【目的】通过筛选引起马流产的4种沙门氏菌（Salmonella）共同的优势抗原，建立一种敏感高、特异强的通用型间接ELISA(iELISA)抗体检测方法，实现对马群中沙门氏菌抗体的快速高通量检测。【方法】首先利用马流产沙门氏菌阳性血清、阴性血清分别与马流产沙门氏菌全菌抗原进行免疫共沉淀（pull down）试验，筛选出马流产沙门氏菌优势抗原；根据质谱分析结果找到优势抗原基因，将优势抗原基因与其他3种致马流产沙门氏菌病的鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌进行序列比对验证其保守性；其次根据抗原性分析对优势抗原编码基因进行分段表达，设计3对引物，利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增沙门氏菌优势抗原基因并将其分别克隆至原核表达载体pET28a；测序分析后将构建正确的重组质粒分别转化入大肠杆菌(Escherichia coli E.coli)Rosetta(DE3)中并加入0.6 mmol·L~(-1)异丙基-β-D-硫代半乳糖甘(Isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG）进行诱导表达，观察蛋白的表达形式；蛋白纯化后通过Western blot验证蛋白的反应原性和广谱性；然后利用纯化后蛋白作为包被抗原，通过对包被抗原量、血清和第二抗体浓度等条件进行优化建立马流产沙门氏菌病间接ELISA抗体诊断方法，并对该方法的特异性、敏感性进行评估。最后将该方法应用于试验感染马血清及临床样本的检测，并将检测结果同凝集试验结果比较。【结果】筛选出的马流产沙门氏菌优势抗原是ompA(Outer Membrane Protein, OMP)，通过序列比对，该蛋白氨基酸序列与同属鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌同源性99.4%—100%，具有很好的保守性；PCR扩增后成功获得3条与预期符合的目的基因；成功构建了pET28a-ompA1、pET28a-ompA2、pET28a-ompA33个重组质粒。SDS-PAGE结果表明，在24℃、0.6 mmol·L~(-1) IPTG诱导5 h下，含有pET28a-ompA1、pET28a-ompA2、pET28a-ompA3的重组菌均表达了相应蛋白，其中重组ompA1和ompA2蛋白以包涵体形式表达，重组ompA3蛋白以可溶性形式表达；Western blot显示，重组蛋白ompA3可与马流产沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌阳性血清发生特异性反应，证明重组ompA3蛋白具有良好的反应原性，可以作为沙门氏菌属抗血清检测用抗原；以ompA3蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法，在最大P/N比确定的最佳反应条件如下：最佳包被抗原浓度为1μg·mL~(-1)，待检血清（1﹕200）37℃作用1 h，酶标抗马二抗（1﹕10 000稀释），TMB在37℃孵育10 min，待检血清OD450>0.143判定为阳性，特异性试验结果显示，该包被抗原与常见马传染病阳性血清无交叉反应。通过对沙门氏菌静脉注射感染马的血清样品进行抗体检测，iELISA可以持续监测抗体阳性到116 d，相比微量凝集（69 d）多监测了47 d，因此iELISA具有更好的敏感性。利用建立的iELISA方法对8个不同牧场180份血清进行抗体检测，其抗体平均阳性检出率为63.3%，比微量凝集阳性检出率高53.9%。【结论】成功筛选到了马流产沙门氏菌病4种病原的共同优势抗原ompA，实现了对该蛋白的可溶性表达，建立了马流产沙门氏菌病通用型iELISA抗体诊断方法，该方法可以实现对临床样本马流产沙门氏菌抗体的检测，该方法具有特异性强、敏感性高，可以作为马流产沙门菌病抗体检测的一种有效工具。

【目的】建立高通量牛布鲁氏菌间接ＥＬＩＳＡ诊断方法，为科学高效诊断牛布鲁氏菌病提供技术手段。【方法】以提纯的猪布鲁氏菌Ｓ２株脂多糖（ＬＰＳ）作为包被抗原，采用棋盘滴定法确定了抗原包被浓度、包被液、抗原包被时间、封闭液、样品稀释液、血清稀释倍数、兔抗牛酶标抗体稀释液、兔抗牛酶标抗体稀释浓度、最佳ＴＭＢ底物反应时间等参数，初步建立了牛布鲁氏菌间接ＥＬＳＩＡ方法。并用上述条件初步建立的方法对１７６份牛布鲁氏菌病阳性血清和１３２份牛布鲁氏菌病阴性血清进行检测。检测结果经ＳＰＳＳ１７．０软件分析，构建受试者工作特征曲线（ＲＯＣ）及曲线下面积，确定敏感性和特异性；通过ＹＯｕｄＥｎ指数确定阴阳性判定的临界点．．．

【目的】建立产气荚膜梭菌β毒素抗体间接ＥＬＩＳＡ检测方法。【方法】将原核表达重组质粒ｐＥＴ－２８Ａ－β转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态细胞，用ＩｐＴＧ进行诱导表达，表达产物经镍柱亲和层析纯化、尿素梯度透析复性后进行ＷＥＳＴＥｒｎ ＢＬｏＴ鉴定。用复性的β毒素重组蛋白作为包被抗原，通过优化间接ＥＬＩＳＡ试验条件，建立其抗体间接ＥＬＩＳＡ检测方法，对该方法的特异性、敏感性和重复性进行考察，并用其对５２１份临床样本进行检测。【结果】通过诱导、纯化和复性，获得了纯度较高且具有良好反应原性的β毒素重组蛋白。间接ＥＬＩＳＡ条件为：抗原最佳包被质量浓度为５．０μＧ／ｍＬ，阳／阴性血清最佳稀释度为１∶５０．．．

【目的】建立羊伪结核棒状杆菌抗体的间接ＥＬＩＳＡ检测方法。【方法】分别用不同浓度的伪结核棒状杆菌菌体抗原和培养上清可溶性抗原包被酶标板，用脱脂奶粉封闭酶标板，设置封闭时间分别为１．０，１．５和２ｈ，再用不同稀释度的血清（１∶１００，１∶２００，１∶４００和１∶８００）与之反应，以此优化间接ＥＬＩＳＡ反应条件，确定阳性结果判定的临界值。对间接ＥＬＩＳＡ方法的特异性和重复性进行考察，并在此基础上对采集的临床样本进行检测。【结果】选用伪结核棒状杆菌菌体为包被抗原，最佳包被抗原菌体密度为ＯＤ６００＝０．０８，血清的最佳稀释度为１∶４００，封闭时间为２ｈ，阳性血清的临界值为０．３２９。该抗体检测方法可特．．．

鸭圆环病毒(DuCV)是新发现的一种感染鸭的最小病毒,可导致鸭淋巴组织损伤。目前尚无检测其抗体的商品化ELISA试剂盒。为了对鸭群进行DuCV血清流行病学调查,本试验用原核表达了全长DuCV Cap蛋白,Western blot检测证明表达产物具有良好的抗原性。以纯化的重组Cap蛋白作为包被抗原,应用30份DuCV抗体阴性血清和16份DuCV抗体阳性血清,建立了检测DuCV抗体的间接ELISA方法,以此方法对从江苏地区收集的部分鸭血清样品进行检测,结果显示DuCV抗体阳性率为26.7%(38/142)。试验证明该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,且方法的变异系数均小于10%。结论:该方法操...

建立了检测猪圆环病毒2型血清抗体的间接ELISA方法,并初步应用于临床血清样品的检测。用PCR方法从PCV2 HBZX株中获得截短的核衣壳(capsid,Cap)基因,将该基因克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-Cap,将该重组质粒转化宿主菌E.coliBL21-CodonPlus(DE3),用IPTG诱导,SDS-PAGE和Western-blot鉴定蛋白的正确表达,表达蛋白Cap分子质量为42 ku,可与6×HIS抗体反应;KCl预染切胶纯化目的蛋白,以其为抗原建立检测PCV2感染猪血清抗体的间接ELISA方法。ELISA检测5份血清样品结果变异系数均小于10...

本文参照GB/T13091-2002和GB4789.4-2010方法对1份骨粉样品进行沙门氏菌检测。结果表明:25 g样品中检出沙门氏菌,经血清分型确认为利卡沙门氏菌,该沙门氏菌血清型在四川省属首次检出。同时对样品受污染原因进行了研究,旨在为避免骨粉类产品受沙门氏菌污染提供意见与参考。

为了解猪源致病性沙门氏菌的耐药状况,建立一种可以快速准确灵敏的确定沙门氏菌耐药表型的检测方法,以满足生产中的实时检测监控及用药指导的需求。所开发的检测方法基于竞争性互补介导核酸恒温扩增(competitive annealing mediated isothermal amplification, CAMP)与微流控芯片于一体的检测技术,分别以β-内酰胺类耐药基因bla_(TEM-1),四环素类耐药基因tetB,氨基糖苷类耐药基因aadA1,这些基因的保守区域片段为靶序列,应用CAMP引物设计推荐规则,设计特异性CAMP引物,通过条件优化建立一种快速检测沙门氏菌耐药基因的方法,并且对该方法的特异性及灵敏度等方面进行了评估。结果表明:所开发的CAMP检测体系可有效检出沙门氏菌,并检测养殖场所实地采集的沙门氏菌不同菌株中bla_(TEM-1)、tetB、aadA1共3种耐药基因,检测结果与测序结果一致,显示出良好的特异性。并且应用本试验建立的CAMP检测方法,沙门氏菌invA基因检测灵敏度最低限为10拷贝,bla_(TEM-1)基因检测灵敏度最低限为102拷贝,aadA1基因检测灵敏度最低限为102拷贝,tetB基因检测灵敏度最低限为103拷贝。本研究所开发的CAMP检测体系,可快速有效地检测沙门氏菌耐药基因,检测体系可使用实时荧光定量PCR设备进行结果判读,也可以使用实验室水浴等温控设备进行基于颜色变化的裸眼结果判读,并可结合微流控芯片进一步提高反应体系密封性,显著减少了试剂用量,降低了对检测设备的需求,从而节约检测成本,将为养殖现场对沙门氏菌耐药状况的实时监测及用药参考提供便捷有力的技术手段。

【目的】研制一种能有效指示假阴性的PCR检测产品,用于沙门氏菌快速、准确、灵敏的检测。【方法】针对沙门氏菌invA基因、stn基因序列分别设计引物与扩增内标,建立添加扩增内标的沙门氏菌PCR检测方法,组装试剂盒,并对试剂盒的各项性能进行评价。【结果】试剂盒对147株沙门氏菌和28株非沙门氏菌的检测结果显示,所有沙门氏菌均能扩增出362 bp的目标条带,非沙门氏菌仅扩增出520 bp的内标条带。试剂盒检测沙门氏菌基因组DNA的检测限为8.0 fg/PCR,检测染菌量为4—5 CFU/10 mL的牛奶样品,增菌8—10 h即得到阳性结果。反复冻融60次或-20℃下贮存1年,均不影响试剂盒的使用效果...

为建立一种用于快速检测赤羽病病毒抗体的竞争ELISA法。用AKV病毒免疫Balb/C小鼠，将其脾细胞与SP2/0细胞进行免疫融合，以获得抗AKV的单克隆抗体；利用Bac-to-Bac杆状病毒表达的SBV N蛋白作为诊断特异性抗原，山羊抗鼠HRP-IgG为二抗，建立并优化AKV抗体检测的竞争ELISA方法。得到一株持续稳定繁殖的能够分泌单抗AKV核蛋白抗体的杂交瘤细胞株，单抗亚型鉴定为：重链IgG1,轻链kappa,仅能与AKV病毒呈阳性反应，与BTV、FAMD、EHDV病毒等病毒抗原不发生特异性反应；建立的检测AKV抗体ELISA检测方法，诊断抗原最佳包被浓度为0.5μg/mL,1∶1 000抗体稀释比，1∶50血清稀释比，1∶2 000二抗稀释比，封闭条件为5%BSA,37℃封闭2 h,确定了血清抑制率大于等于44%时为阳性，小于44%为阴性；所建立的ELISA方法敏感性和特异性鉴定结果与ID Screen AKV Competition检测试剂盒一致。本试验成功制备出一株分泌针对AKV N蛋白的杂交瘤细胞系，建立的ELISA检测方法能够用于检测动物AKV抗体，为进一步开展AKV抗体诊断试剂工艺研究、产业化奠定了基础。

【背景】副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）是猪的上呼吸道病原菌，引起格拉瑟氏病，主要引起断奶前后和保育阶段的猪发病，通常见于5—8周龄的青年猪，发病率一般为10%—15%。该菌有15种血清型，目前主要养猪国家流行的血清型为4型、5型、12型和13型，是严重危害养猪业发展的主要细菌性病原之一。目前国内还没有检测该菌抗体的商品化试剂盒。【目的】研制一种针对副猪嗜血杆菌的快速、敏感和特异性强的抗体检测试剂盒，为格拉瑟氏病的有效防控提供技术支持。【方法】表达并纯化OppA、DppA、HbpA 3种不同的副猪嗜血杆菌ABC转运体周质底物结合蛋白，使用副猪嗜血杆菌阴、阳性参考血清筛选以上3种蛋白中免疫反应性和反应特异性好的蛋白。以筛选的蛋白为包被抗原，建立检测HPS抗体的间接ELISA方法，优化间接ELISA反应条件，并组装试剂盒。在此基础上，确定该试剂盒的敏感性、特异性；通过对不同时间、不同猪场采集的2 000份临床猪血清样本进行检测，评价该试剂盒的实用性；在以上临床血清样本中随机选取200份，分别以研制的试剂盒、间接血凝试验以及进口商品化试剂盒进行检测，比较检测结果，验证该试剂盒的符合率；最后，使用研制的试剂盒检测免疫和攻毒猪采集的血清，评价该菌免疫后的抗体消长规律。【结果】成功表达并纯化了OppA、DppA、HbpA 3种蛋白，发现OppA免疫反应性和反应特异性最好。经过反应条件优化，确定OppA包被浓度为1μg·mL-1，封闭液为0.5%的BSA-PBS溶液，样品稀释液为1%的BSA-PBST溶液，样品孵育时间为30min，样品稀释度为1:50，酶标二抗孵育时间为3 0min，底物作用时间为15 min，临界值为0.18；试剂盒的敏感性和特异性为96.67%，能与国内常见血清型HPS阳性血清反应而不与猪其他常见病原阳性血清发生交叉反应；2 000份临床血清样本阳性检出率为34.65%；随机抽取200份血清样本，与间接血凝试验的符合率为92.50%，与进口商品化试剂盒符合率为87.00%，符合率较高；使用试剂盒检测免疫和攻毒后不同时间采集的猪血清，HPS抗体消长规律符合预期。【结论】研制的副猪嗜血杆菌ELISA抗体检测试剂盒特异性高、敏感性强，与商品化试剂盒和间接血凝试验的符合率高，可用于临床HPS抗体检测和疫苗免疫效果评价。

以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组核衣壳蛋白(rN蛋白)为抗原,初步建立了检测PRRSV抗体的rN-ELISA方法。根据GenBank公布的PRRSV VR2332株编码核衣壳蛋白的ORF7基因序列设计合成了一对引物,成功扩增出ORF7基因。将其克隆到PET-30a构成原核表达载体,转化宿主菌BL21(DE3)并获得表达。通过SDS-PAGE和Western blot检测证实rN蛋白获得了高效表达,且具有良好的免疫学活性。以纯化的重组蛋白为抗原建立检测PRRSV抗体的间接ELISA法。试验证明,该方法与IDEXX公司生产的PRRSV抗体检测ELISA试剂盒对同批临床血清样本的检测结果完...

为了从对虾体内分离出的菌株中快速筛选出蜡样芽孢杆菌和溶藻胶弧菌,将蜡样芽孢杆菌与溶藻胶弧菌作为抗原,免疫SPF新西兰大白兔,获得免疫血清,效价均高于1:2000。将免疫兔血清作为一抗,HRP-羊抗兔血清作为二抗,建立了蜡样芽孢杆菌和溶藻胶弧菌快速检测的间接ELISA方法。此方法中,兔抗血清最佳稀释度为1:10000,菌液最佳包被浓度为106 CFU/ml;HRP-羊抗兔血清最佳稀释浓度为1:1000,可检测细菌最低浓度为104 CFU/ml。抗蜡样芽孢杆菌血清与苏云金芽孢杆菌有交叉反应,抗溶藻胶弧菌血清与其亲缘相近菌株无交叉反应,具有较强的特异性。2012年和2013年,分别从斑节对虾、中国对...

为掌握新疆某养殖场羊源沙门氏菌对常用抗菌药物的耐药情况,并了解其携带部分相关耐药基因的流行现状及β-内酰胺酶、16SrRNA甲基化酶和喹诺酮类耐药基因(Plasmid mediated quinolone resistance,PMQR)的共存情况。使用琼脂稀释法对分离的沙门氏菌进行药敏试验,通过PCR方法进行blaTEM、blaCMY-2、blaCTX-M、blaLAP-1、blaKPC、blaOXA、blaSHV等β-内酰胺酶和armA、rmtB等16SrRNA甲基化酶及qnrA、qnrB、qnrC、

沙门氏菌是人畜共患的重要食源性病原菌,建立灵敏的双重PCR方法有益于实现对致病性沙门氏菌(Sal-monella)的快速检测。以沙门氏菌毒力岛基因为研究对象,根据GenBank发表的沙门氏菌毒力岛基因序列,分别设计合成了沙门氏菌毒力岛mgtC和sopB的2对引物。以鼠伤寒沙门氏菌(ATCC9150)菌株的核酸为模板,经过引物特异性试验,DNA模板灵敏度试验,优化反应条件,成功地建立了快速鉴别以及检测鼠伤寒沙门氏菌的双重PCR方法。特异性试验结果表明,引物mgtC和sopB建立的双重PCR仅能扩增出沙门氏菌(ATCC9150)的2段特异性片段,大小分别是500,1 000 bp。敏感性试验结果表...