【目的】盐害作为一类非生物胁迫严重危害了农作物的生存以及产量。Remorin作为一类植物特有的蛋白质在植物适应环境过程中具有重要功能。本研究克隆了胡杨remorin蛋白PeREM1. 3的编码基因PeREM1. 3,并研究PeREM1. 3基因在植物耐盐性中的作用。【方法】笔者将基因构件35S::PeREM1. 3转入模式植物烟草中,在盐胁迫条件下,通过生理生化的方法对表达PeREM1. 3的转基因烟草进行基因功能的分析。【结果】研究显示PeREM1. 3蛋白定位于细胞质膜上,其编码基因PeREM1. 3的开放阅读框(ORF)长600 bp,编码199个氨基酸。胡杨中PeREM1. 3能够响应盐胁迫和渗透胁迫表达上调。结果表明,在烟草中过表达PeREM1. 3明显地提高了耐盐性。过表达PeREM1. 3的烟草转基因株系中抗氧化物酶如SOD、POD和CAT活性显著提高,降低了活性氧水平,调控活性氧平衡。另外植物抗逆相关基因SOS1、HAK、NHA1、VAG1和PMA4的转录水平显著增高,调控K~+/Na~+平衡。【结论】这些结果说明PeREM1. 3蛋白通过维持植物的活性氧平衡和K~+/Na~+平衡来提高植物的耐盐性。

【目的】为明确马铃薯蔗糖转运蛋白(SUT2)对盐胁迫的响应,本研究对StSUT2的功能进行初探。【方法】通过同源克隆技术得到马铃薯StSUT2基因并进行生物信息学分析,使用荧光定量PCR技术检测马铃薯青薯9号不同器官中SUT2基因在盐胁迫下表达量的变化,随即构建表达载体并遗传转化烟草,测定转基因烟草在盐胁迫下脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量的变化。【结果】①马铃薯StSUT2基因CDS长度为1818 bp,编码605个氨基酸;系统进化树分析表明,马铃薯StSUT2与番茄亲缘关系最近。②马铃薯StSUT2基因可被盐胁迫诱导,其中根、茎中的表达量在胁迫8 h最大,而叶中的表达量在4 h最大。③构建表达载体pJAM1502-StSUT2并转化烟草,经PCR和qRT-PCR鉴定,获得6株转基因植株,并选取表达量最高者进行后续实验。④盐胁迫下测定野生型与过表达植株中脯氨酸、可溶性蛋白以及可溶性糖含量发现,过表达植株中脯氨酸、可溶性蛋白以及可溶性糖含量均高于野生型。【结论】StSUT2可能会通过提高渗透性物质含量来增强植物的耐盐性。

【目的】盐胁迫是影响植物生长发育的不利环境因子。蛋白激酶PKS5作为植物盐超敏感信号转导途径的重要组分，在植物响应盐胁迫过程中具有重要调节功能。本文旨在生理水平和分子水平上，探究胡杨PePKS5基因在植物耐受盐胁迫过程中的调节作用。【方法】克隆胡杨PePKS5基因，并在拟南芥中过表达，获得T_3代转基因拟南芥纯合体。观察盐胁迫下转基因拟南芥株系的耐盐表型，测定其过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶活性及盐胁迫响应基因的表达量。利用非损伤微测技术测定转基因拟南芥株系根尖Na~+、K~+动态离子流，利用激光共聚焦显微镜观测转基因拟南芥株系根尖Na~+和H_2O_2含量。测定盐处理后转基因拟南芥土培幼苗的叶绿素荧光参数、光合参数等生理指标，揭示PePKS5基因在盐胁迫下对拟南芥的生理调节作用。构建亚细胞定位载体，通过瞬时转化烟草，对PePKS5蛋白进行亚细胞定位观测。【结果】（1）PePKS5基因的CDS序列编码417个氨基酸，PePKS5氨基酸序列与毛白杨PtPKS5相似度最高，并且亲缘关系最近。（2）PePKS5定位于细胞质和细胞核中。（3）NaCl处理6 h后，胡杨叶片PePKS5基因表达量上调，72 h后逐渐恢复至正常水平。（4）盐胁迫下过表达PePKS5基因的拟南芥株系（PePKS5-OE10和PePKS5-OE15）的生存率和根长均明显高于野生型（WT）和转空载体（VC）株系。（5）与WT和VC株系相比，PePKS5-OE10和PePKS5-OE15株系的POD和CAT活性增强，APX1和CAT2基因的表达量均升高。（6）盐胁迫下PePKS5-OE10和PePKS5-OE15株系的Na~+外排和K~+的内流明显高于WT和VC株系，并且在根尖中积累的Na~+浓度和H_2O_2浓度明显低于WT和VC株系。（7）盐胁迫下PePKS5-OE10和PePKS5-OE15株系的叶绿素相对含量、PSⅡ最大光量子效率、实际光合量子产量和相对电子传递速率均高于WT和VC株系。（8）盐胁迫下PePKS5-OE10和PePKS5-OE15的净光合速率高于WT和VC株系，而胞间CO_2浓度、气孔导度和蒸腾速率均低于WT和VC株系。【结论】过表达胡杨PePKS5基因能够增强拟南芥对Na~+的外排能力，维持植物活性氧的平衡状态，以及保持相对稳定的光合作用能力，从而提高拟南芥的耐盐能力。

【目的】SAP(stress-associated protein)是一类涉及胁迫应答和调控的锌指蛋白。克隆并分析其对逆境胁迫应答的反应,为棉花抗逆育种提供候选基因。【方法】通过电子克隆方法并经RT-PCR验证获得棉花锌指蛋白基因GhSAP1,将带有目的基因的载体质粒通过PEG介导转化棉花叶肉原生质体细胞,瞬时表达分析其编码蛋白的特性及亚细胞定位信息。通过qRT-PCR技术分析目标基因的组织表达特征及非生物胁迫条件下的表达特性。通过农杆菌介导叶盘转化法,经组织培养获得转基因烟草进行异位表达,检测其与抗逆相关的生理指标,证明其提高植物抗逆能力。【结果】GhSAP1 ORF长度为543 bp,编码...

【目的】NAC转录因子是一类具有多种生物功能的新型转录因子,在植物抗逆响应中发挥着重要作用。本文旨在克隆并研究细叶百合LpNAC6基因在逆境胁迫下的表达模式,探究其在烟草中响应盐胁迫的功能。【方法】本研究采用同源克隆技术克隆得到细叶百合LpNAC6基因,利用生物信息学软件对LpNAC6基因进行分析;通过基因枪法对LpNAC6蛋白进行亚细胞定位;利用实时荧光定量PCR的方法分析LpNAC6基因在不同非生物胁迫和不同组织中的表达模式;构建植物表达载体pBI121-LpNAC6-GFP转化烟草,通过对转基因烟草进行盐胁迫处理验证LpNAC6基因的功能。【结果】LpNAC6基因长909 bp,编码302个氨基酸,存在一个高度保守的NAM结构域,属于NAC基因家族。LpNAC6为不稳定亲水性蛋白,无信号肽和跨膜结构域,有5个糖基化位点和20个磷酸化位点,亚细胞定位在细胞核。LpNAC6基因与黄褐棉的NAC转录因子进化关系最近。细叶百合中LpNAC6基因对ABA、干旱、低温及盐胁迫均有响应。盐胁迫下,过表达LpNAC6基因的转基因烟草其SOD、POD、CAT的活性和叶绿素、脯氨酸、可溶性蛋白的含量均显著高于野生型。【结论】细叶百合LpNAC6基因能够响应ABA、干旱、低温、盐胁迫等非生物胁迫,其过表达能够提高转基因烟草在盐胁迫下的代谢活力和抗氧化酶活性,从而增强烟草耐盐性。

【目的】IrrE是从耐辐射异常球菌中发现的全局调控蛋白,主要通过修复强辐射等逆境条件下DNA损伤,提高耐辐射异常球菌对极端逆境环境的抗性。研究按植物密码子优化的irrE后导入烟草对转基因烟草耐逆能力的提高,为棉花等作物耐逆育种研究打下基础。【方法】按照植物密码子优化细菌irrE并合成基因;通过酶切连接法构建irrE植物表达载体;通过叶盘法转化烟草并PCR验证获得阳性转基因再生苗;通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析转基因株系中irrE的表达量;通过蛋白免疫印迹法(Western blot)检测I

【目的】冷激蛋白（CSPs）是普遍存在于原核和真核生物中的一类蛋白，能够参与冷、干旱和盐等非生物胁迫。在胡杨中，冷激蛋白的抗逆功能还少有研究。本文旨在通过研究胡杨PeCSP1在植物耐盐性中的作用，进一步揭示植物耐盐的生理与分子机制。【方法】参照NCBI数据库信息，使用primer5设计引物，利用Mega7软件进行多重序列比对及进化树分析，利用荧光定量PCR检测基因表达量。以转基因株系PeCSP1(OE1、OE2)，野生型，转空载体为材料，对各基因型拟南芥进行不同盐浓度处理，从生理生化及分子生物学角度研究胡杨PeCSP1在盐胁迫中的响应机制。【结果】胡杨PeCSP1与毛果杨PtCSP1蛋白序列相似度高，亲缘关系较近。在短期盐胁迫下，胡杨叶片PeCSP1基因下调表达。在NaCl(75、100、125 mmol/L)处理后，过表达PeCSP1拟南芥植株种子萌发率和根长的下降幅度高于野生型（WT）和转空载体（VC），而且转基因拟南芥根细胞中Na~+含量显著高于WT和VC。盐胁迫下，WT和VC抗氧化酶（SOD、POD、CAT）的活性显著上升，酶活提高的幅度明显高于OE1、OE2。在土培条件下，盐处理12 d后，转基因株系的最大光量子效率未有明显下降，但相对电子传递效率、实际光合量子产量和叶绿素含量受到的抑制作用高于WT和VC。【结论】过表达胡杨PeCSP1负调控拟南芥耐盐性。

为探索白三叶(Trifolium repens)查尔酮合成酶基因对类黄酮含量的影响,根据NCBI上提供的TrCHS基因(Genbank:2247906)序列,采用RT-PCR方法克隆获得白三叶查尔酮合成酶(chalcone synthase, CHS)基因全长c DNA片段,命名为TrCHS;成功构建含有TrCHS的植物表达载体,在烟草(Nicotiana)中进行遗传转化,经抗性筛选与分子检测,获得了转基因烟草株系,并对其类黄酮含量进行了测定。结果表明,与野生型相比,转基因烟草植株TrCHS表达量和类黄酮含量均显著提高(P <0.05),表明过表达TrCHS可提高烟草类黄酮的含量,这为后续解析TrCHS功能以及白三叶新品种选育提供了可靠的理论依据。

为了研究二穗短柄草BdDREB1-like基因在转基因烟草中的功能,克隆了该基因,并进行了生物信息学分析。该基因开放阅读框684 bp,编码228个氨基酸,编码蛋白的分子量为24.178 ku,只含有一个典型的AP2结构域,属于AP2/EREBP(APETALA2/ethylene-responsive element binding protein)超家族的DREB家族。多序列比对与进化分析显示它与黑麦ScCBFI的亲缘关系较近。亚细胞定位分析表明,BdDREB1-like基因定位于细胞核。将其构建到植物表达载体上,并通过农杆菌介导法转入烟草中。PCR和RT-PCR筛选鉴定显示BdDREB1-like基因不仅整合到烟草基因组中而且还能稳定表达。过氧化氢胁迫条件下,转BdDREB1-like基因烟草幼苗具有较高的发芽率。为了进一步确定BdDREB1-like基因与氧化胁迫的关系,又对一个月大的转基因烟草进行氧化胁迫(MV,甲基紫精)处理。结果表明,在正常生长条件下,T3转基因株系除了SOD含量外,测定的其他各种生理指标均与野生型无显著差异,T1转基因株系中只有POD和叶绿素含量与野生型中的有显著差异;而在氧化胁迫处理条件下,转BdDREB1-like基因的烟草植株相对于野生型具有较高的过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶和叶绿素的含量和较低的丙二醛和过氧化氢含量。这些结果表明,过表达BdDREB1-like基因增强了植物对氧化胁迫的耐受性。

以过表达和抑制表达2–Cys Prx基因烟草(龙江911)为材料,测定和分析其生长特性和光化学活性。结果表明:过表达2–Cys Prx基因烟草的株高、根长、生物量显著高于非转基因烟草和抑制表达2–Cys Prx基因烟草;抑制表达2–Cys Prx基因烟草的PSⅡ反应中心电子传递速率(ETR)显著低于过表达2–Cys Prx基因烟草,过表达2–Cys Prx基因烟草的荧光曲线与Fm所围成的面积(Area)、2 ms时有活性反应中心的开放程度(Ψo)、吸收光能用于QA–以后电子传递的量子产额(φEo)、单位反应中心吸收光能用于电子传递的能量(ETo/RC)高于非转基因烟草,非光化学猝灭的最大量子产...

【目的】高盐胁迫是影响作物产量的主要因素之一,谷子(Setaria italica L.)具有耐逆性强的特点,从谷子中筛选耐盐基因对于利用基因工程的手段培育耐盐作物新品种具有重要意义。【方法】分析谷子AP2/ERF类转录因子类基因SiANT1在豫谷一号幼苗期在高盐、低氮、PEG模拟干旱处理条件下的表达模式;进而利用农杆菌转化法将SiANT1转入模式作物水稻品种Kitaake;分别用0.9%盐水和自来水浸泡过表达SiANT1水稻和野生型Kitaake的种子,观察其萌芽期的表型并统计发芽率;用含0.9%Na Cl的Hogland营养液室内处理水稻幼苗10 d,65℃烘48 h之后称量干重;同时将其种植在大田,在水稻孕穗前用0.9%盐水灌溉一次,统计成熟后过表达SiANT1水稻各株系和野生型的单株籽粒重、株高、单株分蘖数,对其耐盐性进行评价;利用定量Real time-PCR方法,验证分析转基因水稻株系中SiANT1及其可能的下游基因的相对表达情况。【结果】谷子SiANT1蛋白(XP004985124.1,SiANT1)属于AP2亚族,与高粱(XP021318293.1,Sb ANT1)和玉米(XP008658933.1,Zm AP2)亲缘关系较近;豫谷一号中SiANT1的表达受高盐胁迫(100 mmol·L-1 Na Cl)诱导;将SiANT1和LP0471118-Bar-ubi-EDLL载体连接,利用农杆菌转化法将SiANT1转入到水稻基因组中,筛选得阳性T0植株,繁殖两代得T3代种子;自来水浸泡下,过表达SiANT1水稻种子萌发率和野生型相差不大,萌芽率为90%以上;0.9%盐水浸泡下,过表达SiANT1水稻种子萌发明显受到抑制,与野生型相比,过表达SiANT1水稻种子露白推迟,但最终(处理120 h)萌芽率达到80%以上;室内水稻苗期用0.9%Na Cl处理后,过表达SiANT1水稻的单株干重较受体Kitaake增重14.11%—37.42%,在1%水平上呈显著差异;大田水稻成熟后过表达SiANT1株系单株籽粒重较受体Kitaake增产56.12%—76.58%,在5%水平上呈显著差异,单株分蘖数增多、株高增加,但与野生型无显著差异;半定量RT-PCR分析表明,过表达SiANT1的3个水稻株系都在RNA水平上表达SiANT1;定量Real time-PCR结果表明,过表达SiANT1的3个水稻株系间SiANT1的相对表达量有所差异,但较受体而言,都极显著增加,并且其内源耐盐相关基因Os SOS1和Os ZFP182的相对表达量分别较受体提高1.1—1.7倍和1.6—2.3倍。【结论】Os SOS1和Os ZFP182是耐盐相关基因已被证实,SiANT1具有一定的耐盐性,过表达SiANT1水稻可能是通过增加下游基因Os SOS1和Os ZFP182的表达从而提高耐盐性。

为进一步研究ＪｓＷＲＫＹ１的生物学功能，构建ＪｓＷＲＫＹ１的植物超表达载体并转入烟草中过表达。再生的ＪｓＷＲＫＹ１转基因烟草与野生型烟草在表型上无明显差异。ＪｓＷＲＫＹ１过表达上调了转基因烟草体内几个防卫相关基因ＭｎｓＯＤ、Ｃｕ／Ｚｎ ｓＯＤ、Ｃｎ、ｎＡＤＰＨ ＯｘｉＤＡｓｅ和ＰＲ１的转录水平。与野生型烟草相比，ＪｓＷＲＫＹ１转基因烟草体内的超氧化物歧化酶、过氧化物酶和抗坏血酸过氧化物酶活性在正常生长以及胶孢炭疽菌接种后均显著增强。平板抑菌试验结果显示，ＪｓＷＲＫＹ１转基因烟草叶片总蛋白对病原真菌葡萄座腔菌、串珠状赤霉菌、胶孢炭疽菌和尖孢镰刀菌的菌丝生长具有不同程度的抑制作用。此外，用胶孢炭疽．．．

【目的】土壤盐渍化是制约农林资源生产力的主要因素之一。为适应环境，植物会通过启动基因表达及生理和形态结构的变化来减缓盐害。越来越多的研究表明，C2H2型锌指蛋白在植物应答盐胁迫调控网络中扮演重要角色。迄今，关于植物C2H2锌指蛋白生物学功能的研究集中于植物特有的Q型，而对于非Q型C2H2锌指蛋白的认识非常有限。前人从毛果杨中鉴定到109个C2H2锌指蛋白的编码基因PtrZFPs,其中62个编码的蛋白为非Q型锌指蛋白。鉴定、解析耐盐相关C2H2锌指蛋白基因的功能将为深入理解植物应对非生物胁迫的分子机制提供重要资料。通过分析过表达PdbZFP26转基因山新杨的表型以鉴定其功能，本文以期为山新杨抗盐遗传改良提供优良资源及理论基础。【方法】本研究利用实时定量PCR方法分析PdbZFP26的组织器官表达模式及对非生物胁迫和植物激素的响应模式；利用叶盘转化法获得过表达PdbZFP26转基因山新杨，观察转基因和对照株系在盐胁迫处理前后的长势，测定其抗逆生理指标，比较不同株系对盐胁迫的耐受能力。【结果】基于前期表达谱数据分析，从山新杨茎中筛选到一个受盐胁迫诱导表达的C2H2锌指蛋白基因PdbZFP26,该基因编码区为2 061 bp,共编码686个氨基酸。PdbZFP26仅含有一个C2H2锌指结构域，且该结构域中不具备Q型特征基序“QALGGH”。进化树分析显示，PdbZFP26为C型C2H2型锌指蛋白。表达模式分析结果显示，PdbZFP26在茎中特异表达，主要集中在木质部(包含维管形成层);除盐胁迫之外，ABA和BRs会引起PdbZFP26不同程度的上调，其中ABA胁迫诱导的上调幅度最为显著。转基因山新杨表型分析结果显示，盐胁迫条件下，过表达PdbZFP26转基因山新杨的生长明显优于对照，转基因株系的叶绿素含量显著高于对照，MDA和H_2O_2含量明显低于对照，而SOD、POD、CAT等抗氧化酶活性高于对照。【结论】过表达PdbZFP26可通过增加抗氧化物酶活性来降低过氧化物质的积累，从而提高转基因山新杨对盐胁迫的耐受性。

为揭示２－Ｃｙｓ Ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎｓ（２－Ｃｙｓ Ｐｒｘ）基因在烟草龙江９１１抗逆中的功能，以过表达２－Ｃｙｓ Ｐｒｘ基因烟草、抑制表达２－Ｃｙｓ Ｐｒｘ基因烟草和非转基因烟草幼苗为试材，研究了不同ＰＨ值的模拟酸雨对其生长指标、叶片生理生化特性和叶片光合生理的影响。结果表明：与对照相比，ＰＨ值４．０的模拟酸雨对３种基因型烟草的株高、叶面积、比叶重无明显影响，ＰＨ值２．５的模拟酸雨处理下，与对照相比，过表达２－Ｃｙｓ Ｐｒｘ基因烟草幼苗的株高无明显变化，抑制表达２－Ｃｙｓ Ｐｒｘ基因烟草和非转基因烟草幼苗的株高显著降低；随着模拟酸雨ＰＨ值降低，３种基因型烟草叶片的硝酸还原酶（ｎｒ）活性．．．