【目的】筛选仔猪痢疾病原菌沙门氏菌特异性噬菌体,为噬菌体制剂的研制和仔猪痢疾的生物防治提供参考。【方法】从患痢疾仔猪粪便中分离致病菌沙门氏菌,鉴定后以其为宿主菌,从生活污水中筛选、纯化出特异性噬菌体,并以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为对照,检测该噬菌体的特异性。【结果】分离到了致病菌沙门氏菌,并得到了纯化的沙门氏菌噬菌体;经检测,该噬菌体只能裂解沙门氏菌,而对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌没有作用。【结论】得到了纯化的可裂解沙门氏菌的特异性噬菌体。

[目的]本文旨在分离一株针对耐多药肠炎沙门菌且宿主谱广泛的烈性噬菌体，并研究其生物学特性。[方法]从山东烟台某鸭场采集58份粪便样品，以鸭源肠炎沙门菌sdc-11为宿主分离噬菌体，并对噬菌体分离株进行形态学观察、温度和pH稳定性、最佳感染复数（MOI）、一步生长曲线测定等生物学特性分析，测试其对73株不同血清型沙门菌的裂解谱，以及对sdc-11生物被膜形成的抑制和对成熟生物被膜的清除作用，最后进行基因组测序分析。[结果] 分离获得1株长尾噬菌体，命名为Salmonella phage YT 90。该噬菌体在30～60℃和pH 4～10的范围内，均表现出较好的增殖能力，最佳感染比是10~(-8)，潜伏期10 min，裂解期80 min，裂解量为278；可裂解76.7%（14/21）肠炎沙门菌、66.67%（28/42）鼠伤寒沙门菌和75%（3/4）鸡白痢沙门菌；在96孔细胞板上，YT90具有抑制sdc-11生物被膜形成的潜力，并能有效清除成熟生物被膜；全基因组测序发现，YT90的基因组全长121 240 bp，不含已知的毒力因子和耐药相关基因，不编码整合酶；基于末端酶大亚基构建的进化树表明，YT90与沙门菌噬菌体GRNsp50关系最近，属于根西病毒亚科（Guernseyvirinae）新泽西病毒属（Jerseyvirus）。[结论]从鸭场粪便样品中分离获得1株烈性噬菌体YT90，可裂解多种血清型沙门菌，耐受性强、潜伏期短、裂解量大，在防治沙门菌感染方面有较好的临床应用潜力。

利用增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)表征鼠伤寒沙门氏菌株14028(Sal-14028),以研究其在猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)中的示踪作用，首先将增强型绿色荧光蛋白基因通过电击法转入Sal-14028,经卡那霉素抗性培养基筛选和测序鉴定，获得了具有绿色荧光信号的阳性菌株并检测其荧光稳定性，命名为Sal-pPpagC-EGFP。接着在同等条件下对比荧光菌株和野生菌株(WT)的生长特性，通过小鼠感染试验检测EGFP基因的插入对荧光菌株毒力有无明显影响，以分析荧光菌株的生物学特性；应用荧光显微镜和间接免疫荧光法检测荧光菌株在猪肺泡巨噬细胞3D4/21吞噬溶酶体中的定位情况。结果显示，在不同时间点，EGFP标记的鼠伤寒沙门氏菌在荧光显微镜下发出强烈的绿色荧光，且所带荧光不受抗性选择的影响，可稳定遗传。相同培养条件下，荧光菌株Sal-pPpagC-EGFP生长曲线的变化趋势与野生株基本相同。另外，经过改良寇氏法计算出的LD_(50)与野生株相比无显著差异(P>0.05),说明EGFP基因的插入对荧光菌株毒力无明显影响。荧光菌株在感染猪肺泡巨噬细胞后，吞噬溶酶体内可观察到标记菌株，并随着时间增加菌株数量呈现增长趋势。表明荧光菌株除了具备发光特性外，其他生物学性状没有明显改变。

为探索针对耐药沙门菌的噬菌体治疗方法，以沙门菌SE-21为宿主菌，从污水中分离得到一株烈性噬菌体并命名为vB＿SalP＿QS。在鉴定vB＿SalP＿QS生物学特性的基础上，对vB＿SalP＿QS和vB＿SalP＿SE29混合噬菌体治疗由沙门菌SE-21引起小鼠肠炎的治疗效果进行评价。结果表明：1）电镜观察可见该噬菌体属于有尾病毒目（Caudovirales），其效价为8×10～8 PFU/mL。2)vB＿SalP＿QS的最佳感染复数（MOI）为0.01，潜伏期为40 min，裂解期为50min。温度为4～60℃具有较好的活性，在pH4～pH10范围内非常稳定。平板点滴法试验表明vB＿SalP＿QS可以裂解17株沙门菌，裂解率为44.7%。3）噬菌体vB＿SalP＿QS的全基因组测序分析显示，噬菌体vB＿SalP＿QS全长42 293 bp,GC含量为49%，共含有72个开放阅读框，且不含有溶源性、毒力因子及整合酶基因。4）小鼠体内治疗试验显示，宿主菌SE-21对小鼠最小致死量为5×10～8 CFU/mL，感染小鼠经vB＿SalP＿QS (100μL1×107 PFU/mL)和vB＿SalP＿SE29 (100μL 1×10～7 PFU/mL)混合治疗后存活率为100%，单独用vB＿SalP＿QS治疗组（200μL 1×10～7 PFU/mL）的小鼠存活率为80%，单独用vB＿SalP＿SE29治疗组（200μL 1×10～7 PFU/mL）的小鼠存活率为70%，对照组全部死亡。5）病理组织观察表明，混合噬菌体可以有效杀灭沙门菌SE-21的同时，还能更好地保护小鼠肠绒毛，可显著提高感染SE-21的小鼠存活率。综上，噬菌体vB＿SalP＿QS具有良好的酸碱稳定性、热稳定性以及安全性，混合噬菌体联合治疗效果优于噬菌体单一治疗。本研究为噬菌体制剂治疗沙门菌感染提供了重要依据，也为混合噬菌体鸡尾酒疗法的临床应用奠定基础。

为深入了解沙门氏菌草酰乙酸脱羧酶的生化特性及功能,将该酶基因克隆到表达载体中,转入大肠杆菌中诱导表达,表达产物经monomeric avidin-Sepharose亲和层析分离纯化,获得了纯的沙门氏菌草酰乙酸脱羧酶。结果表明:纯化后的草酰乙酸脱羧酶经SDS-PAGE检测,呈现3条蛋白谱带,相对分子质量分别为65×103、46×103、8.8×103左右;该酶不耐高温,50℃温浴1h后活力几乎完全丧失;其最适pH为6.0左右;1mmol·L-1Zn2+、0.5mmol·L-1草酸和20mmol·L-1丙酮酸几乎完全抑制该酶的活力,10～20mmol·L-1NaCl对该酶有明显激活作用,但200～...

为了获得纯度高、特异性好的抗猪丹毒丝菌特异性IgG,采用抗原反向吸附结合重组葡萄球菌蛋白A(SPA)亲和层析法对猪丹毒丝菌阳性血清进行纯化。结果表明,血清用量对IgG的纯化结果影响不大,而细菌的用量则与IgG的获得量成正比;用猪丹毒丝菌与阳性血清吸附,初步纯化出的猪丹毒丝菌特异性IgG,再用SPA亲和层析法特异性的浓缩和纯化IgG,获得的抗体含量为240μg/mL,即从8 mL阳性血清中获得360μg猪丹毒丝菌特异性IgG,其纯度接近100%,可用于噬菌体展示的靶分子。

为了分离以致病性痢疾志贺菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙＳｅｎｔｅｒｉａｅ）ＣＭＣＣ（Ｂ）５１１０５为宿主菌的烈性噬菌体，并分析其生物学特性及其对患痢疾肉鸡的治疗效果，采用双层平板法从水样中分离纯化获得烈性噬菌体ＳｙＪ４，其最佳感染复数（ＭＯｉ）为０．１，最适感染温度为３７℃，最适感染ｐ ｈ范围在６－８；一步生长曲线表明噬菌体ＳｙＪ４裂解量约为５０，潜伏期约为２０ Ｍｉｎ，裂解期约为１２０ Ｍｉｎ；将无菌噬菌体富集液通过灌喂方式作用于由Ｓ．ｄｙＳｅｎｔｅｒｉａｅ ＣＭＣＣ（Ｂ）５１１０５导致的出现明显白痢症状的病鸡中并与链霉素治疗效果进行比较，结果表明噬菌体ＳｙＪ４对痢疾志贺菌（Ｓ．ｄｙＳｅｎｔｅｒ．．．

为开发噬菌体裂解酶作为一种新型的抗菌剂,用于沙门菌的防控,采用生物信息学及异源表达蛋白的方法,获得鼠伤寒沙门菌噬菌体T139的裂解酶,并验证裂解酶对鼠伤寒沙门菌的裂解活性。通过对鼠伤寒沙门菌噬菌体T139基因组进行分析,发现该基因组全长38 854 bp,平均GC含量为49.10%,不包含tRNA基因。进化树分析表明噬菌体T139属于T7噬菌体属,共预测出43个ORFs,有23个被赋予已知功能。多序列比对及保守结构域分析表明,orf 40基因编码的蛋白(LysT40)包含126个氨基酸残基,具有内肽酶保守结构域,为可能的噬菌体裂解酶。LysT40二级结构中存在大量的螺旋结构(70.63%),使得该蛋白能够保持结构稳定。将orf 40进行异源表达、纯化,经过SDS-PAGE和Western blot分析,在10～15 ku处获得单一目标蛋白条带,纯化的蛋白质量浓度为280μg/mL。LysT40在30 min内对氯仿或EDTA预处理的鼠伤寒沙门菌具有较好的裂解活性,吸光值OD_(600)相比于对照组分别下降0.18和0.31。

【目的】探讨诃子、虎杖、紫花地丁、夏枯草和何首乌提取物对鸡白痢沙门氏菌的抑制效果。【方法】采用超声波处理、乙醇回流、水浴加热的方法,提取诃子、虎杖、紫花地丁、夏枯草、何首乌5味中药的有效成分,采用二倍试管稀释法分别测定各中药提取物对鸡白痢沙门氏菌的最小抑菌质量浓度(Minimal inhibitory concentration,MIC)和最小杀菌质量浓度(Minimal bactericidal concentration,MBC),并采用肉汤稀释棋盘法,测定中药提取物对鸡白痢沙门氏菌的联合抑菌效果。【结果】诃子、虎杖、紫花地丁、夏枯草、何首乌提取物对鸡白痢沙门氏菌的MIC、MBC值分别为1...

【目的】通过筛选引起马流产的4种沙门氏菌（Salmonella）共同的优势抗原，建立一种敏感高、特异强的通用型间接ELISA(iELISA)抗体检测方法，实现对马群中沙门氏菌抗体的快速高通量检测。【方法】首先利用马流产沙门氏菌阳性血清、阴性血清分别与马流产沙门氏菌全菌抗原进行免疫共沉淀（pull down）试验，筛选出马流产沙门氏菌优势抗原；根据质谱分析结果找到优势抗原基因，将优势抗原基因与其他3种致马流产沙门氏菌病的鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌进行序列比对验证其保守性；其次根据抗原性分析对优势抗原编码基因进行分段表达，设计3对引物，利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增沙门氏菌优势抗原基因并将其分别克隆至原核表达载体pET28a；测序分析后将构建正确的重组质粒分别转化入大肠杆菌(Escherichia coli E.coli)Rosetta(DE3)中并加入0.6 mmol·L~(-1)异丙基-β-D-硫代半乳糖甘(Isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG）进行诱导表达，观察蛋白的表达形式；蛋白纯化后通过Western blot验证蛋白的反应原性和广谱性；然后利用纯化后蛋白作为包被抗原，通过对包被抗原量、血清和第二抗体浓度等条件进行优化建立马流产沙门氏菌病间接ELISA抗体诊断方法，并对该方法的特异性、敏感性进行评估。最后将该方法应用于试验感染马血清及临床样本的检测，并将检测结果同凝集试验结果比较。【结果】筛选出的马流产沙门氏菌优势抗原是ompA(Outer Membrane Protein, OMP)，通过序列比对，该蛋白氨基酸序列与同属鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌同源性99.4%—100%，具有很好的保守性；PCR扩增后成功获得3条与预期符合的目的基因；成功构建了pET28a-ompA1、pET28a-ompA2、pET28a-ompA33个重组质粒。SDS-PAGE结果表明，在24℃、0.6 mmol·L~(-1) IPTG诱导5 h下，含有pET28a-ompA1、pET28a-ompA2、pET28a-ompA3的重组菌均表达了相应蛋白，其中重组ompA1和ompA2蛋白以包涵体形式表达，重组ompA3蛋白以可溶性形式表达；Western blot显示，重组蛋白ompA3可与马流产沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌阳性血清发生特异性反应，证明重组ompA3蛋白具有良好的反应原性，可以作为沙门氏菌属抗血清检测用抗原；以ompA3蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法，在最大P/N比确定的最佳反应条件如下：最佳包被抗原浓度为1μg·mL~(-1)，待检血清（1﹕200）37℃作用1 h，酶标抗马二抗（1﹕10 000稀释），TMB在37℃孵育10 min，待检血清OD450>0.143判定为阳性，特异性试验结果显示，该包被抗原与常见马传染病阳性血清无交叉反应。通过对沙门氏菌静脉注射感染马的血清样品进行抗体检测，iELISA可以持续监测抗体阳性到116 d，相比微量凝集（69 d）多监测了47 d，因此iELISA具有更好的敏感性。利用建立的iELISA方法对8个不同牧场180份血清进行抗体检测，其抗体平均阳性检出率为63.3%，比微量凝集阳性检出率高53.9%。【结论】成功筛选到了马流产沙门氏菌病4种病原的共同优势抗原ompA，实现了对该蛋白的可溶性表达，建立了马流产沙门氏菌病通用型iELISA抗体诊断方法，该方法可以实现对临床样本马流产沙门氏菌抗体的检测，该方法具有特异性强、敏感性高，可以作为马流产沙门菌病抗体检测的一种有效工具。

[目的]研究茶树精油对沙门氏菌的生长、碱性磷酸酶含量、胞外蛋白含量、电导率、生物膜形成、鞭毛动力等的影响,初步探讨其抑菌机理。[方法]分别检测茶树精油和多种抗生素对沙门氏菌最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)及茶树精油对沙门氏菌最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC)。检测不同质量浓度茶树精油对沙门氏菌生长曲线、碱性磷酸酶活性和胞外蛋白质量浓度、电导率、生物膜、鞭毛动力的影响。[结果]茶树精油对沙门氏菌的MIC和MBC均为10 540μg/mL。2 635,5 270,10 540μg/mL茶树精油对沙门氏菌的生长均有抑制作用,且随着茶树精油质量浓度的增加,其对沙门氏菌的抑制作用增强,沙门氏菌的碱性磷酸酶活性和胞外蛋白质量浓度增加,电导率增强,生物膜形成受到抑制,鞭毛动力下降。[结论]茶树精油通过影响沙门氏菌的生长、碱性磷酸酶活性和胞外蛋白质量浓度、电导率、生物膜形成、鞭毛动力而发挥抑菌作用。

[目的]探讨5种藏药、7味中药对藏猪源沙门氏菌的抑菌效果。[方法]采用煎煮法制备5种藏药(石榴健胃丸、仁青芒觉、十五味黑药丸、仁青常觉、仁青二十五味马宝丸等藏药方剂)、7味中药(石榴皮、诃子、炒白术、黄连、败酱草、红藤、薏苡仁)的水煎剂,再采用打孔法制备藏药及中药药敏片。采用药敏纸片法检测33株西藏藏猪源沙门氏菌对5种藏药、7味中药及6种常用抗菌药物的敏感性,并对黄连、仁青芒觉进行体内抑菌试验。[结果]33株藏猪源沙门氏菌对藏药仁青芒觉普遍表现为敏感(69.70%),对中药黄连普遍表现为敏感(69.70%),对氯霉素(100%)、链霉素(100%)、丁胺卡那(100%)、庆大霉素(100%)等4种常用抗菌药物均表现为敏感。体内抑菌试验表明:灌胃营养肉汤的对照组小鼠大多数死亡,致死率达到95.45%,说明攻毒液对小鼠均具有高致病性;仁青芒觉或中药黄连组小鼠死亡率明显降低,保护率均达90%以上。[结论]仁青芒觉和黄连对藏猪源沙门氏菌具有一定的抑制作用,氯霉素、链霉素、丁胺卡那、庆大霉素对藏猪源沙门氏菌敏感,且抗菌药物对藏猪源沙门氏菌的抑菌效果比仁青芒觉和黄连好,在抗生素耐药性泛滥的形势下,仁青芒觉和黄连是防治沙门氏菌病一个很不错的选择。

应用RT-PCR、PCR和细菌分离等方法,对陕西某规模化养猪场发生的仔猪渐进性消瘦、呼吸困难和母猪繁殖障碍为主要特征的疾病进行了流行病学调查和病原分离鉴定。结果表明,该猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和2型猪圆环病毒(PCV2)感染相当严重,从出现胸肺粘连的病猪实质脏器中可分离到致病性大肠杆菌和沙门氏菌,未分离到胸膜肺炎放线杆菌。该猪场此次疫情主要是由于猪PRRSV、PCV2、大肠杆菌和沙门氏菌四重混合感染而引起。

【背景】解淀粉欧文氏菌（Erwinia amylovora）是仁果类果树火疫病的病原体，对全球苹果和梨的生产构成严重威胁。随着抗生素耐药菌株的出现，火疫病的防治面临巨大的挑战。【目的】分离一种新的裂解解淀粉欧文氏菌的噬菌体，并分析该噬菌体裂解相关基因的功能，为火疫病的防治提供新的选择。【方法】以解淀粉欧文氏菌Ea102为宿主菌，采用双层平板法从流行火疫病的果园土壤中分离噬菌体。通过噬菌斑和透射电镜观察其形态。用PacBio测序技术测定噬菌体基因组，SPAdes组装序列，RAST注释基因组。通过大肠杆菌原核表达系统分析噬菌体Kuerle的裂解机制。【结果】分离纯化出一株裂解解淀粉欧文氏菌的噬菌体，命名为Kuerle。Kuerle由二十面体衣壳的头部和短尾组成，潜伏期约为50 min，裂解量约为240 pfu/cell。噬菌体基因组全长75 599 bp,GC含量48.0%，末端有393 bp的重复序列，未发现与溶原调控相关的基因。共预测到85个开放阅读框（open reading frame,ORF），其中33个已知功能蛋白中包含一个由3 550 aa组成的巨大病毒颗粒相关的RNA聚合酶（virion-associated RNA polymerase,vRNAP），该vRNAP是Schitoviridae科噬菌体的主要特征之一。病毒粒子和基因结构表明噬菌体Kuerle属于有尾噬菌体类的Schitoviridae科病毒。聚集在DNA晚期表达区的3个裂解相关基因holin、endolysin和spanin组成了“裂解盒”。在大肠杆菌中Kuerle-holin的表达会抑制细胞的生长，而Kuerle-endolysin的表达可裂解细胞。二者共表达时Kuerle-holin会加速Kuerle-endolysin引起的细胞裂解。用叠氮化钠抑制细菌的一般分泌系统（Sec）或Kuerle-endolysin N端信号序列的缺失均会导致endolysin裂解功能丧失。上述结果表明噬菌体Kuerle具有pinholin-SAR endolysin裂解系统。Kuerle-holin(pinholin)使细胞质膜去极化以激活分泌的Kuerle-endolysin(SAR endolysin)降解肽聚糖层。【结论】Kuerle是一株烈性噬菌体并且Kuerle-endolysin抑菌效果显著，为后续火疫病生防试剂的制备提供了理论依据和研究材料。

【目的】分离并纯化出一株裂解性青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)噬菌体,并测定其各项生物学特性,为开发新的抗烟草青枯病制剂提供依据。【方法】取烟草青枯病重病田中健康烟株的根际土壤制成土壤悬浮液,并通过在青枯雷尔氏菌菌液中加入过滤后的土壤悬浮液富集噬菌体,用双层平板法验证噬菌体的存在后挑取单个最大噬菌斑进行反复纯化,直到得到单一清晰的噬菌斑。纯化后的单个噬菌斑加入对数早期的青枯雷尔氏菌菌液中进行增殖培养,将增殖液按常规方法进行噬菌体颗粒浓缩后,取20μL浓缩液用磷钨酸染色并通过电子显微镜观察噬菌体的形态特征;同时将浓缩液进行SDS-PAGE电泳,观察蛋白条带大小和数量;...