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[期刊] 西南农业学报
[作者]
呼丽君 柴友荣 张建奎 姚永宏
二氢黄酮醇-4-还原酶(dihydroflavonol-4-reductase,DFR)是类黄酮途径的一个关键酶,对种皮色泽和花色的形成具有重要作用。本研究从甘蓝型油菜克隆了600 bp(不计人工酶切位点)的芸薹属DFR基因家族的RNA干扰片段BDFRI,将其反义片段和正义片段分别插入到本课题组新近改造的植物RNAi平台载体pFGC5941M的启动子与间隔区之间、间隔区与终止子之间,构建了11 400 bp的RNAi干扰载体pFGC5941M-BDFRI,通过多重PCR鉴定证实载体构建成功,并转化到根癌农杆菌菌株LBA4404中形成了工程菌株。此载体的构建为进一步研究DFR基因参与决定芸薹属种...
[期刊] 中南林业科技大学学报
[作者]
李蕾蕾 孙丰坤 李晓一 詹亚光 曾凡锁
糖基转移酶基因是生物分子糖基化中的关键基因,已有研究表明少数糖基转移酶14(Glycosyltransferase14,GT14)家族基因在植物细胞壁合成及对逆境的响应中发挥重要的生物学功能,然而GT14基因对逆境的响应机制目前仍不清楚。为了研究糖基转移酶基因的生物学功能,本实验室在克隆了白桦Bp GT14基因(JQ409354)编码区序列全长的基础上,利用Bam HⅠ单酶切的方法构建了白桦Bp GT14基因的p BI121植物表达载体,并利用一步PCR之后在同一体系中同时酶切-连接的方法,构建了Bp GT14基因RNA干扰载体,相比于传统的RNA干扰载体构建方法更为高效快捷。测序结果表明,植...
[期刊] 中南林业科技大学学报
[作者]
包梅荣 谭晓风 乌云塔娜 张琳
为研究油茶种子成熟调控蛋白基因的功能,以pCAMBIA1304质粒为载体,根据油茶种子成熟调控蛋白基因的cDNA序列设计了小干扰RNA(Si RNA)序列,构建了油茶种子成熟调控蛋白基因小干扰RNA植物表达载体pCAMBIA1304-si RNA,并借助农杆菌介导叶盘法将pCAMBIA1304-si RNA转化到野生型烟草中,获得了稳定表达的转基因烟草苗。为下一步的油茶种子成熟调控蛋白基因的功能鉴定奠定了基础。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
苏君艺 陆璇璇 朱维宁 张林生
【目的】利用基因枪将WZY2基因RNA干扰表达载体pAHC-WZY2-Ri导入"郑引1号"小麦,获得WZY2基因表达缺失型小麦,为深入分析WZY2基因功能奠定基础。【方法】以植物表达载体pAHC25为基础,构建含有反向重复序列的RNA干扰表达载体pAHC-WZY2-Ri,利用基因枪将其转入"郑引1号"小麦幼胚愈伤组织中,经过筛选、PCR检测得到阳性植株。【结果】从转化的1 500个愈伤组织中获得27株再生植株。利用PCR对再生植株进行检测,获得阳性植株3株,转化率为0.2%。【结论】构建了WZY2基因的RNA干扰表达载体,成功地将WZY2基因RNA干扰表达载体导入"郑引1号"小麦,获得阳性植株...
关键词：
小麦 WZY2基因 RNA干扰 遗传转化
[期刊] 林业科学研究
[作者]
王伟伟 凌晓霏 陆沁 柳鹏飞 张金稳 陈航
[目的]引入细菌表达dsRNA干扰系统对中华紫胶虫FAD基因进行RNA干扰,通过检测干扰后FAD基因表达量与个体泌胶量动态变化,对FAD基因功能进行初步分析,为验证紫胶合成相关基因功能提供科学基础。[方法]中华紫胶虫FAD基因和L4440载体经双酶切之后,利用T4连接酶连接,构建FAD-L4440重组质粒,并转入HT115感受态细胞中,IPTG诱导表达dsRNA后,通过虫体涂抹法将dsRNA转染到紫胶虫体内。用RT-qPCR检测干扰后FAD基因的表达量并测定干扰后个体泌胶量的变化。[结果]RNA干扰后FAD基因表达量明显降低,其中,以低浓度菌液处理后12 h和中浓度菌液处理后24 h相对于对照组有显著差异,分别降低了90.90%和86.52%,中浓度在72 h时干扰效率高于其他两个组,个体泌胶量与对照组比较有显著下降。[结论]本研究构建了中华紫胶虫FAD基因的RNA干扰载体,在基因功能验证中引入了细菌表达dsRNA的RNAi系统,使用虫体涂抹法将其导入虫体内引起FAD基因表达量与紫胶虫个体泌胶量显著下降,为RNAi转染过程中不适用注射法、喂食等转染方法的昆虫提供技术参考,为后续解析紫胶合成的分子机理提供技术基础与科学依据。
[期刊] 林业科学研究
[作者]
邱秀文 吴小芹 黄麟 叶建仁
［目的］为了构建松材线虫（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）果胶酶Ｂｘｐｅｌ２基因干扰载体。［方法］通过Ｔｒｉｚｏｌ法提取松材线虫总ｒｎａ，反转录合成ｃ Ｄｎａ，设计带Ｔ７启动子的果胶酶Ｂｘｐｅｌ２基因引物，以ｃ Ｄｎａ为模板扩增出果胶酶Ｂｘｐｅｌ２基因片段，连接到ｒｎａ干扰载体，再以干扰载体为模板，ｐｃｒ扩增出目的片段后进行测序鉴定，合成果胶酶Ｂｘｐｅｌ２基因双链ｒｎａ（Ｄｓｒｎａ），采用ｒＴ－ｐｃｒ检测松材线虫Ｂｘｐｅｌ２基因干扰后的表达情况。［结果］表明：１）提取的松材线虫总ｒｎａ完整性好，无降解；２）成功克隆出松材线虫果胶酶Ｂｘｐｅｌ２基因片段（７９０ Ｂｐ）并将其．．．
关键词：
松材线虫 Bxpel2基因 RNA干扰
[期刊] 华北农学报
[作者]
张恭 刘立峰 周维 王海光 马峙英
利用已公布的水稻条纹叶枯病毒的序列和siRNA Target Finder软件,获得了168条siRNA片段,利用这些片段在水稻基因组中BLAST(Basic local alignment search tool),最终获得6条与水稻基因组完全不匹配的干扰序列。选择其中的2条,通过化学合成干扰序列,利用pCAMBIA1301质粒构建了RNA干扰载体pASV1301-1,pASV1301-2,并成功地转化EHA105农杆菌,为进一步转化水稻、探索利用RNA干扰技术防治水稻条纹叶枯病奠定了基础。
关键词：
水稻 RNA干扰 载体构建 抗病毒
[期刊] 华北农学报
[作者]
杨杰 仲维功 王才林 柳青 王明波 Narayana M.Upadhyaya
利用RNA干扰原理可以对作物进行遗传改良。构建RNA干扰的发夹结构一般采用在引物两端加酶切位点方法,该方法涉及酶切位点多,步骤繁琐。本试验介绍一种直接利用PCR产物进行RNAi组成型表达载体构建的方法,该载体以潮霉素为筛选标记基因,适合水稻的遗传转化。
关键词：
RNA干扰 双元载体 PCR产物
[期刊] 华北农学报
[作者]
张宝娜 朱灿灿 张鹏钰 卫丽 王翔 姜玉梅 王同朝
为进一步探究春化基因ＶＲＮ１在小麦发育进程中的功能，利用荧光定量ＰＣＲ分析了ＶＲＮ１基因在不同发育特性小麦品种新春２号、京８４１中的表达情况。结果表明，随着生育进程的推进，ＶＲＮ１基因在新春２号叶片和茎尖中表达量均呈上升趋势，ＶＲＮ１基因在京８４１叶片中呈波动上升趋势，在茎尖中表达量趋于０；以Ｐ ＦＧＣ５９４１载体为基础构建含有ＶＲＮ１反向重复序列的ＲＮＡ干扰载体，利用农杆菌介导的茎尖转化法转化新春２号获得了再生植株，并通过ＰＣＲ法检测获得了转基因阳性植株，为从分子水平上实现小麦发育特性遗传改良和创育小麦新种质奠定了基础。
关键词：
小麦 春化基因VRN1 表达 转化
[期刊] 草业科学
[作者]
张司雯 邓欣 王龙 罗皓天 王禹茜 王月 李清竹 王红艳
Dicers酶类、Argonautes蛋白以及RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerases, RDRs)是RNA干扰(RNA interference, RNAi)机制中重要的核心蛋白,但在谷子(Setaria italica)中尚无系统报道。为了研究谷子中与RNA干扰相关酶类基因的特征,本研究对谷子的RNA干扰相关酶类基因家族进行了蛋白质理化性质、亚细胞定位预测、蛋白质保守基序、基因保守结构域、基因家族成员间系统发育关系以及组织特异性表达谱分析。研究共发现24个与谷子RNA干扰相关酶类基因,包括7个DCL (Dicers),13个AGO (Argonautes),4个RDRs。系统进化树分析表明,这些家族被分为3个进化支。同一家族基因成员具有共同的保守结构域。虽然大多数基因可同时在不同发育时期的叶、茎和穗中表达,但其在各时期的穗和茎中的表达量最高。本研究为详细探讨这些基因在谷子生殖和生长发育中的表观遗传修饰作用提供了理论依据。
[期刊] 华北农学报
[作者]
黄冰艳 苗利娟 张新友 严玫 翁海波 易明林 陈占宽
将Napin启动子与含花生FAD2基因反向重复片段的RNA干扰结构连接,亚克隆至含雌激素诱导重组系统的植物表达载体pNCX相应位点中,构建完成由Napin启动子驱动的FAD2RNAi删除筛选标记表达载体pNCX-FAD2RNAi,经酶切鉴定,获得相应的启动子片段、FAD2RNAi片段及NCX-FAD2RNAi片段。利用农杆菌介导法进行遗传转化,已获得抗性丛生芽214丛。
[期刊] 华北农学报
[作者]
唐霞 周志平 赵丛枝 马俊莲 张子德
分析克隆的柿果ACC合成酶基因的序列,根据其与表达载体pSMAK311上的酶切位点设计2对带酶切位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增柿果ACC合成酶基因片段。双酶切PCR回收产物以及表达载体,将酶切产物定向连接构建成反义表达载体;在此基础上构建该酶基因的shRNA表达载体,由此转录的mRNA因两端序列反向互补而成发夹式RNA,因此,可应用于RNA干扰研究。将所构建好的载体转化农杆菌EHA101用于后续的遗传转化研究。
[期刊] 林业科学研究
[作者]
车代弟 王海峰 王金刚 龚束芳 樊金萍
利用简并引物RT-PCR,克隆复叶槭FtsZ基因的cDNA序列,利用马铃薯X组病毒载体pgR107,构建RNA干扰重组病毒载体pVX-AnFtsZi,并转化农杆菌GV3101(含辅助质粒pJIC Sa-rep)侵染烟草。40 d后,检测烟草内源FtsZ基因的表达量。研究结果表明:从复叶槭中克隆到的569bpFtsZ基因cDNA片段,具有FtsZ蛋白的核心功能序列GGGTGSG。构建的hpRNA型RNA干扰载体抑制了FtsZ基因的表达。为培育槭树类彩叶新品种奠定分子理论基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
宋平丽 李刚 许建锋 马青翠 亓宝秀 张玉星
为明确杜梨赤霉素受体GID1(Gibberellin insensitive dwarf 1)的生物学功能,以杜梨为试材,通过同源克隆方法得到PbGID1s基因,利用生物信息学分析软件构建基因结构并设计靶位点;利用酶切-连接方法将带有靶点的sgRNA表达盒构建至CRISPR/Cas9表达载体上;通过农杆菌介导方法,将CRISPR/Cas9表达载体转化至杜梨子叶中。结果表明,在杜梨基因组中克隆得到4个PbGID1s,分别命名为PbGID1b-1、PbGID1b-2、PbGID1c-1、PbGID1c-2,基因结构分析显示该家族基因均由2个外显子和1个内含子组成;氨基酸序列比对发现PbGID1s均具有GID1家族所特有的HGG和GXSXG保守结构域;将含有5个靶位点的sgRNA表达盒成功构建至pYLCRISPR/Cas9P_(35S)-N植物表达载体上,可同时对该家族4个基因进行编辑;杜梨遗传转化试验结果表明,共计浸染595粒杜梨子叶,获得抗性芽176个,阳性植株33株,转化效率达到5.55%。成功构建了可以同时靶向杜梨PbGID1s家族基因的CRISPR/Cas9载体,通过农杆菌介导,成功将该载体转化至杜梨子叶,并获得阳性植株,为杜梨遗传转化和基因编辑创建矮生突变体研究提供了重要参考。
[期刊] 林业科学研究
[作者]
王越 张苏芳 徐瑶 方加兴 孔祥波 刘福 张真
[目的]探索细菌表达dsRNA介导的RNAi在美国白蛾中的可行性,为RNAi技术在美国白蛾等林业害虫上的应用提供依据。[方法]选择几丁质酶HcChi基因作为靶标,设计有效的干扰片段,构建到L4440干扰载体上,并转入HT115大肠杆菌菌株。IPTG诱导HT115表达HcChi的干扰片段,用菌液持续饲喂美国白蛾幼虫,观察幼虫生长情况,定量PCR检测HcChi的转录水平。[结果]构建了带有HcChi-L4440表达载体的HT115菌株,经IPTG诱导能够合成HcChi-dsRNA,浓缩菌液持续饲喂幼虫显著抑制HcChi的表达,相对表达量显著下降了76.7%～90.3%,幼虫生长发育迟缓,体重增长量与对照相比显著减小40.7%。[结论]成功构建HcChi RNA干扰载体,通过饲喂法在美国白蛾中获得RNAi效应。该体系首次在美国白蛾中建立,为该物种的基因功能研究和生物防治提供新思路。
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