为了探究花鳗鲡(Anguila marmorata)AQP3基因在不同盐度下的表达规律,利用RACE技术克隆了花鳗鲡AQP3基因c DNA全长序列,并进行了生物信息学分析;通过实时荧光定量PCR(RT-q PCR),检测了花鳗鲡AQP3在9个组织中的分布及盐度胁迫后鳃、肾、肠组织在0、6、12、24 h和3、5、10 d的表达情况。结果显示:花鳗鲡AQP3基因的c DNA全长为1299 bp,开放阅读框(ORF)为891 bp,5’非编码区(UTR)和3’非编码区(UTR)分别为60 bp和348 bp,

为探究花鳗鲡(Anguilla marmorata)应对极性钙浓度环境下体内的应激机制,检测了花鳗鲡成鳗从对照组(2 mM Ca~(2+))转移到高钙组(10 mM Ca~(2+))和缺钙组(0 mM Ca~(2+))时第1、4和7天的血清钙浓度、血清渗透压和5项血液指标(白细胞数目、红细胞数目、葡萄糖浓度、血红蛋白浓度和血小板数目),采用qRT-PCR技术对NCXs和PMCAs基因在花鳗鲡不同组织中的表达进行分析,并研究了花鳗鲡应对极性钙浓度下NCXs和PMCAs基因在鳃组织中表达变化规律。结果表明:血清钙浓度和血清渗透压与周围钙离子浓度成正相关,第1、4天处理组较对照组有显著性差异(P0.05);随时间延长高钙环境下各项指标由高到低,低钙环境下各项指标由低到高,至第7天达到稳态;5项血液指标,第1、4天各处理组数值均比对照组高,第7天达到稳态。对于组织表达,NCX2和NCX3在皮肤中表达最高,而NCX1、PMCA2和PMCA4在肾脏中表达最高。对于各亚型的mRNA时序表达,NCX1和PMCA4在极性钙处理情况下相较对照组有显著性差异(P<0.05);其中,NCX1在高钙条件下随着时间增长表达量逐渐升高,在低钙环境下随着时间增长表达量逐渐降低,即NCX1的表达对于极性钙环境具有指示作用;PMCA4在高钙条件下随着时间延长表达量逐渐降低,在低钙环境下随着时间延长表达量逐渐升高,在第7天达到稳态,即PMCA4的表达对于钙环境的稳态具有指示作用;其它亚型随着时间的延长均无显著性差异。可见NCX1和PMCA4在花鳗鲡洄游过程机体内钙稳态的调节中扮演了重要角色。

为研究在环境因素变化后，菲律宾蛤仔Ｉ型溶菌酶参与免疫应答反应的变化模式，实验采用ｃ ＤＮＡ末端快速扩增技术，从菲律宾蛤仔体内克隆获得了一种Ｉ型溶菌酶基因的全长ｃ ＤＮＡ序列（命名为ＲｐＩ ＬＹＺ－２），该序列开放阅读框（ＯＲＦ）为４７１ ｂｐ，编码１５６个氨基酸。ＲｐＩ ＬＹＺ－２基因在所检测组织中均有表达，其中在外套膜中表达量最高，在肌肉组织中表达量最低。采用荧光定量ｐｃＲ法，研究了不同温度［（２９±１）、（２１±１）和（１３±１）°ｃ］、盐度（３２、２２和１２）及鳗弧菌刺激对菲律宾蛤仔Ｉ型溶菌酶基因表达的影响。结果显示，在温度２１°ｃ和盐度２２胁迫处理后，ＲｐＩ ＬＹＺ－１基因的表达量呈现．．．

为了研究欧洲鳗鲡（Anguilla anguilla）RIG-I基因的特性，本实验通过设计引物，扩增其序列，克隆至pCE2-TA/Blunt-Zero载体，测序验证后对所获得欧洲鳗鲡RIG-I基因序列进行生物信息学分析及原核表达。结果表明，欧洲鳗鲡RIG-I基因ORF序列有2 823 bp碱基，编码940个氨基酸，与日本鳗鲡（A. japonica）的序列同源性为96.71%；RIG-I蛋白属酸性亲水性蛋白，不存在跨膜结构，无信号肽，较不稳定，主要分布于细胞质中，有6个保守功能区；SDS-PAGE和western blot结果显示，实现了RIG-I基因在大肠杆菌中的高效表达，为后期制备RIG-I多克隆抗体，进一步探索RIG-I介导的天然免疫在鳗鲡抵御鳗鲡疱疹病毒（Anguillid herpesvirus， AngHV）侵染过程中的作用机制提供研究基础。

通过RT-PCR技术从欧鳗(Anguilla anguilla)脾脏总RNA中获得了编码成熟免疫球蛋白(Ig)重链的基因序列(GenBank accession No.GQ249838),该序列长1 686 bp,编码562个氨基酸残基,分子质量为62.2 ku。将该基因片段与pET-his载体连接构建原核表达载体,在大肠杆菌BL21中诱导表达,其表达产物经SDS-PAGE和Western-blotting分析表明新增的66 ku蛋白条带与预期值相符,且能够与兔抗欧鳗IgM血清发生强烈的特异性反应,证实了欧鳗免疫球蛋白重链(IgH)基因能够在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达;利用荧光定量PCR检...

细胞色素c氧化酶(COX)是线粒体电子传递链的末端酶，COX6A是细胞色素c氧化酶的核编码亚基之一。本研究在花鲈(Latolabrax maculatus)中鉴定出了2个cox6a基因(cox6a1、cox6a2)。系统进化树分析进一步确认了两个花鲈cox6a基因命名的准确性。多序列比对表明cox6a基因具有高度的保守性，尤其是C端。我们利用qRT-PCR技术对花鲈cox6a基因的mRNA在心、肝、脾、胃、鳃、肾、头肾、性腺、延髓、端脑、中脑、小脑、下丘脑、垂体、肌肉15种组织的表达情况进行了检测。结果表明，花鲈的两个cox6a基因均呈现组织特异性表达，其中cox6a1在垂体、脑、肝脏和肾脏中的表达量较高，cox6a2在心脏和肾脏中的表达量较高。同时，通过TargetScan及miRanda软件，我们在花鲈鳃组织miRNA库中获得了4个可能靶定cox6a2基因的miRNA：miR-30e-5p、miR-223、miR-200a-3p和miR-155-5p，但没有发现可能靶定cox6a1基因的miRNA。为进一步了解cox6a基因及相关miRNAs在花鲈渗透调节机制中的潜在作用，本研究开展了急性盐度转换实验，即将海水养殖的个体转移到淡水(盐度30～0，SW-FW组)中，以及将淡水养殖的个体转移到海水中(盐度0～30，FW-SW组)，并利用qRT-PCR技术分析了处理前后各时间点(0 h, 12 h, 1 d, 3 d, 7 d) cox6a基因以及潜在的调控miRNAs在花鲈鳃组织中的表达模式。结果显示，在花鲈适应低盐和高盐环境的过程中，cox6a1、cox6a2基因以及miR-30e-5p、miR-223、miR-200a-3p都呈现显著差异表达，而miR-155-5p只在适应高盐环境时出现了显著的差异表达。这表明，cox6a1、cox6a2基因和4个miRNAs在花鲈的渗透调节过程中发挥潜在作用。其中miR-30e-5p、miR-223和miR-200a-3p在盐度转化过程中的表达趋势与cox6a2呈负相关关系，以miR-223相关性最高。由此推测，miR-30e-5p、miR-223和miR-200a-3p不同程度地参与了cox6a2基因的表达调控。本研究为研究花鲈适应不同盐度环境的渗透调节机制提供了基础数据。

为评估不同激素诱导花鳗鲡卵巢发育的效果并探究促性腺激素在花鳗鲡发育过程中的作用,实验比较了不同激素组合处理后花鳗鲡性体指数(gonadosomatic index,GSI)的变化,并采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对处于不同发育阶段雌鱼脑垂体中促性腺激素基因Gt Hα(促性腺激素亚基),LHβ(促黄体生成素亚基)及FSHβ(卵泡刺激素亚基)的表达进行了定量研究。结果发现,鲤脑垂体萃取液(CPE)与人类绒毛膜促性腺激素(h CG)组合能够有效促使雌性花鳗鲡性腺发育成熟,GSI平均达22.9%,与对照组相比差异显著。单独注射雄烯二酮(ADSD)和注射ADSD、CPE、h CG混合制剂诱导效...

在6种不同盐度(34、32、30、28、26和22)激活液、3种不同K+浓度(25 mmol/L、30 mmol/L和35 mmol/L)稀释液和不同保存时间(0 h、24 h、48 h、72 h和96 h)条件下,对日本鳗鲡(Anguilla japonica)精子的活力进行观察和测定。结果表明,激活液盐度为30时精子活率和运动精子百分比均最高,对应平均曲线运动速度(VCL)、平均直线运动速度(VSL)和平均路径速度均最高,由此推测自然界中日本鳗鲡产卵环境的盐度在30左右;稀释液中K+浓度为30 mmol/L时精子活率和运动精子百分比均最高,对应平均曲线运动速度(VCL)、平均直线运动速度(...

通过RTGPCR技术克隆欧洲鳗鲡(Anguillaanguilla)Ig轻链基因c DNA全长序列,命名为Aa Ig L,其全长为1016bp,开放阅读框为714bp,编码238个氨基酸.将该基因片段与p ETGhis载体连接构建原核表达载体,在大肠杆菌BL21中诱导表达,其表达产物经SDSGPAGE和Westernblotting分析,结果表明新增的27ku蛋白条带与预期值相符,且与兔抗欧洲鳗鲡Ig M血清发生特异性显色反应,证实了Aa Ig L基因能够在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达;实时荧光定量PCR检测结果发现:Aa Ig L在欧洲鳗鲡各组织中均有表达,其中脾脏的表达量最高,肾脏和心脏...

分别以日本鳗鲡(Anguilla japonica)pMD19-T-IFNγ和pMD19-T-IFN-γrel重组克隆质粒为模板,采用PCR方法扩增日本鳗鲡IFN-γ和IFN-γrel基因,而后分别将IFN-γ和IFN-γrel成熟肽的编码序列克隆至原核表达载体pQE30和pET32a上,成功构建了重组表达载体pQE30-IFN-γ和pET32a-IFN-γrel。将重组表达载体pQE30-IFN-γ和pET32a-IFN-γrel分别转化入Escherichia coli M15和Escherichia coli BL21感受态细胞进行表达,并优化IPTG诱导表达体系后用SDS-PAGE电泳鉴定IFN-γ与IFN-γrel重组蛋白表达形式。IFN-γ与IFN-γrel重组蛋白经镍柱纯化后进行SDS-PAGE电泳检测和Western blot鉴定。结果显示,重组表达载体pQE30-IFN-γ与pET32a-IFN-γrel分别在E.coli M15和E.coli BL21中得以正确表达。重组IFN-γ蛋白分子量为21 kD左右,表达的融合蛋白以可溶性形式存在;重组IFN-γrel蛋白分子量为31 kD左右,以包涵体形式存在。且两者均在1.0 mmol·L~(-1) IPTG诱导6 h时表达量最高。经镍柱纯化和Western blot检测,成功获得高纯度的IFN-γ和IFN-γrel重组蛋白。建立了日本鳗鲡IFN-γ和IFN-γrel基因的原核表达系统,为进一步研究日本鳗鲡干扰素系统的功能及调控机制奠定了基础。

将鳗鲡疱疹病毒(AngHV)福建株(AngHV-FJ)ORF51基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-2中,构建表达质粒pGEX-4T-2-ORF51,将其转化至表达菌株E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导后,收集表达菌体,进行SDS-PAGE分析和免疫印迹试验验证,结果表明,获得了高效表达的AngHV-FJ ORF51融合蛋白.经割胶回收纯化,获得高纯度的融合表达蛋白.用纯化的表达蛋白免疫新西兰大白兔,获得了高效价的兔抗ORF51多克隆抗体.这为进一步研究ORF51蛋白的结构和功能及开展AngHV病的防治研究提供了重要的研究基础.

从刺参(Apostichopus japonicus)低盐转录组数据库中选取与应激(热休克蛋白70基因)和离子传递(甘氨酸转运蛋白基因、锌转运蛋白基因、神经乙酰胆碱受体基因)相关的4个差异表达基因,利用qRT-PCR技术分析这4个基因在不同组织中的表达水平及低盐对其表达丰度的影响。结果表明甘氨酸转运蛋白基因在刺参呼吸树中表达水平最高,肠次之,体腔液表达较低;锌指蛋白基因和神经乙酰胆碱受体基因均在体腔液中表达最高,肠次之,在呼吸树中不表达;热休克蛋白70基因在体腔液中表达量最高,其次是呼吸树和肠组织。低盐胁迫下这4种基因的表达量均随着胁迫时间的延长呈波动性增减,其中甘氨酸转运蛋白在体腔液中的表达...

在２３～２７℃水温中以每天２００ｍｇ／ｋｇｂ．ｗ．剂量灌服土霉素五天，测定鳗鲡组织中土霉素残留的消除规律。停药后每天剖取五条鱼的肉和肝，用４％三氯乙酸－０．０２ｍｏｌ／Ｌ磷酸氢二钠水溶液和三氯甲烷匀浆，用石油醚除去脂肪。水层用固相萃取Ｃ１８柱净化后，用ＨＰＬＣ法在３６０ｎｍ下测定土霉素残留。色谱柱：ＯＤＳ－５μ２５０×４．０ｍｍ。流动相：甲醇＋乙腈＋二甲基甲酰胺＋ＥＤＴＡ－柠檬酸钠缓冲液＝１＋１．２＋０．４２＋１．９。停药１天鱼肉中土霉素含量达到１．０ｍｇ／ｋｇ，停药７天降低至０．１ｍｇ／ｋｇ

为探究鱼类TRAF3在鱼类抗病毒免疫应答中的功能及作用机制，实验利用逆转录PCR克隆获得了日本鳗鲡TRAF3转录本（AjTRAF3），利用生物信息学软件分析了AjTRAF3的结构特征，利用qPCR、双荧光素酶报告系统以及免疫共沉淀等方法对其表达规律、功能及作用机理进行了初步分析。AjTRAF3的开放阅读框长度为1 707 bp，编码568个氨基酸。序列结构分析结果显示，AjTRAF3由N端的环结构域、两个锌指结构域以及一个螺旋结构域和C端高度保守的TRAF-C（MATH）结构域组成。qPCR结果显示，AjTRAF3在日本鳗鲡各组织中均有表达，脑组织中表达量最高，其次为头肾，心脏中的表达量最低。Poly I:C刺激6 h后，日本鳗鲡脾脏组织中AjTRAF3上调倍数最高，为对照组的15.83倍。迟缓爱德华菌感染24 h后，日本鳗鲡脾脏组织中AjTRAF3上调倍数最高，为对照组的31.47倍。此外，本研究构建了AjTRAF3真核表达质粒，发现过表达AjTRAF3能显著上调炎症及抗病毒相关基因的表达，可显著增强AjIFN2、AjIFN4和NF-κB启动子荧光素酶活性。并能显著上调由AjRIG-IN、AjMAVS、AjIRF3诱导的AjIFN2、AjIFN4和NF-κB启动子活性。免疫荧光结果显示，AjTRAF3主要定位于细胞质中，且与AjMAVS存在共定位。免疫共沉淀结果显示，AjTRAF3通过MATH结构域与AjMAVS相互结合，缺失该结构域后，其与AjMAVS的相互作用消失，推测AjTRAF3可通过介导RIG-I/MAVS信号转导途径调控鱼类的抗病毒免疫应答。本研究结果为进一步揭示鱼类TRAF3的生物学功能奠定了基础。

线纹尖塘鳢(Oxyeleotris lineolata)具有典型性别生长二态性，雄鱼生长优势显著，Doublesex and Mab-3 related transcription factor (DMRT)家族是一个与性别决定相关的转录因子家族。基于线纹尖塘鳢性腺转录组数据，共获得2个dmrt基因的cDNA序列，分别命名为Oxldmrt1和Oxldmrt3，并采用PCR技术扩增验证2个基因的cDNA序列。运用生物信息学方法分析2个基因序列结构特征，结果显示，Oxldmrt1和Oxldmrt3开放阅读框分别为903 bp和1 363 bp，分别编码300个氨基酸和453个氨基酸；OxlDMRT1属于碱性蛋白，而OxlDMRT3属于酸性蛋白；2个基因均含有高度保守的DM结构域，OxlDMRT3还存在DMA结构域。氨基酸聚类分析显示，脊椎动物不同DMRT家族都是独立聚类，OxlDMRT1属于DMRT1家族，OxlDMRT3属于DMRT3家族，DMRT1家族最先聚类，再和DMRT3家族聚类。利用实时荧光定量PCR技术(real-time quantitative PCR， qRT-PCR)分析2个dmrt基因在雌鱼和雄鱼8个组织的表达水平，结果显示，2个基因在精巢中表达量均显著高于其他组织(P<0.01)，Oxldmrt3在脑中也有少量表达；利用qRT-PCR分析2个dmrt基因在早期不同发育时期的表达谱，显示2个基因在受精卵中表达量均最高，Oxldmrt1在眼囊期时表达量最低，而Oxldmrt3在出膜7d表达量最低。利用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization， FISH)对2 个基因在精巢中的表达进行定位，显示2个基因在精巢中表达部位一致，均在精原细胞中有较强的表达信号。综上所述，Oxldmrt1和Oxldmrt3均在线纹尖塘鳢性腺胚胎发育阶段和精巢发育过程中起调节作用，而Oxldmrt1还可能参与胚胎后期性别决定和性别分化调控过程，Oxldmrt3还可能参与神经系统发育。本研究为线纹尖塘鳢性别决定与性别分化相关的分子机制研究提供了参考。