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[期刊] 水产学报
[作者]
郝景伟 高保全 王崇 孟宪亮 万晓媛 李小平 刘萍 张庆利
近年来包括急性肝胰腺坏死病(AHPND)在内的多种新发疫病的流行,使我国甲壳类养殖业遭受了严重的经济损失。为了筛查导致山东潍坊某养殖场中一虾蟹混养池塘内患病三疣梭子蟹感染的可能病原,本研究采用分子生物学检测方法,对三疣梭子蟹样品进行了白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、虾血细胞虹彩病毒(SHIV)、致急性肝胰腺坏死病副溶血孤菌(Vp_(AHPND))、虾肝肠胞虫(EHP)、偷死野田村病毒(CMNV)、黄头病毒(YHV)和肝胰腺细小病毒(HPV)等8种病原的检测,并对样品进行了组织病理和原位杂交分析。分子生物学检测结果显示,患病三疣梭子蟹样品呈Vp_(AHPND)阳性,而呈现WSSV、IHHNV、SHIV、EHP、CMNV、YHV和HPV阴性。对样品进行Vp_(AHPND)套式PCR第二轮扩增产物的序列测定、比对和进化树分析,结果显示,扩增产物序列与致病副溶血弧菌质粒上pirA~(vp)毒力基因片段具有99%的同源性,该序列与已报道的多个致病副溶血弧菌PirA聚在进化树的同一主分支上。组织病理学分析显示,患病三疣梭子蟹的肝胰腺小管上皮细胞坏死,心肌纤维呈溶解样病变,鳃丝上皮柱突细胞明显坏死,胸神经节的神经细胞损伤严重,并且这些组织中还可见大量的细胞核固缩现象;原位杂交结果显示,肝胰腺、心肌、鳃组织及胸神经节中的病变部位均存在Vp_(AHPND)探针的蓝紫色杂交信号。以上表明,虾蟹混养池塘中三疣梭子蟹在自然状态下感染了Vp_(AHPND),并导致肝胰腺、心肌、鳃和胸神经节发生了严重病理损伤。本研究首次在养殖三疣梭子蟹中检测到Vp_(AHPND)感染并揭示了感染所致的病理变化,相关结果为揭示Vp_(AHPND)自然宿主种类和养殖三疣梭子蟹病害防控提供了基础信息。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
陈蒙蒙 董宣 邱亮 万晓媛 谢国驷 黄倢
对虾急性肝胰腺坏死病(Acute hepatopancreatic necrosis disease,AHPND)是由致AHPND副溶血弧菌(AHPND-causing Vibrio parahaemolyticus,VpAHPND)携带的pVA1-like质粒所表达的PirA~(Vp)和PirB~(Vp)毒力蛋白对对虾肝胰腺的急性毒性所致。本研究用2.19×10~5 CFU/ml VpAHPND分离株20130629002S01对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)进行浸泡感染,于感染后2~9 d采集对虾的肝胰腺、鳃、肠道、肌肉组织,采用实时荧光定量PCR方法,检测各组织中的pir AVp拷贝数。结果显示,感染后凡纳滨对虾各组织均能检测到pirA~(Vp),其中,肝胰腺在感染后第4天达到峰值,为8.71×10~4 copies/mg,而鳃、肌肉、肠道分别在第3、4、5天达到峰值,分别为9.08×10~3、2.59×10~4、5.76×10~4 copies/mg。早期感染鳃组织中先出现Vp_(AHPND)的富集,在高死亡发生期,Vp_(AHPND)数量在肝胰腺和肠道出现高峰,在死亡数量逐渐下降的后期,各组织的Vp_(AHPND)均快速下降,肠道、肝胰腺和肌肉中的Vp_(AHPND)水平趋于接近。对虾肝胰腺组织病理切片显示,同一时间有临床症状的病虾和濒死对虾相比,濒死对虾表现出更严重的AHPND病理特征,且二者的组织病理特征均随着感染时间的延长变得更为严重,但检测到的Vp_(AHPND)数量呈下降趋势。研究表明,在Vp_(AHPND)感染过程中,组织中的pirA~(Vp)基因数量不能代表对虾的发病程度,发病程度及组织病理严重的AHPND样品中Vp_(AHPND)的数量不一定处于高水平状态。
[期刊] 水产学报
[作者]
孙明玉 冯博 张昭寰 徐马俊坤 刘伟奇 刘海泉 潘迎捷 赵勇
针对12株引起凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)的致病性副溶血弧菌,运用多位点测序技术,分析致病菌株的遗传特征。实验选择副溶血弧菌的7个管家基因dnaE、gyrB、recA、dtdS、pntA、pyrC及tnaA,对12株AHPND致病菌扩增测序。将核酸序列上传至PubMLST数据库进行比对后获得每株菌的序列型。收集其他地区AHPND致病性副溶血弧菌的多位点序列分型(MLST)数据,采用eBURSTV3及MEGA5.0软件进行遗传进化分析。结果显示,2014年中国广东分离的AHPND致病株属于一个新
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
童桂香 黎小正 吴祥庆 黄鸾玉 黄光华 韦信贤
根据pir AVp基因保守序列设计特异性引物和TaqMan–MGB探针,经优化反应体系及条件,建立检测致对虾急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)的TaqMan–MGB探针荧光定量PCR方法;以重组质粒为标准品制作标准曲线,并进行特异性、敏感性、重复性及临床应用试验。结果表明:该方法定量范围宽,起始模板浓度范围为1×101～1×109拷贝/反应时,标准曲线具良好的线性关系;最低检测限约为10拷贝/反应,与对虾其他病原菌及病毒无交叉反应,重复试验变异系数为0.37%～0.47%,可在1 h内完成单个样品检测;对临床对虾样品及水样的检测结果表明,与世界动物卫生组织(OIE)推荐的套式PCR法相比,可提高VpAHPND的阳性检出率,且检测为阳性的样品包含全部套式PCR法检测为阳性的样品。可见,应用TaqMan–MGB探针建立的检测VpAHPND的荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好、能快速定量等优点,可用于临床对虾样品及水样的VpAHPND检测。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
贾丹 史成银 黄倢 张庆利 万晓媛 许华 刘冉阳 王海波 郭程程 谢国驷
本研究从患急性肝胰腺坏死病(Acute hepatopancreatic necrosis disease,AHPND)的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肝胰腺中分离到一株优势菌,编号为20160303005-1,通过16S rRNA和分子伴侣蛋白groEL基因序列分析,并结合生理生化特征,将该细菌鉴定为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus),其血清型为O1:KUT(K untypeable)。基因分析结果显示,该菌株携带可引起对虾AHPND的相关毒力蛋白基因pirA~(VP)和pirB~(VP),但不携带副溶血弧菌临床菌株毒力基因:耐热直接溶血毒素(Thenmostable direct hemolysin,tdh)和相对耐热直接溶血毒素(TDH-related hemolysin,trh)基因。菌株对凡纳滨对虾具有较强的致病性,浸泡感染的半数致死剂量(LD_(50))为7.96×10~3 CFU/ml。对虾急性感染后,6 h肝胰腺颜色变浅,肠胃变空;9 h肝胰腺呈浅白色,萎缩变小。9 h死亡数过半,24 h全部死亡。组织病理学分析显示,感染后对虾肝胰腺小管崩塌,上皮细胞严重脱落,呈现出典型的AHPND病理症状。药敏实验结果显示,该菌对庆大霉素、环丙沙星和头孢他啶等16种药物敏感,对阿莫西林、替卡西林和头孢噻吩等5种药物表现为耐药。上述研究可为该病原的流行病学及药物防控研究提供基本数据。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
李昊 张铭洋 于永翔 王印庚 张正 马翠萍 陈夫山
急性肝胰腺坏死病(AHPND)是对虾养殖过程中最常见、最严重的疾病，给对虾养殖造成重大经济损失。AHPND病原种类多、基因型复杂，现有的针对不同病原的检测技术目标导向较弱、检测成本高、时间消耗长，对虾健康养殖亟待开发AHPND的精准快速诊断技术。本研究针对AHPND病原体携带编码一种二元毒素pirA和pirB大型质粒的遗传共性，基于pirA和pirB基因设计特异性引物并建立微流控荧光定量PCR检测方法。该方法对致病基因pirA和pirB特异性强、灵敏度高，最低检测限分别为5.43×10~0和4.31×10~1 copies/μL，样品平均检测时间为26min左右。为进一步评估该方法在实际应用中的准确性，以含有pirA和pirB毒性质粒的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)进行人工感染实验。结果表明，感染后的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)鳃丝、肝胰腺、肠道和肌肉等组织随时间的推迟均能检测到pirA和pirB；从感染2h的结果来看，pirB比pirA检出率更高。此外，致病因子pirA和pirB比toxR的检出率更高，更适合对AHPND致病原的检测。本研究建立的微流控荧光定量PCR检测的方法具有快速、灵敏、高通量、污染少、现场检测、一体化集成等优点。该技术不仅适用于实验室，更符合养殖基层的现场快速检测需求，为及早认知疾病发生风险和病害精准防控提供了新的技术手段与理论支撑。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
王印庚 于永翔 蔡欣欣 张正 王春元 廖梅杰 朱洪洋 李昊
为预报池塘养殖凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)的发生，自2020年开始，笔者对凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)养殖区开展了连续监测工作，包括与疾病发生相关的环境理化因子、微生物因子、虾体自身健康状况等18个候选预警因子指标，通过数据标准化处理后分析病原、宿主与环境之间的相关性关系，对候选预警因子进行筛选，基于Python语言编程结合Deep Forest、LightGBM、XGBoost算法进行数据建模和预测性能评判，仿真环境为Python2.7，以预警因子指标作为输入样本(即警兆)，以对虾是否发病指标作为输出结果(即警情)，根据输入样本和输出结果各自建立输入数据矩阵和目标数据矩阵，利用原始数据矩阵对输入样本进行初始化，结合函数方程进行拟合，拟合的源代码能利用已知环境、病原及对虾免疫指标数据对目标警情的预测。最终建立了基于Deep Forest算法的虾体(肝胰腺内)细菌总数、虾体弧菌(Vibrio)占比、水体细菌总数、盐度的4维向量预警预报模型，准确率达89.00%。本研究利用人工智能算法应用到对虾AHPND发生的预测预报，相关研究结果为对虾AHPND疾病预警预报建立了预警数学模型，并为对虾健康养殖和疾病防控提供了技术支撑和有力保障。
[期刊] 水产学报
[作者]
谢建军 许文军 施慧 查智辉
以平均体质量为(162±26)g雌性三疣梭子蟹为试验对象,注射组从游泳足第一关节基膜注射200μL浓度为2.4×107 CFU/mL的溶藻弧菌菌悬液,对照组注射等量无菌生理盐水。各组在注射0、24、48、72、96 h后随机取9只三疣梭子蟹,从游泳足基膜部位抽取血淋巴,测定血淋巴的血细胞总数、大颗粒细胞比例、血清蛋白、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、一氧化氮和诱导型一氧化氮合成酶等非特异性免疫指标。结果表明,遭受低剂量的溶藻弧菌侵袭后,三疣梭子蟹血细胞总数迅速降低(P<0.05),与对照组相比降低36%,而大颗粒细胞比例则先上升(P
[期刊] 淡水渔业
[作者]
高晓华 张海强 安伟
为查明上海市奉贤区某对虾养殖场疑似患急性肝胰腺坏死病的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的病原菌，本研究从患病凡纳滨对虾肝胰腺组织分离纯化到1株优势菌FHBX-1,并通过人工回归感染试验确定其致病性，利用VITEK-2全自动微生物鉴定仪和16S rRNA、热休克蛋白HSP60基因序列分析进行综合鉴定，并检测其毒力基因。同时采用K-B纸片扩散法检测病原菌的药物敏感性并通过石蜡切片观察患病凡纳滨对虾肝胰腺组织的病理特征。结果显示：菌株FHBX-1经生理生化特征测定、16S rRNA和热休克蛋白HSP60基因序列分析，综合鉴定为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus),且携带了急性肝胰腺坏死病相关的毒力基因pirA~(VP)、pirB~(VP),未携带副溶血弧菌临床主要毒力基因耐热直接溶血毒素tdh和相对耐热直接溶血毒素trh基因。人工回归感染试验结果显示，凡纳滨对虾在菌液浓度为1.0×10~6 CFU/mL浸泡感染试验组，7 d内累计死亡率为80%,患病凡纳滨对虾具有肝胰腺颜色变白、萎缩变小，胃肠变空等症状，从病虾再次分离的优势细菌与原攻毒菌FHBX-1特性相同。组织病理学观察显示，患病凡纳滨对虾肝胰腺上皮细胞严重脱落，肝小管崩塌，呈典型的AHPND病理特征。药敏试验结果表明，菌株FHBX-1对氟苯尼考、多西环素、恩诺沙星等11种抗菌药物敏感，对新霉素、红霉素中度敏感，对链霉素、庆大霉素等5种抗菌药物耐药。本研究可为对虾急性肝胰腺坏死病的流行病学研究及药物防控提供基础依据。
[期刊] 水产学报
[作者]
陈晨 母昌考 宋微微 李荣华 王春琳
为探究三疣梭子蟹"科甬1号"新品种(简称"科甬1号")和普通海捕野生三疣梭子蟹子1代(简称"普通蟹")在生长速率、形态特征和对溶藻弧菌耐受性上的差异,通过对相同生长条件下"科甬1号"和普通蟹的30、60、90、120和150日龄5个时间点进行体质量和形态指标测量,并在60、90、120和150日龄4个时间点,用浓度为1.14×107cfu/m L溶藻弧菌按10μL/g(体质量)剂量进行体腔注射攻毒并统计死亡率。对数据进行ANOVA检验表明,在全部5个测量时间点,"科甬1号"体质量均极显著大于普通蟹体质量;"科甬1号"和普通蟹各形态特征差异均不显著;在60和90日龄2个攻毒时间点,"科甬1号"溶...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
韩晓琳 高保全 王好锋 刘萍 陈萍 李华
在实验生态条件下研究了低盐环境对三疣梭子蟹鳃丝和肝胰腺显微结构、家系存活率的影响。研究结果表明,低盐(15.0、13.0、11.0、9.0)胁迫能够诱导鳃丝和肝胰腺显微结构改变。盐度为15.0时,上皮层变薄,B细胞数量增多;盐度为13.0时,鳃丝不规则增厚,B细胞数量进一步增多,肝小管中的R细胞的数量减少,柱状上皮细胞的细胞质内出现许多空泡;盐度为11.0时,上皮层出现解体,鳃腔中的血细胞明显增多,肝细胞空泡化现象更为严重;盐度为9.0时,上皮层破坏直至解体,B细胞中转运泡数量增多,体积增大,细胞结构损伤严重。以72h的低盐半致死盐度(LD50=11.1)为评价指标,检测24、48、72h共计...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
陈萍 王清印 李健 李吉涛 刘淇 刘萍
将健康的三疣梭子蟹(平均体重176±21.3g)分别注射生理盐水和溶藻弧菌,在感染后0、24、48和72h分别采集不同处理组梭子蟹的血淋巴、肌肉和肝胰腺组织,测定其中的溶菌酶(LSZ)、酸性磷酸酶(ACP)及碱性磷酸酶(ALP)活性,研究溶藻弧菌对三疣梭子蟹体内免疫相关酶活的影响。结果表明,感染组梭子蟹血淋巴LSZ活性在感染后24h显著高于对照组(P<0.05),随后活性显著降低(P<0.05);肌肉和肝胰腺组织中LSZ活性在感染24h有稍微上升的趋势,但是随着感染时间的延长其活性又逐渐下降,且在感染48h后分别显著低于对照组(P<0.05)。感染组梭子蟹不同组织中ACP和ALP酶活随着感染时...
[期刊] 上海水产大学学报
[作者]
施慧 许文军 徐汉祥 李鹏飞 史海东
血卵涡鞭虫病是近年来三疣梭子蟹养殖过程中发生的一种危害较大的流行性疾病,患病蟹的体液和肌肉组织中有大量的血卵涡鞭虫寄生。该病多发生于每年9~11月份的夏秋季节,会在短时间内出现死亡高峰。因该病流行范围广、死亡率高、危害严重,对三疣梭子蟹养殖业发展影响很大。本文根据GenBank中登陆的血卵涡鞭虫18S rDNA和ITS1基因序列设计了1对特异性引物,建立了血卵涡鞭虫病的PCR检测方法,从感染血卵涡鞭虫的三疣梭子蟹组织DNA中扩增出产物大小为585 bp的DNA片段。本方法可快速、特异地检测出三疣梭子蟹感染和携带血卵涡鞭虫的状况,为三疣梭子蟹的健康养殖和血卵涡鞭虫病的流行病学调查提供了快速、简便...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
杨印蹼 吴旭干 王伟 刘智俊 楼宝 成永旭
采用单个体养殖实验和生化分析技术,研究了纯化饲料(A组)、活饵料(章鱼和缢蛏,B组)和混合投喂(纯化饲料和活饵料有规律地交替使用,C组)对三疣梭子蟹幼蟹(初体重0.5 g左右)成活、生长性能、肝胰腺指数(HSI)和生化组成的影响。结果表明:(1)3组幼蟹的成活率并无显著差异,均在70%～80%之间;(2)A组和B组幼蟹的增重率、蜕壳周期、特定增长率和饲料系数无显著差异,C组幼蟹的第二次蜕壳周期和饲料系数显著低于其它两组,其特定增长率显著高于其它两组;(3)3种投喂方式的饵料对幼蟹的肝胰腺指数及其蛋白和脂肪含量影响显著,A组幼蟹肝胰腺指数及其脂肪含量显著高于其它两组,但蛋白含量显著低于其它两组;...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
赵伟 王雷 刘梅 蒋克勇 齐灿灿 杨广 王宝杰
为了研究致病性副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)对凡纳滨对虾(Litopanaeus vannamei)肝胰腺抗氧化酶活性及相关基因表达的影响,本研究选取始体重(2.20±0.24)g的健康凡纳滨对虾初270尾,将其随机分为2组,分别以0 CFU/m L和5×107 CFU/m L剂量的致病性副溶血弧菌对凡纳滨对虾进行浸浴攻毒实验。在实验第6小时、12小时、24小时和36小时取肝胰腺,进行抗氧化酶活性及免疫相关基因表达测定。结果显示,感染副溶血弧菌后,实验组对虾肝胰腺中超氧化物歧
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