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[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
冯佳琳 刘聪聪 戚相玉 邸泽鑫 鲁仪增 郑健
【目的】探讨热激蛋白（HSP）在花楸树响应高温胁迫过程中的作用，以期为花楸树引种低海拔地区提供理论基础。【方法】以2～4年生花楸树实生苗为研究对象，进行了花楸树SpHSP70-3基因的克隆、系统进化分析、组织特异性表达模式以及响应高温胁迫的表达机制研究，并利用农杆菌介导法转化拟南芥，对SpHSP70-3基因在高温胁迫下的响应进行了异源验证。【结果】SpHSP70-3基因开放阅读框全长为2 088 bp，编码695个氨基酸；SpHSP70-3蛋白与蔷薇科梨属的白梨PbHSP70同源性最高。内源性表达分析显示：SpHSP70-3基因在叶片中表达量最高，在花蕾、初花、盛花时表达量偏低；42℃处理花楸树后，发现前6 h SpHSP70-3基因表达量没有显著变化，12 h时表达量增至对照组的12倍，24 h时表达倍数最高，为对照组的19倍。对3个转SpHSP70-3基因拟南芥纯合株系（OE1、OE2、OE3）和野生型拟南芥（WT）进行45℃高温处理后，OE1、OE2、OE3中的丙二醛（MDA）含量均高于WT，且过氧化氢酶（CAT）活性和过氧化物酶（POD）活性结果均低于WT。此外，SpHSP70-3在转基因株系中的表达量随着处理时间的增加而上升，并且其抑制了正调节因子AtHSP70、AtHSP18.2、AtHsfA1D和AtHsfA1A的表达，同时诱导了负调节因子AtHsfB2B的上调表达。【结论】SpHSP70-3在花楸树响应高温胁迫过程中起负调控作用，初步推测SpHSP70-3是花楸树引种低海拔地区响应高温响胁迫机制中的负调控因子。
关键词：
花楸树 高温胁迫 热激蛋白70 基因克隆
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李雅博 李婷 韩莹琰 范双喜
【目的】通过克隆Hsp70相关基因,并利用VIGS分析叶用莴苣热胁迫下Hsp70表达量和形态变化,为解析热激蛋白基因Hsp70在高温胁迫下的响应机制及分子机理奠定基础。【方法】通过同源克隆及RACE技术,获得叶用莴苣热激蛋白LsHsp70-2711的cDNA全长序列,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析该基因在不同温度和不同高温时间下的叶用莴苣热敏品种‘P-S11’和耐热品种‘G-S59’的表达差异,确定基因和高温的相关性。根据VIGS技术,构建p TRV-LsHsp702711瞬时沉默载体,转化
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
张杨 孙明 杨海燕 张启翔
采用同源克隆结合RACE技术从菊花脑叶片中克隆菊花脑(Chrysanthemum nankingense)热激蛋白70基因(hsp70)的cDNA序列,并通过荧光定量PCR(qRT–PCR)分析菊花脑在40℃高温下热激不同时间(0、0.5、1、2、3、6 h)后叶片中hsp70基因的表达差异。结果表明,克隆的cDNA序列全长2 224 bp,与水母雪莲花、紫茎泽兰的hsp70基因在核苷酸和氨基酸水平的同源性分别为88%、98%,表明该序列为菊花脑的hsp70基因序列(GenBank登录号,KJ561911),命名为Cnhsp70。Cnhsp70基因的开放阅读框为1 944 bp,其编码的蛋白(...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
孟彦 肖汉兵 田海峰 胡乔木
结合同源克隆和RACE技术克隆大鲵热应激同源蛋白70基因(hsc70)cDNA序列全长,通过半定量PCR方法分析其在大鲵肾脏、脑、肺、皮肤、肝脏、肾脏、脾脏、心脏、肌肉和垂体组织的表达特点。结果表明:大鲵hsc70基因cDNA全长为2 284 bp(GenBank登录号为HM998289),其中3′端和5′端非翻译区分别为87 bp(1~87)和253 bp(2 032~2 284),中间序列即编码区长为1 944 bp(88~2 031),编码647个氨基酸(AA);其核苷酸序列与其他物种相似性最高达83.5%,而编码的氨基酸序列则相对保守,与钝口螈的相似性达94%;根据其编码的AA序列构建...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
葛奇 顾伟卓 程志鹏 杨洁 胡慧贞 陈龙清
【目的】从荷花（Nelumbonucifera）中克隆NnTOM1基因，并进行生物信息学分析、基因表达模式分析以及烟草遗传转化，为进一步研究NnTOM1基因的功能奠定基础。【方法】通过克隆获得NnTOM1基因，对其蛋白序列进行理化性质和保守结构域预测等生物信息学分析，利用荧光定量PCR（qRT-PCR）技术分析其组织特异性表达，并利用烟草遗传转化初步验证其生物学功能。【结果】NnTOM1基因编码区（Codingsquence，CDS）长度为1191 bp，编码396个氨基酸，蛋白质分子式为C_(1918)H_(3130)N_(560)O_(589)S_(16)，二级结构主要由 α-螺旋和无规则卷曲组成，含有TOM家族保守结构域（VHS-ENTH-ANTH和GAT），定位于细胞质中，多重序列比对及系统进化树分析表明，其与澳洲坚果（Macadamia integrifolia）、蒂罗花（Telopea speciosissima）、博落回（Macleaya cordata）亲缘关系较近且序列一致性较高；qRT-PCR结果显示，NnTOM1基因在瓣化雄蕊中表达量最高，在根中表达量最低，且在重瓣型品种中表达量比单瓣型品种高；与野生型相比，NnTOM1转基因株系的花瓣颜色加深，花瓣先端变尖，花瓣间隔处加宽，花丝变长且明显长于花柱；且OE-1株系比野生型多出1片花瓣，表现出6片花瓣的表型。【结论】荷花NnTOM1基因可能参与荷花花器官的发育，为后续解析NnTOM1基因的功能提供了初步依据，为荷花新品种选育提供了新的基因资源。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
陈龙 朱圣杰 崔阔澍 路慧 王靖 郝雅娴
【目的】克隆春尺蠖热激蛋白Hsp70基因，分析其理化性质与表达情况，探究该基因在春尺蠖应对外界不利环境中的作用。【方法】基于前期所测转录组数据（春尺蠖幼虫不同低温胁迫），克隆获取Hsp70基因，命名为AcinHsp70（GenBank登录号: OP750249）；利用生物信息分析软件对Hsp70基因的理化性质进行分析；采用qPCR技术检测AcinHsp70基因在不同温度（-10、-5、0、5和25 ℃）胁迫中回温与不回温及4 ℃不同时间处理下的表达谱。【结果】春尺蠖AcinHsp70基因完整CDS序列全长1899 bp，编码633个氨基酸，蛋白质预测分子量为69.91 kDa，预测等电点为5.51。在N端均不含信号肽且无跨膜区。磷酸位点检测分别发现丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸位点24、26和8个；未发现糖基化位点。该蛋白的平均亲水性为-0.507，预测不稳定系数为33.19，故该蛋白属于亲水稳定蛋白。亚细胞定位结果显示，其主要位于细胞质。序列一致性比对与系统进化树分析结果显示，春尺蠖与庆网蛱蝶（Melitaea cinxia）亲缘关系最近，序列一致性达92.91%。基因表达结果显示，不同温度（-10 ℃除外）胁迫下，AcinHsp70基因表达量均无明显差异，回温后表达量显著上调。AcinHsp70基因表达量总体呈现先升后降趋势，在4 ℃处理1 h 后表达量达到最大值。【结论】AcinHsp70基因与春尺蠖应对低温胁迫的响应密切相关，结果有助于揭示该基因在低温胁迫下的分子功能。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
赵真真 韩莹琰 李雅博 范双喜 郝敬虹 刘超杰 李婷
为了解叶用莴苣热激蛋白LsHsp70-1707基因在高温下的作用机制,通过同源克隆及RACE技术克隆并获得叶用莴苣热激蛋白LsHsp70-1707基因全长cDNA序列,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析基因在不同叶用莴苣品种中的表达量差异。该基因全长2 400bp(KP258179),开放阅读框为2 106bp,编码701个氨基酸,与西瓜(AAC03416.1)、牵牛花(ABZ04081.1)、黄瓜(CAA52149.1)、菠菜(AAB91471.1)等HSP70蛋白高度同源。实时荧光定量PCR结果表明:高温处理时,该基因在热敏品种中表达没有明显增加,随着处理时间的增加甚至表现为下调,而...
关键词：
叶用莴苣 HSP70 基因克隆 表达分析
[期刊] 淡水渔业
[作者]
连子童 夏雪平 李忠 田海峰 蒋钦杨 胡乔木
为解析黄鳝(Monopterus albus)性逆转机制，实验以雌、雄、间性发育黄鳝为研究对象，分析不同组织、不同发育时期性腺、甲基睾丸酮处理性腺及Zebularine处理性腺原代细胞后dynlt3基因表达模式的变化及其在性腺中的表达定位。性腺转录组测序结果显示，基因全长1 082 bp,开放阅读框354 bp,编码117个氨基酸。生物信息学分析显示，dynlt3基因编码蛋白质的二级结构包含37.96%的α-螺旋，29.20%的β-折叠，32.85%的无规则卷曲。系统进化分析结果显示，黄鳝DYNLT3氨基酸序列与硬骨鱼纲中底鳉(Fundulus heteroclitus)同源性最高。实时荧光定量PCR结果表明，dynlt3基因在黄鳝肌肉和脑具有较高表达，心脏次之，在其它各组织表达量较低。在性腺的不同发育时期，在间性后期和雄性中表达量显著性高于雌性与间性早期。甲基睾酮处理后黄鳝卵巢组织结构发生明显退化，卵母细胞退化且数量减少，结缔组织间出现空泡结构；dynlt3基因在卵巢中表达量显著性下调。原位杂交分析dynlt3基因在性腺组织中的表达定位结果显示，在不同性腺发育时期均检测到dynlt3阳性信号，间性性腺组织中dynlt3基因主要在精原细胞和初级精母细胞中表达，精巢组织中dynlt3基因可在精原细胞与初级精母细胞中，卵巢组织阳性信号较弱，主要在II时相卵母细胞细胞质中表达。Zebularine处理性腺原代细胞后，dynlt3基因表达无显著性差异。以上研究表明，dynlt3参与黄鳝性腺发育过程，并在黄鳝性逆转及性腺细胞发育过程中发挥重要作用，但是甲基化可能不参与其基因表达调控。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
郭鹏 邢鑫 张万筠 姜健
【目的】对紫花苜蓿(Medicago sativa L.cv.Zhongmu-1)stress-induced protein kinase gene 1(Ms SIK1)进行克隆与表达研究,了解该基因的分子机制及其应用。【方法】以紫花苜蓿叶片总RNA为模板,根据同源克隆设计简并引物,利用RT-PCR结合RACE技术,获得Ms SIK1的编码序列。利用同源性比对进行序列分析。通过SMART网站(http://smart.embl-heidelberg.de/)模拟该基因的蛋白结构。构建Ms SIK1的亚细胞定位瞬时表达载体,使用基因枪转化法将Ms SIK1与GFP在洋葱表皮细胞中融合瞬时表达并...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王呈玉 张明哲 吕世友 李彦舫
【目的】克隆强抗寒性牧草短芒大麦钙依赖蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinase,CDPK)基因,分析其生理生化特性,为理想抗逆工程基因的筛选和利用奠定基础。【方法】采用RACE-PCR技术,获得短芒大麦CDPK基因全长cDNA序列;采用Northern杂交分析该基因在逆境条件下(低温(4℃)、干旱(200 g/L PEG6000)、盐(300 mmol/L NaCl)、激素(100μmol/L ABA))的表达模式;采用农杆菌介导的方法,对该基因编码蛋白进行亚细胞定位,并对转基因烟草的离子渗漏率和脯氨酸含量进行测定。【结果】获得了短芒大麦CDPK基因的编码序列...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
贾亚军 王晓婷 许娜 郭娜 邢邯
【目的】对大豆(Glycine max)水杨酸结合蛋白基因Gm SABP2进行克隆与表达分析,并转化拟南芥进行耐盐、耐干旱分析,进一步了解该基因耐盐、耐干旱的分子机制。【方法】以拟南芥SABP2为探针,搜索大豆基因组数据库,从中挑选出同源性最高的序列,将其命名为Gm SABP2。利用电子克隆技术,从大豆叶子中克隆得到大豆水杨酸结合蛋白基因Gm SABP2。通过DNAMAN程序进行氨基酸的多序列比对,利用NCBI的CD-search进行氨基酸的保守结构域分析,应用MEGA程序进行系统进化树分析。对大豆幼苗进行盐和干旱胁迫处理来分析其在胁迫下的表型变化。通过Real time-PCR分析大豆幼苗在...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
王明乐 朱旭君 王伟东 王炫清 林明露 黎星辉
［目的］进一步了解茶树小分子量热激蛋白基因Ｃｓ ＨｓＰ１７．２在逆境胁迫条件下的分子生物学功能。［方法］利用ＲＴ－ＰＣＲ技术从茶树‘迎霜’中克隆得到Ｃｓ ＨｓＰ１７．２基因，运用生物信息学软件分析其核苷酸和编码蛋白，通过Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ分析其表达模式。［结果］该基因开放阅读框长度为４５３ ｂＰ，编码１５０个氨基酸，蛋白质相对分子质量为１７．２×１０３，理论等电点５．５６；无信号肽位点，属于非分泌型蛋白；被定位于细胞质中。系统发育树分析表明，茶树Ｃｓ ＨｓＰ１７．２与水稻（Ｇｅｎ ｂａｎｋ登录号：Ｐ２７７７７）和花生（ａｂＣ４１１３１）的进化关系较近，属于小分子量热激蛋白基因家族第Ⅰ亚．．．
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
王明乐 朱旭君 王伟东 王炫清 林明露 黎星辉
[目的]进一步了解茶树小分子量热激蛋白基因Cs HSP17.2在逆境胁迫条件下的分子生物学功能。[方法]利用RT-PCR技术从茶树‘迎霜’中克隆得到Cs HSP17.2基因,运用生物信息学软件分析其核苷酸和编码蛋白,通过Real-time PCR分析其表达模式。[结果]该基因开放阅读框长度为453 bp,编码150个氨基酸,蛋白质相对分子质量为17.2×103,理论等电点5.56;无信号肽位点,属于非分泌型蛋白;被定位于细胞质中。系统发育树分析表明,茶树Cs HSP17.2与水稻(Gen Bank登录号:P27777)和花生(ABC41131)的进化关系较近,属于小分子量热激蛋白基因家族第Ⅰ亚...
[期刊] 海洋渔业
[作者]
贾昌锋 高海霞 祝茜 张雷
采用表达序列标签(EST)和cDNA末端快速扩增技术(RACE)从松江鲈(Trachidermus fasciatus)体内克隆出一个热休克同源蛋白70(即TfHsc70)。其全长2 138 bp,理论分子量为71.1 kDa,等电点为5.27,并由一个1 947 bp的开放阅读框(ORF)、一个78 bp的5′端未翻译区(UTR)和一个95 bp的3′端带有终止密码子(TAA)的UTR组成。通过与多种鱼类、两栖类和爬行类等动物的热休克同源蛋白70(HSC70)对比发现,其具有88.89%～97.09%的相似性。实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)显示,TfHsc70 mRNA在松江鲈的血液、心脏、肝脏、胃、肠、脾脏、肾脏、大脑、鳃中均有表达,但在皮肤中几乎未检测出。使用脂多糖(LPS)刺激发现,皮肤、血液和肝脏中TfHsc70的表达量在2 h时明显增加,鳃和脾脏中略微上调,而在大脑中呈现先减少再增加的趋势。基于对TfHsc70的蛋白序列以及TfHsc70 mRNA的表达分析,表明TfHsc70是热休克蛋白HSP70家族成员,它可能参与了松江鲈的先天免疫。
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
詹湉湉 樊倩 张杰 许丽惠 王全溪 高玉云 王长康
采用分子克隆技术克隆了黄羽肉鸡胰蛋白酶原（ＴＲＹ）基因，并运用多种生物信息学软件对ＴＲＹ蛋白质结构和功能进行了分析和预测，研究ＴＲＹ在禽类消化过程中的作用．结果表明：黄羽肉鸡ＴＲＹ基因的开放阅读框全长７４７ ｂｐ，由２４８个氨基酸残基组成，其中包含１５个氨基酸的信号肽（ＭＫＦＬＶＬＶＡＦＬＧＶＡＶＡ）和１０个氨基酸的激活肽（ＦｐＩＳＤＥＤＤＤＫ）；该蛋白分子质量为２６．１ Ｋｕ，含有信号肽，不含有糖基化位点，有１１个磷酸化位点；此外，该蛋白属于疏水性蛋白，但不存在跨膜区．氨基酸序列比对的结果表明：黄羽肉鸡ＴＲＹ具有丝氨酸蛋白酶的保守结构特征，如含有催化三联体氨基酸（组氨酸－６４、天冬氨酸－１１．．．
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