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[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
谢丽雪 黄科 李宾 黄志伟 郑金贵
根据GenBank上已公布的植物黑芥子酶基因序列设计引物,采用RT-PCR和3′/5′-RACE相结合的方法,从芥蓝中克隆出黑芥子酶基因全长cDNA序列.序列全长为1832 bp,开放阅读框为1647 bp,编码549个氨基酸,含有糖基水解酶家族Ⅰ(Glyco_hydro_1)活性位点,GenBank登录号为DQ767973.该核苷酸序列与十字花科其他植物的黑芥子酶基因序列具有较高的同源性,同油菜、萝卜、芥菜和大白菜的同源性达90%以上.利用pET28-α(+)构建芥蓝黑芥子酶基因的原核表达载体,转入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表明表达蛋白的分子质量约为65 ku...
[期刊] 华北农学报
[作者]
雷其冬 孙旭东 徐慧妮
为进一步研究转录因子TCP4在植物生长发育过程中的调控作用和下游靶基因。利用生物信息学分析转录因子TCP4家族及其蛋白序列,扩增AtTCP4基因CDS序列、构建原核表达载体并诱导纯化获得蛋白,利用凝胶电泳迁移试验(EMSA)验证AtTCP4蛋白与拟南芥功能基因LOX2启动子区域的顺式作用元件结合。生物信息学分析表明,拟南芥TCP蛋白含有非典型的螺旋-环-螺旋(bHLH)结构域;系统进化树表明,AtTCP4属于Ⅱ类TCP蛋白;蛋白三级结构预测表明:转录因子TCP4可以形成同源或异源二聚体。特异性引物扩增获得AtTCP4基因的CDS序列,其开放阅读框(ORF)长为1 263 bp。构建原核表达载体pET-28a-AtTCP4并转化到Rosetta(DE3)感受态中,经IPTG诱导、纯化和Western Blot检测证明获得AtTCP4蛋白。EMSA试验验证AtTCP4蛋白能够结合到功能基因LOX2的顺式作用元件。转录因子TCP4结合功能基因LOX2启动子区域,影响植物激素茉莉酸的生物合成,调控植物的生长发育过程。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
郭佳 郁品泽 贾敏 郁飞
[目的]制备乙烯应答基因HLS1多克隆抗体,在过表达植物中检测HLS1的积累,为深入研究HLS1响应乙烯信号通路的分子机制奠定基础。[方法]构建pET28a-HLS1c原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导获得重组蛋白HLS1c-His;镍柱亲和纯化重组蛋白后免疫家兔获得抗HLS1血清,利用抗原亲和纯化抗血清获得高纯度的HLS1多克隆抗体;用HLS1抗体和GFP抗体,检测原生质体瞬时转化体系中GFP-HLS1c融合蛋白的表达;用农杆菌蘸花法获得过表达GFP-HLS1g的转基因植物,用HLS1抗体和GFP抗体检测GFP-HLS1g融合蛋白的表达。[结果]成功构建了原核表达载体pET28a-HLS1c,并在大肠杆菌系统中诱导获得重组蛋白HLS1c-His,且多以包涵体形式存在。纯化的HLS1c-His多克隆抗体,能清晰检测到约80 ng原核表达的HLS1抗原。纯化的HLS1抗体不仅能检测到原生质体中瞬时表达的GFP-HLS1c融合蛋白,也能检测到过表达转基因植物株系中的GFP-HLS1g融合蛋白,并且与标签蛋白GFP对应抗体所检测到的特异性条带大小一致。[结论]成功制备了拟南芥HLS1蛋白多克隆抗体,为HLS1蛋白在植物发育中的功能研究奠定了基础。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张孜宸 隋欣 高飞 周宜君 陈静 刘楠
【目的】克隆盐芥谷胱甘肽过氧化物酶(GPXs)基因ThGPX8,对其进行序列分析,构建原核表达载体,为进一步研究ThGPX8的结构和功能奠定基础。【方法】以盐芥为材料,利用RT-PCR技术获得其ThGPX8基因的全长cDNA序列;应用生物信息学手段对该基因编码的蛋白结构和系统进化关系进行分析;构建原核表达载体pET-ThGPX8,转化E.coli BL21(DE3),进行IPTG诱导表达、SDS-PAGE检测和Western blotting鉴定。【结果】获得的ThGPX8基因序列的开放阅读框(ORF)为504bp,编码167个氨基酸,具有GPXs的特征结构域,不是跨膜蛋白;其二级结构主要由无...
关键词：
ThGPX8 盐芥 基因克隆 原核表达
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
胡薇 刘宁 田玉华 李雨婷 张连学
【目的】克隆人参皂苷生物合成途径中的鲨烯环氧酶(SQE)基因,并进行原核表达与纯化,初步探讨SQE活性与人参皂苷生成量之间的关系。【方法】以4年生人参根组织须根为材料,提取其总RNA,反转录为cD-NA。以合成的cDNA为模板,对SQE基因进行克隆,再将其插入原核表达载体pET-30a中,构建pET-30a-SQE重组质粒,经酶切和测序鉴定后,转入Rosetta大肠杆菌,经0.8mmol/L IPTG 37℃诱导表达4h后,进行SDS-PAGE电泳检测,采用Ni-Agarose亲和层析柱纯化目的蛋白,利用液相色谱-串联质谱联用技术(LC-MS)检测SQE的活性。【结果】获得了人参SQE基因1 ...
关键词：
人参 鲨烯环氧酶 cDNA克隆 原核表达
[期刊] 林业科学
[作者]
谢树章 秦平伟 张迷 胡雨晴 李名扬 眭顺照
在构建好蜡梅花cDNA文库并进行EST分析基础上,通过随机克隆测序,得到1个蜡梅几丁质酶的cDNA基因,命名为Cpchia(GenBank登录号:FJ749130)。CpchiacDNA全长为1184bp,开放阅读框为954bp,编码317个氨基酸,其结构包括信号肽、几丁质结合域、可变交联区、催化区,无C端延伸区,为ClassⅠb型胞外几丁质酶,属于几丁质酶第19家族。将Cpchia克隆到原核表达载体pET-28a(+),在大肠杆菌BL2l细胞中以包涵体形式表达融合蛋白,利用透析法获得复性蛋白,其几丁质酶活性经DNS法检测达到200U.mL-1。酶活性和稳定性分析表明,试验条件下,pH7.0有...
关键词：
几丁质酶 克隆 原核表达 蜡梅
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
喻德跃 F.Quigley R.Mache
报道了从模式植物拟南芥花ｃ Ｄ Ｎ Ａ 文库中分离鉴定的一个克隆。该ｃ Ｄ Ｎ Ａ 的长度为 ８８７ ｂｐ，其编译的蛋白质推断为２６８ ａａ（氨基酸），与大豆营养贮藏蛋白（ Ｖ Ｓ Ｐ）的同源率达 ５０％ 。 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ 分析表明，该基因在拟南芥叶片中仅有微量表达，但在花蕾、幼荚及茎中表达量丰富。采用发育后期的花为材料进行原位杂交，发现该基因的表达仅限制于子房壁。
[期刊] 华北农学报
[作者]
方彦 杨刚 孙万仓 曾秀存 武军艳 刘自刚 杨宁宁
为研究芸芥自交亲和机理，采用ｍＲＮＡ差异显示反转录ＰＣＲ（ＤＤＲＴ－ＰＣＲ）分析技术，从芸芥自交亲和系开花前柱头中获得１条差异片段。测序及ＤＮＡ序列的生物信息学分析表明，该差异片段与拟南芥ＤＮＡＪ蛋白同源基因ＡＴ Ｊ３有较高同源性，暂命名为ｅｓＡＴＪ３基因。该序列含有一个长度为２９７ ｂＰ的完整开放阅读框，编码９８个氨基酸残基，含有一个ＤＮＡＪ－Ｃ保守结构域，属于植物ＤＮＡＪ超家族。ｅｓＡＴＪ３基因编码的蛋白无信号肽，是一个亲水性蛋白，该蛋白主要由不规则卷曲和α螺旋组成。实时荧光定量ＰＣＲ分析表明，ｅｓＡＴＪ３基因在芸芥ｓＣ系开花前柱头中表达量较高，初步推测该基因可能参与芸芥亲和性调控。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
孙茂 吴丽艳 龚亚菊 鲍锐 桂敏 黎志彬 杜光辉
【目的】克隆云南野生蒜芥茄（Solanum sisymbriifolium Lam.）中的FLS2基因，并对其编码蛋白的理化性质、亚细胞定位、系统进化以及表达情况予以分析，初步探究野茄FLS2基因在黄萎病胁迫下的生物学功能。【方法】基于前期所测转录组数据（蒜芥茄接种黄萎病病原菌），克隆获取蒜芥茄FLS2基因，命名为SsFLS2；利用生物信息学分析软件对SsFLS2基因的理化性质进行分析，并通过实时荧光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）检测其在蒜芥茄根、茎、叶的表达以及在接种黄萎病病原菌后不同时间的表达情况。【结果】蒜芥茄SsFLS2基因全长3655 bp，具有完整的ORF框，编码1126个氨基酸。其编码蛋白的分子式为C5596H8814N1494O1627S4，理论分子量为124.34 kD，理论等电点（pI）为7.33，总平均亲水性系数为0.081。该蛋白二级结构主要由42.81%的无规则卷曲、40.23%的α-螺旋、13.23%的延伸链以及3.73%的β-折叠组成，且存在跨膜结构，定位于细胞膜上，其中可被磷酸化且超过阈值线的位点，共计151个。SsFLS2蛋白的氨基酸序列与马铃薯（Solanum tuberosum）同源蛋白（XP 006358149.2）的关系最近。RT-qPCR检测发现，在蒜芥茄根、茎、叶中均有SsFLS2基因的表达，且根、叶中的相对表达量极显著高于茎部；接种黄萎病病原菌后72 h內，处理组和对照组均在24 h时，SsFLS2基因的相对表达量大幅度增加且极显著高于其他时间点。【结论】本研究成功克隆了蒜芥茄的SsFLS2基因，并对其编码蛋白的理化性质以及基因表达情况等进行了分析。结果表明，SsFLS2是蒜芥茄响应黄萎病胁迫的重要基因，结果将为进一步研究该基因在蒜芥茄黄萎病抗性中的功能奠定前期基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
王海波 李芙蓉 杨金翠 高永 郭俊云
为了探究磷酸葡萄糖变位酶(PGM)在植物蔗糖与淀粉代谢中的重要作用,基于同源序列比对的方法,在小桐子基因组中鉴定到1个细胞质型PGM基因(命名为JccPGM)与1个叶绿体型PGM基因(命名为JcpPGM),利用qRT-PCR方法检测JccPGM与JcpPGM基因在小桐子不同器官与低温条件下的表达特性,同时,构建了pGEX-4T-1-JccPGM与pGEX-4T-1-JcpPGM原核表达载体并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了表达分析。结果表明:两者分别编码582,637 aa的蛋白质。聚类分析表明,小桐子pPGM在其N端包含叶绿体定位信号肽,而cPGM较pPGM多4段肽链序列-~(108)VGVDGS~(113)-、-~(183)SGPE~(186)-、-~(283)GKSNSE~(288)-、-~(470)SLGEVN~(475)-。qRT-PCR表达分析显示,小桐子cPGM与pPGM基因都在叶片中高表达,而在根与种子中表达量较低。通过BL21(DE3)诱导表达,分别得到90.7,97.0 ku的蛋白条带,与理论融合蛋白的分子量一致。综上所述,本研究为开展小桐子cPGM与pPGM基因表达蛋白的功能分析以及其在蔗糖与淀粉积累、逆境应答中的机制研究奠定了基础。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
朱忠珂 王建华 汪儆 张春雷 蔡青和
为了探讨重组犬溶菌酶的活性及临床应用前景,人工合成犬溶菌酶基因,构建其原核重组表达载体pPROHTa-rcLYZ,进行原核表达并对表达产物进行活性分析。结果表明,合成的犬溶菌酶基因全长396 bp,编码132 aa;构建的表达载体pPROHTa-rcLYZ含有犬溶菌基因完整的ORF;重组犬溶菌酶的相对分子质量为16 ku;重组犬溶菌酶约占全菌总蛋白32％,纯化后占全菌可溶性蛋白的95％;重组犬溶菌酶最适pH值为6．2,最适温度为38℃,对溶壁微球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌有较强的溶菌活力,对铜绿假单胞菌、链球菌、枯草杆菌等有一定的抑制作用,对白色念珠菌无抑制作用,对人工感染的犬大肠...
关键词：
犬溶菌酶基因 犬溶菌酶 原核表达
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
哲名家 张淼涛 云涛 王玢瑸 刘光清
【目的】克隆兔岩藻糖基转移酶(FUT2)基因,并进行原核表达,为进一步研究RHDV的感染过程和致病机理奠定物质基础。【方法】从兔肌肉组织中抽提基因组DNA作为模板,PCR扩增出FUT2基因,然后将该基因亚克隆入原核表达载体pET30a中,获得重组原核表达质粒pET30a-FUT2。将该重组原核表达质粒转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,用IPTG进行诱导表达,分别用SDS-PAGE和Western-blot方法对表达产物进行鉴定。【结果】成功克隆了FUT2基因,该基因长度为1 044bp。成功构建了原核重组表达质粒pET30a-FUT2,其诱导表达产物分子质量约为45ku;表达的重组...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
郑华坤 黄志伟 颜霜飞 郑金贵
采用RACE技术,从茶树新品系"1005"的嫩芽中克隆出ANR基因的全长cDNA(1260 bp),其推导的氨基酸序列与茶树、葡萄花色素还原酶的一致性分别为99%和84%;并成功构建了ANR基因的原核表达载体pET-ANR,在大肠杆菌BL21中表达出预期大小(约45 ku)的融合蛋白.
关键词：
茶树 花色素还原酶 基因克隆 原核表达
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
付洪冰 崔莹 崔崇士
从贝达葡萄中提取总RNA,采用RT-PCR方法,克隆到了白藜芦醇合酶(resveratrol synthase,RS)基因的全长cDNA。将其与圆叶葡萄(Vitis rotundifolia)、华东葡萄(Vitis pseudoreticulata)、河南毛葡萄(Vitis ficifolia)、河岸葡萄(Vitis vulpine)、酿酒葡萄(Vitis virufera)、羊蹄甲(Bauhinia)、花生(Arachis hvpogaea)、虎杖(Polygonum cuspiaatum)、大黄(Rheum officinale)进行氨基酸同源性比对,结果表明:分离的RS基因与其他葡萄的R...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
周晓卉 黄丽华 蒋向 李育强 张学文
【目的】揭示棉田杂草薤白(Allium macrostemon Bunge)抗草甘膦的分子机理,开发利用其草甘膦抗性特性。【方法】运用RT-PCR结合RACE技术,分离克隆了薤白中草甘膦作用的靶酶EPSP合成酶(EPSPs)基因cDNA,并将其构建成原核表达载体在大肠杆菌中诱导表达和鉴定其抗性。【结果】薤白EPSP合成酶基因cDNA序列全长1821bp,编码一段522个氨基酸的推导蛋白质。经BLAST及蛋白质结构预测,蛋白具有EPSPs的特征序列,并与已报道的EPSPs序列有高同源性,确认克隆的cDNA序列即是薤白EPSPs基因序列,命名为EPSPsA。将该cDNA与原核表达载体pRSET-A...
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