【目的】冷激蛋白（CSPs）是普遍存在于原核和真核生物中的一类蛋白，能够参与冷、干旱和盐等非生物胁迫。在胡杨中，冷激蛋白的抗逆功能还少有研究。本文旨在通过研究胡杨PeCSP1在植物耐盐性中的作用，进一步揭示植物耐盐的生理与分子机制。【方法】参照NCBI数据库信息，使用primer5设计引物，利用Mega7软件进行多重序列比对及进化树分析，利用荧光定量PCR检测基因表达量。以转基因株系PeCSP1(OE1、OE2)，野生型，转空载体为材料，对各基因型拟南芥进行不同盐浓度处理，从生理生化及分子生物学角度研究胡杨PeCSP1在盐胁迫中的响应机制。【结果】胡杨PeCSP1与毛果杨PtCSP1蛋白序列相似度高，亲缘关系较近。在短期盐胁迫下，胡杨叶片PeCSP1基因下调表达。在NaCl(75、100、125 mmol/L)处理后，过表达PeCSP1拟南芥植株种子萌发率和根长的下降幅度高于野生型（WT）和转空载体（VC），而且转基因拟南芥根细胞中Na~+含量显著高于WT和VC。盐胁迫下，WT和VC抗氧化酶（SOD、POD、CAT）的活性显著上升，酶活提高的幅度明显高于OE1、OE2。在土培条件下，盐处理12 d后，转基因株系的最大光量子效率未有明显下降，但相对电子传递效率、实际光合量子产量和叶绿素含量受到的抑制作用高于WT和VC。【结论】过表达胡杨PeCSP1负调控拟南芥耐盐性。

【目的】Annexins是原核生物和真核生物中普遍存在的一大类膜联蛋白家族,能够参与氧化胁迫、热胁迫、干旱胁迫和盐胁迫等许多胁迫响应过程。但在胡杨中,对膜联蛋白家族在抗逆性中的作用情况还缺乏了解。本文研究胡杨Anneixn1在植物耐受渗透胁迫和干旱中的作用。【方法】本研究对渗透胁迫诱导的PeAnn1基因表达进行检测,对Pe Ann1进行相关生物信息学分析,与毛白杨、拟南芥、大豆和水稻膜联蛋白基因家族成员进行序列比对和系统进化树分析,以过表达PeAnn1拟南芥(PeAnn1-OE1和PeAnn1-OE2)、Annexin1突变体(atann1)和野生型拟南芥(WT)为实验材料,利用不同浓度甘露醇处理(0、150、200、250、300 mmol/L)模拟渗透胁迫,并对各株系进行土壤干旱和复水处理,测定了不同处理株系的萌发率、根长、叶绿素含量及荧光参数、过氧化氢含量、抗氧化酶活性和基因表达等指标,分析了不同基因型拟南芥的抗旱性。【结果】短期渗透胁迫处理诱导了胡杨叶片中PeAnn1基因的上调表达。PeAnn1基因序列与毛白杨PtAnn1相似度最高,与PtAnn1亲缘关系较近。在甘露醇培养基上,过表达PeAnn1拟南芥的生存率和根长生长受到明显的抑制,且随着甘露醇浓度的升高,差异显著(P <0.05)。复水后,PeAnn1转基因拟南芥光合参数的恢复程度也较低。在渗透胁迫下,转基因植株抗氧化物酶SOD、POD、CAT的活性以及编码基因的表达量显著低于野生型和突变体,不能清除过多活性氧,导致氧化伤害。【结论】以上结果表明,过表达PeAnn1降低了拟南芥对水分逆境的抗性。

【目的】盐胁迫是影响植物生长发育的不利环境因子。蛋白激酶PKS5作为植物盐超敏感信号转导途径的重要组分，在植物响应盐胁迫过程中具有重要调节功能。本文旨在生理水平和分子水平上，探究胡杨PePKS5基因在植物耐受盐胁迫过程中的调节作用。【方法】克隆胡杨PePKS5基因，并在拟南芥中过表达，获得T_3代转基因拟南芥纯合体。观察盐胁迫下转基因拟南芥株系的耐盐表型，测定其过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶活性及盐胁迫响应基因的表达量。利用非损伤微测技术测定转基因拟南芥株系根尖Na~+、K~+动态离子流，利用激光共聚焦显微镜观测转基因拟南芥株系根尖Na~+和H_2O_2含量。测定盐处理后转基因拟南芥土培幼苗的叶绿素荧光参数、光合参数等生理指标，揭示PePKS5基因在盐胁迫下对拟南芥的生理调节作用。构建亚细胞定位载体，通过瞬时转化烟草，对PePKS5蛋白进行亚细胞定位观测。【结果】（1）PePKS5基因的CDS序列编码417个氨基酸，PePKS5氨基酸序列与毛白杨PtPKS5相似度最高，并且亲缘关系最近。（2）PePKS5定位于细胞质和细胞核中。（3）NaCl处理6 h后，胡杨叶片PePKS5基因表达量上调，72 h后逐渐恢复至正常水平。（4）盐胁迫下过表达PePKS5基因的拟南芥株系（PePKS5-OE10和PePKS5-OE15）的生存率和根长均明显高于野生型（WT）和转空载体（VC）株系。（5）与WT和VC株系相比，PePKS5-OE10和PePKS5-OE15株系的POD和CAT活性增强，APX1和CAT2基因的表达量均升高。（6）盐胁迫下PePKS5-OE10和PePKS5-OE15株系的Na~+外排和K~+的内流明显高于WT和VC株系，并且在根尖中积累的Na~+浓度和H_2O_2浓度明显低于WT和VC株系。（7）盐胁迫下PePKS5-OE10和PePKS5-OE15株系的叶绿素相对含量、PSⅡ最大光量子效率、实际光合量子产量和相对电子传递速率均高于WT和VC株系。（8）盐胁迫下PePKS5-OE10和PePKS5-OE15的净光合速率高于WT和VC株系，而胞间CO_2浓度、气孔导度和蒸腾速率均低于WT和VC株系。【结论】过表达胡杨PePKS5基因能够增强拟南芥对Na~+的外排能力，维持植物活性氧的平衡状态，以及保持相对稳定的光合作用能力，从而提高拟南芥的耐盐能力。

本文研究了胡杨apyrase基因(Pe APY1和Pe APY2)对植物耐盐性的影响。以Pe APY1和Pe APY2过表达拟南芥、拟南芥Atapy1和Atapy2突变体、野生型(WT)拟南芥及空载体(VC)为实验材料,研究盐胁迫条件下的植物根长、相对电导率、细胞活力、H_2O_2水平、eATP浓度、抗氧化酶活性的变化。研究结果显示:低盐浓度(50 mmol/L NaCl)对拟南芥各基因型的生长和生理生化指标没有显著影响;而高盐浓度(100 mmol/L NaCl)抑制了各株系的根长生长、细胞活力和抗氧化

Micro RNAs(miRNAs)是一类内源性的非编码小分子RNA。本文克隆了miR156j的前体(peu-MIR156j),并将其转入拟南芥获得35S:MIR156j转基因植株。对转基因植株的鉴定表明,过量表达miR156j增加了拟南芥莲座叶的发生,导致叶片浓密及开花延迟。这一结果表明:同拟南芥、水稻等物种类似,胡杨miR156j主要对植株发育起重要作用,其功能具有保守性。同时发现超表达胡杨miR156j的拟南芥在盐处理下萌发率与生长状况优于野生型,RT-PCR检测显示靶基因SPL6、SPL9及SPL11的表达下调,证明它们被miR156j负调控。基于预测的与逆境胁迫相关的靶基因STRS2...

为研究番茄ｍｉＲＮＡ在非生物逆境胁迫下的表达模式和功能分析。利用ＲｅＡｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ检测番茄ｍｉＲＮＡ３９７在非生物逆境（干旱、盐害、ＡＢＡ）条件下的表达量变化，发现Ｓｌｙ－ｍｉＲ３９７响应这些逆境胁迫，尤其在干旱胁迫下表达最明显。故将Ｓｌｙ－ｍｉＲ３９７过表达载体转入拟南芥中，进行转基因功能验证。结果表明：与野生型相比，转基因拟南芥植株叶片相对含水量下降速率更缓慢，保水能力更好，且在干旱胁迫下，转基因植株的长势明显优于野生型，其最大光合效率、３种抗氧化酶活性ＳＯＤ、ＰＯＤ、ＣＡｔ均明显高于野生型，同时胁迫所产生的丙二醛含量明显低于野生型拟南芥。表明Ｓｌｙ－ｍｉＲ３９７能提高拟南芥对干旱．．．

为探究大豆转录因子GRAS家族GmGRAS69基因在植物干旱胁迫中的功能和可能的分子机制。通过氨基酸序列比对和构建系统进化树分析大豆GmGRAS69与其他物种GRAS成员的序列保守性和进化关系。利用荧光定量PCR方法检测GmPP2C69基因在PEG处理的大豆根和叶中的表达模式。接着构建GmPP2C69基因过表达载体，进而利用农杆菌介导的浸花法转化野生型拟南芥；在正常培养和干旱处理条件下观察野生型和转基因拟南芥的生长表型，测定单株鲜质量、叶片相对含水量和地上部可溶性糖含量、抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性及对应的抗氧化酶基因表达水平。结果显示，GmGRAS69基因在PEG处理的大豆植株根和叶中都显著上调，并且在根中响应更显著。此外，成功获得GmGRAS69基因过表达的转基因拟南芥株系，且过表达株系的耐旱性相比野生型拟南芥WT明显增强。干旱处理后，过表达植株鲜质量、叶片相对含水量和可溶性糖含量均显著高于WT;抗氧化酶SOD、POD和CAT活性以及对应基因SOD、POD和CAT的表达水平也显著高于WT。结果表明，大豆GmGRAS69基因在干旱胁迫下表达上调，进而通过激活SOD、POD和CAT抗氧化酶编码基因、增强抗氧化酶活性和增加可溶性糖的积累，赋予转基因植株更强的耐旱性。

【目的】研究胡杨质膜Na+/H+逆向转运蛋白(SOS1)通过H2O2信号途径对盐胁迫的感知和适应作用。【方法】克隆胡杨质膜SOS1基因(PeSOS1),并将其转化到拟南芥中,比较野生型和转PeSOS1基因拟南芥在100mmol/L NaCl胁迫下的萌发率,根长,干质量,K+、Na+和Ca2+含量,活体植株根尖离子流(K+、Na+和H+)的流动情况,H2O2的产生和抗氧化酶活性的变化以及抑制剂对根尖离子流的影响,分析100mmol/L NaCl胁迫下异源表达PeSOS1基因拟南芥与野生型拟南芥耐盐性的差异。【结果】在NaCl胁迫下,转PeSOS1基因拟南芥株系的萌发率、根长和干质量明显高于野生型...

以甜高粱品种Roma为试验材料,在生物信息学分析基础上,采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,克隆了SbAGL6基因的编码区序列。序列分析表明,SbAGL6基因编码具有256个氨基酸的转录因子,在其N端含有MADS-box结构域,中间存在K-box结构域,与拟南芥AtAGL6等直系同源基因在核苷酸和氨基酸序列上都有较高的相似性。为验证其生物学功能,采用Gateway的方法,构建了SbAGL6基因的可诱导过表达载体。利用农杆菌介导侵染拟南芥的方法,获得了SbAGL6基因的转基因拟南芥植株,并对其进行了功能鉴定。结果表明,未施加诱导物地塞米松Dex时,转基因拟南芥与野生型生长一致,而施加...

提取拟南芥总RNA,反转录获得cDNA后PCR扩增获得1 212 bp目的基因AtSTK。将该基因片段构建到PET-32a表达载体,转化大肠杆菌Rosetta菌,用IPTG进行诱导表达。该基因表达的最佳诱导条件为IPTG终浓度1mmol/L,诱导时间为4 h,此时融合蛋白表达量最高。该融合蛋白存在于包含体中,经包含体溶解、复性,最终纯化获得了AtSTK融合蛋白,为AtSTK蛋白的理化性质研究奠定了基础。

【目的】Remorin蛋白是广泛存在于苔藓、裸子和被子植物中的蛋白家族，在调控植物生长发育及生物胁迫反应方面具有重要作用，但有关remorin抵御非生物胁迫作用机制的研究较少。前期研究发现抗逆树种胡杨的remorin 6.5(REM6.5)可通过增强质膜质子泵活性提高植物耐盐性，在此基础上，本文研究了胡杨PeREM6.5在植物耐受水分胁迫中的作用，旨在进一步揭示植物抗旱的生理与分子机制。【方法】以过表达PeREM6.5拟南芥（OE1和OE2）、野生型（WT）和转空载体对照（VC）拟南芥为试验材料，对各基因型拟南芥进行水分胁迫处理（包括渗透胁迫和土壤干旱）以及复水处理，从生理生化及分子生物学角度研究了胡杨PeREM6.5在拟南芥干旱胁迫中的响应机制。【结果】甘露醇处理后，过表达PeREM6.5拟南芥的存活率、根长显著高于WT和VC，并且在渗透胁迫下细胞膜受损程度较小，这些表型差异主要与转基因拟南芥水分吸收、抗氧化防御能力增强有关。甘露醇处理后，过表达PeREM6.5拟南芥水通道基因AtPIP1;2和AtPIP2;1的表达量提高。甘露醇处理诱导WT和VC根细胞积累H2O2，对细胞膜造成氧化伤害。转基因株系在甘露醇处理后过氧化物酶基因POD和过氧化氢酶基因CAT表达量显著上调，能维持较高的POD和CAT酶活性，清除H2O2及其对细胞膜造成的损伤。在土壤干旱处理9 d后，转基因株系的叶绿素含量下降幅度低于WT和VC，复水后叶绿素含量恢复程度较高。另外，PeREM6.5转基因株系在干旱胁迫下维持PSⅡ实际光合量子产量的能力增强。【结论】过表达胡杨Pe REM6.5基因提高了拟南芥对水分胁迫的耐受性。

【目的】目前对植物SPL8的基因功能研究主要集中在开花和育性方面,而其在干旱胁迫响应中的作用却鲜有报道。本文克隆、分析了白桦BpSPL8启动子,并研究了BpSPL8基因在拟南芥中响应干旱胁迫的功能。【方法】通过PCR克隆技术得到了白桦BpSPL8启动子;利用PLACE和PlantCARE软件对BpSPL8启动子顺式作用元件进行了预测。构建了BpSPL8启动子驱动GUS(β-葡萄糖苷酸酶编码基因)的植物表达载体,并采用浸花法将其转化至拟南芥中;继而利用GUS染色分析了BpSPL8启动子的组织表达模式;同时对BpSPL8在PEG处理下的表达水平进行了qRT-PCR分析。最后,以过表达BpSPL8拟南芥为材料来探究BpSPL8在干旱胁迫下的生物学功能。【结果】启动子元件分析显示,BpSPL8启动子中含有组织特异表达、光响应、激素响应及多个胁迫响应元件。GUS染色结果表明,BpSPL8启动子可在拟南芥的下胚轴、叶片、叶柄、根和花序中启动GUS基因表达。BpSPL8基因在PEG处理下的野生型白桦的根和叶片中均呈现先上调后下调的表达趋势。干旱胁迫下,过表达BpSPL8拟南芥的存活率和脯氨酸含量均显著低于野生型,丙二醛含量显著高于野生型;两个已知的抗逆基因DR29B和P5CS1在干旱处理后的野生型和转基因拟南芥中均上调表达;但在转基因拟南芥中呈现出延迟上调的表达模式。【结论】异源过表达白桦BpSPL8能够降低拟南芥的耐旱性,并在干旱胁迫下影响抗性基因DR29B和P5CS1的表达模式。

【背景】黄瓜易感多种病害，特别是枯萎病和白粉病，化学药物防治虽然有效但因残留高和不易降解而被限制使用，培育广谱、持久抗病的黄瓜品种是解决这一难题的根本策略。病程相关基因非表达子1(nonexpressor of pathogenesisrelated genes 1,NPR1)是系统获得性抗性（systemic acquired resistance,SAR）中的关键调控因子，参与调控多种防御相关基因的表达，影响植物的抗病能力。【目的】在黄瓜中过表达AtNPR1，探究转基因黄瓜对枯萎病和白粉病的抗性，为培育抗病能力更强、更持久的黄瓜品种提供试验依据。【方法】通过克隆拟南芥AtNPR1，构建AtNPR1过表达载体，利用农杆菌介导法转化黄瓜，获得过表达AtNPR1的转基因黄瓜植株，利用实时荧光定量PCR方法测定转基因植株中相关防御基因的表达量。选择T_0代转基因植株进行枯萎病的抗性鉴定，T_1代转基因植株进行白粉病的抗性鉴定，测定转基因植株接种枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum）和白粉病菌（Golovinomyces cichoracearum）后，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、过氧化物酶（peroxidase,POD）、过氧化氢酶（catalase,CAT）等抗氧化酶活性变化及丙二醛（malondialdehyde,MDA）、活性氧（reactive oxygen species,ROS）含量的变化。【结果】成功获得8株T0代转基因植株，OE#4和OE#5为AtNPR1高表达植株，OE#3为AtNPR1低表达植株；通过对转基因植株中相关防御基因的表达量分析发现，过表达AtNPR1的转基因植株中多个相关防御基因表现更强、更快的表达，并且防御基因的表达量与AtNPR1在转基因植株中的表达量呈正相关。其中，PR1、PR4和WRKY70的表达量上调极为显著。转基因植株的抗病性鉴定结果表明，在枯萎病和白粉病的胁迫下，转基因植株表现出更显著的抗性，发病缓慢、症状轻微，病斑面积显著低于野生型（WT）植株。转基因T_0代植株OE#4和OE#5在接种枯萎病菌3 d后未出现明显病斑，接种7 d后出现灰褐色病斑，但未呈现萎蔫等状态；WT植株在接种3 d时出现灰褐色病斑并且轻微萎蔫，7 d时叶片出现严重萎蔫。接种白粉病菌7 d后，T_1代植株OE#2和OE#7和WT植株均出现病斑，但OE#2和OE#7植株病斑面积显著低于WT植株；接种15 d后WT植株出现叶片黄化失绿，而转基因植株OE#2和OE#7病情较轻。与WT植株相比，接种病原菌后，转基因植株中MDA含量较低，SOD、POD、CAT活性保持较高水平，ROS含量累积较少。【结论】黄瓜中过表达AtNPR1可以提高黄瓜对枯萎病和白粉病的抗性。

［目的］拟南芥ＧＨ３－５和ＧＨ３－６基因属于生长素早期应答基因ＧＨ３基因家族。ＧＨ３－５基因过表达植株ＧＨ３．５－１Ｄ和ＧＨ３－６基因过表达植株Ｄｆｌ１－Ｄ都表现出生长素响应缺失的表型，然而与野生型对照相比两者的抗旱能力却完全相反。研究ＧＨ３－５基因的抗旱机制，将能解释两者抗旱表型完全相反的原因。［方法］采用液相色谱－质谱联用技术测定了干旱胁迫后ＧＨ３．５－１Ｄ、Ｄｆｌ１－Ｄ及其对应野生型中水杨酸的含量，同时检测了ＧＨ３．５－１Ｄ／ＮａＨ Ｇ和ＧＨ３．５－１Ｄ／Ｎｐｒ１两种双突变体的抗旱性。［结果］与野生型相比，干旱胁迫后Ｄｆｌ１－Ｄ中水杨酸（Ｓａ）的含量没有差异，而ＧＨ３．５－１Ｄ中Ｓａ的含．．．