【背景】假禾谷镰孢（Fusarium pseudograminearum）引起的小麦茎基腐病是我国小麦生产上的新病害。自噬是真核生物中普遍发生的细胞过程，调控多种植物病原真菌的生长发育和侵染，但其在假禾谷镰孢中的作用还不明确。【目的】明确假禾谷镰孢自噬相关基因FpAtg3在该病菌生长和致病中的作用，解析假禾谷镰孢致病机理，为小麦茎基腐病科学防控提供理论依据。【方法】从NCBI数据库中下载主要真菌的Atg3氨基酸序列，利用MEGA5.05构建系统进化树。利用Split-PCR策略构建FpAtg3基因敲除盒，经PEG介导的原生质体转化导入假禾谷镰孢野生型菌株中。利用潮霉素抗性筛选阳性转化子，并经PCR检测获得FpAtg3基因缺失突变体（ΔFpAtg3）。构建pKNTG-FpAtg3重组载体，导入ΔFpAtg3菌株，利用FpAtg3自身启动子启动FpAtg3的转录，以获得FpAtg3缺失突变体的回补菌株。利用假禾谷镰孢营养生长的培养基PDA、CM和MM测定菌丝生长速率和菌落形态；PDA培养基上测定菌丝形态和菌丝融合率；CMC培养液中测定分生孢子的产量及形态；皮氏培养基上测定孢子融合芽管调控的融合率。将假禾谷镰孢的菌丝块接种小麦胚芽鞘和大麦叶片测定病原菌的致病力，采用盆栽试验测定假禾谷镰孢引起的小麦茎基腐病。在PDA培养基中分别加入刚果红、SDS和过氧化氢测定假禾谷镰孢对细胞壁、细胞膜和氧化胁迫的耐受性。【结果】细胞自噬相关蛋白Atg3在真菌中非常保守，且与生物进化的方向一致，假禾谷镰孢FpAtg3与禾谷镰孢和尖镰孢的Atg3同源性最高。获得了FpAtg3基因缺失突变体和回补菌株，表型测定结果显示，与假禾谷镰孢野生型和回补菌株相比，ΔFpAtg3在营养培养基上的菌丝生长明显减慢，气生菌丝减少，菌丝呈波纹状卷曲，分生孢子产量减少，孢子变短，分生孢子分隔减少；野生型和回补菌株菌丝融合发生非常普遍，在相同条件下ΔFpAtg3的菌丝融合率和孢子融合芽管调控的融合率均明显降低；ΔFpAtg3侵染大麦叶片和小麦胚芽鞘造成的病斑较野生型和回补菌株侵染的病斑明显减小，盆栽试验进一步验证ΔFpAtg3的致病力降低；与野生型和回补菌株相比，ΔFpAtg3在刚果红、SDS和过氧化氢胁迫中的耐受性降低。【结论】自噬相关基因FpAtg3参与假禾谷镰孢的菌丝生长、分生孢子产生、菌丝融合、致病力以及对非生物胁迫的耐受性。

Tri12是镰孢菌Fusarium编码单端孢霉烯族毒素(trichothecenes,以下简称“单族毒素”)输出泵的基因,而产毒基因Tri5编码的单端孢霉二烯合酶催化毒素生物合成中的第一步反应。以禾谷镰孢FusariumgraminearumSchw.野生型菌株NRRL29169为亲本,获得Tri12敲除的转化子MT12。与NRRL29169相比,MT12在PDA培养基上生长慢,生长量小(P<0.01),大分生孢子较长。致病力测定结果显示,NRRL29169致病力最强,所致病害可以自接种点向上下扩展至其他小穗,而MT12的致病力极弱。我们由此推测,Tri12的敲除导致病菌产生的毒素不能被泵出体...

【背景】禾谷镰孢（Fusarium graminearum）是引起小麦赤霉病（Fusarium head blight）的主要病原真菌，侵染后导致作物品质和产量下降，同时产生多种真菌毒素，严重危害粮食生产和人类健康。氧酰基载体蛋白还原酶（3-oxoacyl ACP reductase,OAR1）催化羧酰基载体蛋白还原成氧酰基载体蛋白，在脂肪酸的生物合成过程中具有重要作用。【目的】构建FgOAR1基因缺失突变体，研究其表型、显微结构、孢子产量、有性生殖和致病力等的变化，探究FgOAR1的生物学功能，揭示其对禾谷镰孢生长、发育和致病的影响，为新型抑菌作用靶点的筛选及小麦赤霉病的防控提供科学依据。【方法】以禾谷镰孢野生型菌株PH-1为材料，应用Split-Marker基因敲除技术，构建FgOAR1基因缺失突变体（ΔFgOAR1),Gap-repair技术获得缺失基因的回补突变体（ΔFgOAR1-C）；将PH-1、ΔFgOAR1和ΔFgOAR1-C菌株分别接种到常规培养基，观察菌落表型变化并测定脂肪酸含量差异；接种到含刚果红（Congo-Red）、SDS、NaCl和H_2O_2的压力筛选培养基中，观察菌丝在压力培养条件下的生长状况；接种CMC培养基，比较分生孢子产量差异；接种胡萝卜培养基，观察有性生殖及孢子性状；分别进行小麦胚芽鞘和穗部接种，统计发病率和毒素产量，比较突变体与野生型菌株的致病力差异。【结果】与野生型PH-1菌株相比，在PDA、YEG和CM培养基中ΔFgOAR1突变体未呈现明显表型变化，在0.7 mol·L~(-1) NaCl、0.03%H_2O_2、0.01%SDS和300μg·m L~(-1)Congo-Red等压力培养条件下，突变体菌落直径显著低于野生型PH-1，表明FgOAR1与禾谷镰孢细胞膜和细胞壁的合成相关；ΔFgOAR1突变体在液体培养基中的分生孢子产量（8.1×10~5个/mL）显著低于PH-1(1.26×10~6个/mL），接种小麦胚芽鞘和麦穗后，ΔFgOAR1突变体的致病力显著低于野生型菌株PH-1。【结论】禾谷镰孢中FgOAR1参与脂肪酸的生物合成，对细胞膜合成具有重要作用，该基因缺失导致突变体抗逆性降低，分生孢子产量下降，且致病力显著降低，FgOAR1对禾谷镰孢的生长、发育和致病具有重要作用。

小麦穗期接种禾谷镰孢FusariumgraminearumSchw . [有性态 :Gibberellazeae (Schw .)Petch]的 2个野生型菌株和12个产毒潜能不同的转化体菌株 ,发病盛期 (接种后 2 0d)调查病小穗率 ,并测定组织中脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (DON)、15 乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (15 ADON)和 3 乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (3 ADON)等单端孢霉烯族毒素 (以下简称“单族毒素”)的含量。结果显示 ,菌株间致病力存在显著差异。强致病力的GZ36 39、C11 1和B4 1等菌株在病穗 (显症 )组织和穗颈组织中DON产量高 ,分别达 2 9～ 3...

【目的】鉴定和克隆假禾谷镰孢（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）细胞凋亡相关基因ＦｐＴａＴｄ，分析ＦｐＴａＴｄ在假禾谷镰孢菌丝、分生孢子和侵染不同时期的表达，为探索细胞凋亡在假禾谷镰孢侵染过程中的功能提供理论依据。【方法】从ｇｅｎ Ｂａｎｋ获得模式物种已知的ＴａＴｄ氨基酸序列，利用ＢＬａｓＴｐ的方法在镰孢中鉴定ＴａＴｄ同源蛋白，并构建进化树；分别以假禾谷镰孢的基因组ｄｎａ和ｃｄｎａ为模板，通过ｐｃｒ方法克隆假禾谷镰孢ＦｐＴａＴｄ的基因序列和开放阅读框（ｏｒＦ）序列；利用实时荧光定量ｐｃｒ方法分析ＦｐＴａＴｄ在假禾谷镰孢生长、产孢及侵染不同时期的表达；利用转录组测序方法分析Ｆ．．．

【目的】假禾谷镰孢(Fusarium pseudograminearum)侵染小麦引起的小麦茎基腐病严重影响中国小麦的安全生产。查找假禾谷镰孢中的APSES转录因子,分析其在病原菌致病过程中的作用,为解析假禾谷镰孢的致病机制及小麦茎基腐病的防治提供理论依据。【方法】从GenBank获得物种中已知的APSES氨基酸序列,利用BLASTP方法在假禾谷镰孢中查找APSES同源蛋白,利用Pfam软件预测蛋白结构域,采用MEGA5.05构建APSES蛋白的系统进化树。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法分析A组APSES转录因子基因FpAPSES1和FpAPSES4在假禾谷镰孢侵染过程中的表达。通过PEG介导的原生质体转化和PCR筛选FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失的突变体菌株。在PDA培养基上测定假禾谷镰孢野生型菌株Wz2-8A、Δfpapses1和Δfpapses4突变体菌株的菌丝形态和生长速率;测定在CMC培养液中培养后的分生孢子产生情况、形态以及在无菌水中的萌发率;利用菌丝块和分生孢子接种小麦胚芽鞘和大麦叶片以及盆栽试验测定其致病性;采用ELISA方法测定小米培养基中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的含量。【结果】假禾谷镰孢中有4个APSES同源蛋白,均含有保守的DNA结合结构域HTH。与其他物种的APSES蛋白构建系统进化树,发现FpAPSES1、FpAPSES2和FpAPSES4属于A组APSES,FpAPSES3分布在C组。FpAPSES1和FpAPSES4在侵染阶段诱导表达,推测可能参与假禾谷镰孢的致病。分别获得2个FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失的突变体菌株Δfpapses1-T10、Δfpapses1-T27和Δfpapses4-T1、Δfpapses4-T2。表型测定结果显示,与野生型相比,FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失突变体在PDA平板上的生长速率明显减慢、色素积累明显增多;FpAPSES1基因缺失突变体菌丝形态无差异,而FpAPSES4基因缺失突变体菌丝弯曲、分支明显增多;FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失突变体在CMC液体中的分生孢子产生明显减少,分别比野生型下降了99.5%和97.4%,产生的分生孢子变短、隔膜减少、萌发率有所降低;与野生型相比,FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失突变体菌丝体和分生孢子对小麦胚芽鞘的致病力明显降低,菌丝在小麦胚芽鞘表皮细胞中的扩展明显受阻;FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失突变体对大麦叶片和小麦根部的致病力也明显降低;FpAPSES1和FpAPSES4基因缺失突变体在小米培养基中产生的DON毒素分别比野生型下降了约78%和44%。【结论】编码A组APSES同源蛋白的FpAPSES1和FpAPSES4对假禾谷镰孢的菌丝生长、分生孢子产生和致病力均具有重要作用。

【目的】明确中国不同地区豌豆镰孢根腐病菌的种类及其致病基因多样性,为病害防治及抗病育种提供依据。【方法】通过形态学观察、致病性测定和特异性分子标记检测对病原菌分离物进行鉴定,通过茄镰孢豌豆专化型(Fusarium solani f.sp.pisi)致病基因特异性PCR引物对病原菌分离物致病基因进行检测。【结果】96个病原菌分离物鉴定为茄镰孢豌豆专化型。致病性测定表明所有分离物对豌豆品种"草原27"致病,其中81.3%的分离物致病力强,10.4%的分离物致病力中等,只有8.3%的分离物具弱致病力。用4个致病基因PDA、PEP1、PEP3和PEP5特异性引物对分离物基因组DNA进行PCR扩增,在9...

选择来自我国12省市有代表性的101株禾谷镰刀菌菌株,比较它们在PDA培养基上的表型性状以及在CMS液中的产孢量;并于田间小麦开花期,用单花剪滴法接种3个抗赤霉病性不同的小麦品种,鉴定其致病力,用SAS软件进行统计分析。结果表明,菌落扩展速度不同的菌株间,其致病力差异显著;相关分析证实, 菌落扩展速度与致病力之间呈极显著线性正相关(P=0.000 3),菌丝生长状况与致病力之间呈极显著非线性相关(P=0.008 3),而基质颜色和产孢量与致病力没有相关性。这些结果说明,禾谷镰刀菌菌落的扩展速度及菌丝生长状况与致病力之间具有共同的遗传基础或遗传相关性。

【目的】Abp1作为肌动蛋白结合蛋白家族成员之一,在各种真核生物肌动蛋白骨架形成过程中具有核心作用。本研究旨在分析禾谷镰孢(Fusarium graminearum)中肌动蛋白结合蛋白FgAbp1在生长发育、对新型杀菌剂氰烯菌酯敏感性以及毒素体形成等生物学过程中的功能。【方法】利用融合PCR和酵母空隙修复技术分别构建FgAbp1基因敲除打靶片段和融合荧光蛋白载体,再通过聚乙二醇介导的原生质体转化的方法获取基因缺失突变体ΔFgAbp1和荧光标记菌株。观察比较野生型PH-1、突变体ΔFgAbp1和回补体ΔFgAbp1-C的菌丝生长、有性生殖以及无性繁殖,并测定基因敲除突变体ΔFgAbp1对杀菌剂氰烯菌酯的敏感性。通过融合绿色荧光蛋白,明确FgAbp1在菌丝中的分布情况;利用透射电子显微镜观察分析FgAbp1对细胞中液泡/囊泡形态的影响。在非产毒环境和诱导产毒条件下,通过双荧光共定位分析FgAbp1在禾谷镰孢毒素体形成过程中的作用。【结果】禾谷镰孢中,FgAbp1主要呈颗粒状定位于近细胞膜处。在MM培养基中,基因敲除突变体ΔFgAbp1的生长速率与野生型相比降低了15%,但在营养丰富的CM中ΔFgAbp1的生长速率却减慢了38%。突变体ΔFgAbp1在无性繁殖以及有性生殖过程中相较野生型没有明显缺陷。然而在0.5μg·mL~(-1)氰烯菌酯的作用下,ΔFgAbp1的菌丝生长完全受到抑制,并且分生孢子萌发率显著下降。此外,敲除基因FgAbp1导致细胞中液泡不能正常形成且囊泡增多。在非产毒条件下,FgAbp1与DON毒素合成关键酶Tri1共定位于囊泡中;在诱导产毒条件下,FgAbp1与Tri1则共定位于毒素体中。此外,敲除基因FgAbp1会导致毒素体不能正常形成。【结论】肌动蛋白结合蛋白FgAbp1在禾谷镰孢营养生长、发育、氰烯菌酯敏感性以及毒素体形成过程中发挥着重要作用。

为了解苜蓿镰孢菌根腐病病原的致病性差异和致病机制,本研究对分离自河北省黄骅市和张家口市宣化区部分苜蓿种植地苜蓿根腐病样品的150株镰孢菌(Fusariumspp.)(2015年分离获得72株,2016年分离获得78株),采用平皿法进行了致病性测定,利用分子生物学技术对所分离获得的镰孢菌菌株是否具有产脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和雪腐镰刀菌烯醇(NIV)毒素的潜力进行了检测,并对获得的粗毒素进行了生物活性测定。结果表明:分离获得的镰孢菌对萌发的苜蓿种子均具有致病性,但致病性强弱存在差别,除三线镰孢(F.tricinctum)和大部分木贼镰孢(F.equiseti)菌株致病性较弱外,大多数镰孢菌菌株表现出较强致病性;在所获得镰孢菌菌株中,菌株KD3(F.oxysporum)、菌株QD3-2(F.oxysporum)、菌株N6-1(F.equiseti)、菌株N9-2(F.acuminatum)、菌株NT1-1(F.acuminatum)和菌株QD10-1(F.acuminatum)共6株镰孢菌具有产NIV毒素潜力,未发现具有产DON毒素潜力的菌株;将NIV毒素化学型菌株QD3-2发酵培养后经有机溶剂萃取获得粗毒素,对其进行的生物活性测定结果表明,粗毒素对苜蓿种子的萌发具有较强抑制作用。本研究结果为探讨苜蓿镰孢菌根腐病致病机理、有效防治苜蓿根腐病和保障苜蓿安全生产提供了一定基础。

【目的】运用ＩＳＳＲ－ＰＣＲ技术揭示中国河南和河北省冬小麦区６个地理群体小麦茎基腐病优势病原菌假禾谷镰孢（ＦｕＳａＲＩｕｍ ＰＳｅｕｄｏｇＲａｍＩｎｅａＲｕｍ）的遗传多样性。【方法】利用筛选的１７个ＩＳＳＲ引物对从河南和河北冬小麦区收集的１６６株假禾谷镰孢菌株进行扩增。根据群体扩增的结果，用ＰｏＰｇｅｎｅ ｖｅＲＳＩｏｎ ｌ．３２软件计算各项遗传多样性参数。根据不同地理群体的遗传相似系数，用ｎＴＳＹＳＰＣ ｖｅＲＳＩｏｎ ２．１１软件进行群体聚类分析。【结果】从９７个ＩＳＳＲ引物中筛选出了１７个多态性较好的引物，用这１７个引物对河南和河北冬小麦区的１６６株假禾谷镰孢菌株进行扩增，共扩增出２３４．．．

根据禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)测序菌株NRRL31084(PH-1)的微管相关蛋白基因(map)核苷酸序列设计4对引物,采用PCR方法测定了禾谷镰孢菌对多菌灵(MBC)不同敏感性表型的6个中国菌株的map全序列。DNA序列比对表明,中国的3个敏感菌株和3个抗药菌株的map核苷酸序列相似性没有差异,表明多菌灵抗药性与微管相关蛋白无关。该基因全长1 793 bp,含有6个内含子,编码199个氨基酸;与NRRL31084的map核苷酸序列相似性为99.39%,存在10个差异核苷酸,与其所编码的氨基酸序列相似性为100%。

【目的】黄瓜枯萎病是黄瓜生产中的重要病害,其病原菌为尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporumf.sp.cucumerinum)。研究旨在明确尖孢镰刀菌黄瓜专化型编码磷脂酶C(phospholipase C,PLC)的FoPLC4在调控分生孢子形成和致病性等方面的功能。【方法】采用生物信息学方法,确定FoPLC4在染色体上的位置,分析FoPLC4结构。基于尖孢镰刀菌番茄专化型基因组数据库,采用特异性引物克隆黄瓜枯萎病菌FoPLC4。根据同源重组原理构建携带潮霉素磷酸转移酶(hygromycin phosphotransferase,HPH)基因的敲除载体,利用PEG(polye...

【目的】明确灰葡萄孢BcKMO在病菌生长、发育和致病过程中的功能,为阐明该基因调控灰葡萄孢生长、发育和致病的分子机理奠定基础,并为灰霉病的防治提供理论依据。【方法】利用生物信息学方法,对BcKMO及其编码产物进行分析。扩增BcKMO的编码区,与pBARKS1-eGFP载体连接,构建基因的表达载体pBARKS1-BcKMO-eGFP;利用PEG介导的原生质体转化方法,转化BcKMO的T-DNA插入突变体BCG183的原生质体;利用PCR、Southern blotting和real-time PCR技术,对所获得转化子进行鉴定;对野生型菌株BC22、突变体BCG183和回复突变体BCG183/B...

采用电钻打孔法接种禾谷镰孢菌,测定22个玉米新杂交组合对禾谷镰孢菌茎基腐病的抗性。结果表明:玉米新组合中,有6个表现为抗性1级,15个表现为抗性2级,1个表现为感病;玉米杂交组合接种禾谷镰孢菌后,大部分组合的穗重、粒重下降,部分组合秃尖长度增大,行粒数减少,对出籽率、穗长、穗行数的影响较小;2个玉米组合的抗病补偿能力较强,其中2×372组合未接种的穗重和粒重分别为186.8g和165.5g,接种后穗重和粒重减少8.7 g和8 g,15H037×1090组合2次接种的穗重、粒重平均值分别达172.9 g和153.7g,比未接种的穗重和粒重增加12.3 g和9.3 g,2个玉米组合的产量超过对照郑单958,具有较高的应用潜力。