脏GS酶的活性和谷氨酰胺的含量下调,而其在鳃、肌肉和血淋巴中上调,结果与其基因表达一致。研究表明,GS基因在不同组织中表达的差异可能和罗氏沼虾的能量代谢、渗透压调节有关。
关键词：
罗氏沼虾 谷氨酰胺合成酶 组织表达 蜕壳
[期刊] 华北农学报
[作者]
邓晓云 戴洪义 梁美霞
以柱型苹果茎尖为试材,采用同源克隆的方法克隆得到赤霉素合成代谢关键酶内根-贝壳杉烯合成酶的cDNA全长序列,命名为MdKS。MdKS的开放阅读框(ORF)全长2 214 bp,编码737个氨基酸。KS属于萜类合成酶亚家族,具有DDXXD保守结构域。氨基酸聚类分析表明,MdKS与梨同源性最高,为98%,其次是板栗,为73%;实时荧光定量PCR分析表明,在苹果的生长季节,MdKS基因在柱型和普通型苹果中均能表达。在苹果的生长初期,普通型苹果MdKS基因的表达量均明显高于柱型苹果,而在6月初,其表达量却略低于柱型苹果。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
周晓卉 黄丽华 蒋向 李育强 张学文
【目的】揭示棉田杂草薤白(Allium macrostemon Bunge)抗草甘膦的分子机理,开发利用其草甘膦抗性特性。【方法】运用RT-PCR结合RACE技术,分离克隆了薤白中草甘膦作用的靶酶EPSP合成酶(EPSPs)基因cDNA,并将其构建成原核表达载体在大肠杆菌中诱导表达和鉴定其抗性。【结果】薤白EPSP合成酶基因cDNA序列全长1821bp,编码一段522个氨基酸的推导蛋白质。经BLAST及蛋白质结构预测,蛋白具有EPSPs的特征序列,并与已报道的EPSPs序列有高同源性,确认克隆的cDNA序列即是薤白EPSPs基因序列,命名为EPSPsA。将该cDNA与原核表达载体pRSET-A...
[期刊] 浙江农林大学学报
[作者]
庞景 童再康 黄华宏 林二培 刘琼瑶
通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)结合c DNA末端快速扩增(RACE)技术,从杉木Cunninghamia lanceolata中克隆到2个全长为3 235 bp和3 876 bp的纤维素合成酶基因c DNA序列,被分别命名为Cl Ces A1和Cl Ces A2,Gen Bank登录号分别为JQ844574和JQ844575。相应编码蛋白分别包含992和1 092个氨基酸残基,推测分子量为111 845.3 D和123 105.7 D,等电点为6.04和6.65。氨基酸序列分析发现,它们具有植物纤维素合成酶基因相应的结构特征——锌指结构,2个易变区CSRI和CSRII,2个保守区CR...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
郑建树 喻春明 陈平 王延周 谭龙涛 陈继康 朱涛涛 卢凌霄 朱娟娟 段叶辉 熊和平
【目的】克隆谷氨酰胺合成酶BnGS2等位基因,分别构建其超量表达载体,并探讨其在转基因烟草中对氮代谢的影响。【方法】依据苎麻转录组unigenes和RT-PCR技术克隆苎麻BnGS2等位基因,利用内切酶TaqⅠ对目的等位基因在中苎1号自交F1和亲本中进行酶切鉴定,并利用生物信息学对基因序列和结构特征进行分析;通过同源重组技术分别构建BnGS2等位基因的超量表达载体,并在农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404的介导下,通过叶盘法将超量表达载体转入烟草中,通过Kan筛选、转化植株基因组DNA PCR验证获得转基因T0植株;利用qRT-PCR分析BnGS2等位基因...
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