[目的]本试验旨在揭示胆碱对热应激诱导的奶牛乳腺上皮细胞凋亡的抑制作用。[方法]奶牛乳腺上皮细胞系(MAC-T细胞)于含10%胎牛血清的DMEM培养基中进行体外培养,将细胞分为对照组、胆碱组(100μmol·L~(-1))、热应激组(42℃,2 h)、热应激+胆碱组。采用CCK-8法分析添加胆碱对MAC-T细胞的药物毒性及细胞增殖活性的影响,采用Western blot分析蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)磷酸化水平及激活转录因子4(ATF-4)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)和Bcl-2关联X(Bax)蛋白表达水平,RT-qPCR检测GRP78、CHOP、ATF-4、Bax、Bcl-2、Caspase-3(胱氨酸蛋白3基因)mRNA水平。[结果]与对照组相比,热应激组MAC-T细胞的相对存活率极显著降低(P<0.01),p-PERK、ATF-4、CHOP、GRP78和Bax蛋白表达量极显著升高(P<0.01),Bcl-2表达量极显著下降(P<0.05),p-PERK、ATF-4、CHOP、GRP78和Bax蛋白表达量均极显著下降(P<0.01),Bcl-2蛋白表达量升高(P

[目的]本试验旨在研究黄芪多糖(APS)对H_2O_2诱导的奶牛乳腺上皮细胞凋亡、氧化损伤及相关基因、蛋白表达的影响。[方法]体外培养奶牛乳腺上皮细胞并用H_2O_2(600μmol·L~(-1),2 h)诱导建立乳腺上皮细胞氧化应激模型;试验分组:空白对照组、H_2O_2组、H_2O_2+APS组(8 mg·mL~(-1)APS)。[结果]与空白对照组相比,H_2O_2组细胞活力显著下降(P<0.05);与H_2O_2组相比,H_2O_2+APS组的细胞凋亡率和细胞中的活性氧(ROS)含量均显著降低(P<0.05),而超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性显著升高(P<0.01),Bax蛋白表达水平显著降低(P<0.05),且APS降低了H_2O_2诱导细胞凋亡率。[结论]APS能够提高H_2O_2诱导的奶牛乳腺上皮细胞抗氧化酶活性,并减缓氧化损伤引起的奶牛乳腺上皮细胞凋亡。

【目的】探究苦参碱对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）增殖、凋亡及抗氧化能力的影响。【方法】利用含0（A组），25（B组），50（C组），75（D组）和100 μg/mL（E组）苦参碱的培养基培养奶牛乳腺上皮细胞。通过四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测BMECs活性，采用流式细胞仪（AnnexinV/PI双染法）检测苦参碱对BMECs凋亡的影响，并检测苦参碱对BMECs抗氧化酶活性及丙二醛（MDA）含量的影响，采用real-time PCR对BMECs中Caspase-3、p53、STAT1和SOCS3

【目的】MicroRNA(miRNA)是一类长度约21-23个核苷酸的非编码小RNA分子,本研究旨在分析高温条件下miRNA-24对乳腺上皮细胞生长、凋亡的作用及其初步机制。【方法】体外培养奶牛乳腺上皮细胞,高温(41℃)处理所培养的细胞;应用miRNA基因沉默技术,抑制高温处理过的乳腺上皮细胞中miRNA-24的表达;采用细胞计数法分析细胞增殖情况;Hoechst33342/PI荧光染色、流式细胞术检测miRNA-24对乳腺上皮细胞凋亡的作用,Western blot检测凋亡相关因子表达变化。【结果】抑制miRNA-24的表达,高温条件下的乳腺上皮细胞增殖能力显著增强(P<0.05),凋亡细...

【目的】观察金黄色葡萄球菌能否诱导牛原代乳腺上皮细胞发生凋亡。【方法】先以新鲜牛奶为材料分离培养牛乳腺上皮细胞并鉴定,然后用金黄色葡萄球菌侵染牛乳腺上皮细胞,采用普通光镜和扫描电子显微镜观察金黄色葡萄球菌诱导牛乳腺上皮细胞凋亡的形态学变化;用流式细胞仪(Annexin V/PI双染法)定量检测金黄色葡萄球菌感染对牛乳腺上皮细胞凋亡的诱导作用;RT-PCR检测细胞凋亡通路中关键蛋白caspase 3和caspase 8的变化情况。【结果】从乳汁中分离的细胞经原代培养后,细胞呈典型的铺路石状,细胞表层可产生大小不等的乳滴,RT-PCR法扩增出乳腺上皮细胞的骨架蛋白8特异性条带;免疫荧光细胞染色法结...

【目的】为了研究微小RNA let-7a（microRNA let-7a，miR-let-7a）对脂磷壁酸（Lipoteichoic acid，LTA）诱导的炎性奶牛乳腺上皮细胞（MAC-T）的增殖和凋亡的作用。【方法】通过实时荧光定量PCR（Quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）、实时细胞分析仪和流式细胞术检测过表达和抑制表达miR-let-7a在炎性MAC-T中的影响。【结果】qRT-PCR检测结果显示，转染miR-let-7a 模拟物会使炎性MAC-T细胞中miR-let-7a的表达量极显著上调（P<0.001），转染miR-let-7a 抑制剂会使细胞中miR-let-7a的表达量极显著下降（P<0.001）；RTCA结果显示，转染miR-let-7a 模拟物能明显促进MAC-T细胞增殖，转染miR-let-7a 抑制物会使MAC-T细胞的增殖受到抑制；流式细胞术结果显示，转染miR-let-7a 模拟物的MAC-T细胞的凋亡率显著降低（P<0.01）；而转染miR-let-7a 抑制剂则与之相反，MAC-T细胞的凋亡率显著升高（P<0.01）。即过表达miR-let-7a可以促进MAC-T细胞增殖，并降低细胞的凋亡率。而抑制表达miR-let-7a的作用与之相反，抑制表达miR-let-7a使MAC-T细胞的增殖下降，细胞的凋亡率增大。【结论】miR-let-7a是一种抑制炎症调节因子，其过表达可以缓解牛乳腺炎，为阐明奶牛乳腺炎的分子调控机制奠定了基础。

[目的]本试验旨在探究TNF-α（肿瘤坏死因子-α）诱导对小鼠乳腺上皮细胞凋亡和程序性坏死的影响。[方法]体外培养小鼠乳腺上皮细胞系（HC-11细胞）并分为四个处理组，对照组（Ctrl），TNF-α组（T），TNF-α+CHX（环己酰亚胺）组（TC），TNF-α+CHX+Z-VAD-FMK（广谱caspase家族抑制剂）组（TCZ）；细胞加药浓度为TNF-α:（20、50、100 ng·mL~(-1)）、CHX: 4 μmol·L~(-1)、Z-VAD-FMK: 20 mmol·L~(-1)。[结果]与对照组相比，100 ng·mL~(-1) TNF-α（T-100）处理12 h后细胞活力显著降低（P<0.01），而TCZ组caspase-8的mRNA水平显著降低（P<0.001），但只有TCZ组程序性坏死标志蛋白RIP3、MLKL和p-MLKL的表达量显著上升（P<0.001），TCZ组的PGAM5蛋白表达水平显著上升（P<0.01），TC组和TCZ组的Drp1的mRNA和蛋白表达水平均显著上升（P

【背景】奶牛乳腺炎是奶牛中危害最严重的疾病之一，严重影响乳品质，不仅造成经济损失，甚至危及人类健康。已有研究表明，lncRNAs广泛参与人和动物的炎症和免疫调节。lncRNA RRAS2-AS1是我们在前期研究中新发现的差异表达lncRNA，其表达模式和功能尚不清楚。【目的】通过探究lncRNA RRAS2-AS1在奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells, bMECs）炎症反应中的作用机制，为奶牛乳腺炎的分子调控机制解析和抗乳腺炎分子选育提供理论依据。【方法】利用RT-PCR和RACE等技术进行了lncRNA RRAS2-AS1的克隆，并通过生物信息学方法进行lncRNA RRAS2-AS1的靶基因预测及功能富集分析；利用细胞免疫荧光技术鉴定bMECs，利用细胞核质分离及半定量PCR技术检测了lncRNA RRAS2-AS1的亚细胞定位情况；采用qRT-PCR检测了lncRNA RRAS2-AS1在脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导bMECs炎症反应和乳腺炎奶牛乳腺组织中的表达模式；利用LPS诱导bMECs构建了炎症细胞模型，在此基础上，通过lncRNA超表达、qRT-PCR和ELISA等技术研究了lncRNA RRAS2-AS1对炎性bMECs内的促炎细胞因子基因、增殖相关基因和凋亡相关基因在mRNA和（或）蛋白质水平表达的影响，同时采用EdU、CCK-8和流式细胞术进一步验证了lncRNA RRAS2-AS1对bMECs增殖、活力和凋亡的影响。【结果】lncRNA RRAS2-AS1基因的长度为363 bp，主要定位于细胞质中。表达量检测结果表明，与对照组相比，lncRNA RRAS2-AS1在LPS诱导炎症的bMECs和乳腺炎组织中的表达量显著下调（P<0.05）;lncRNA RRAS2-AS1超表达试验结果表明，与对照组相比，lncRNA RRAS2-AS1超表达组的炎症信号通路关键基因（TLR4和NF-κB1）、促炎细胞因子基因（IL-1β、IL-6和IL-8）、促凋亡基因（BAD、CASP3和BAX等）的表达量显著下调（P<0.01），而增殖标志基因（CDK2、CDK4和PCNA）的表达量显著上调（P<0.05）。此外，lncRNA RRAS2-AS1超表达组的细胞活力显著增加（P<0.05），而bMECs的凋亡率极显著降低（P<0.01）。【结论】lncRNA RRAS2-AS1在LPS诱导bMECs的炎症反应和乳腺炎奶牛的乳腺组织中均显著下调；超表达lncRNA RRAS2-AS1可下调促炎细胞因子IL-6、IL-8和IL-1β在mRNA和蛋白质水平的表达，并促进细胞活力和增殖、抑制细胞凋亡，从而减轻LPS诱导的bMECs炎症反应，该结果可为解析奶牛乳腺炎的分子调控网络奠定了基础。

【目的】探讨TGF-β1对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡和HSP70蛋白表达的影响。【方法】TGF-β1作用乳腺上皮细胞不同时间,收集细胞及培养液,应用MTT检测细胞增殖、流式细胞术检测细胞凋亡率、比色法检测LDH活性、琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性、Western bolt技术分析HSP70蛋白的表达量。【结果】1、5、10ng·ml-1的TGF-β1均能抑制乳腺上皮细胞的增殖,且随浓度增加抑制作用加大,呈现剂量依赖性,其中10ng·ml-1TGF-β1组与对照组差异显著(P<0.05);10ng·ml-1TGF-β1作用于乳腺上皮细胞,随着作用时间的延长,细胞凋亡率逐渐升高,其中6、12和24...

为分析苜蓿素对脂多糖诱导下体外培养奶牛乳腺上皮细胞抗炎和乳蛋白合成相关基因表达的影响,本研究将体外培养的奶牛乳腺上皮细胞分成4组,即基础培养基(对照)和基础培养基中分别加入1μg·m L-1LPS(L)、1μg·m L-1LPS+10μg·m L-1苜蓿素(L+T)和10μg·m L-1苜蓿素(T)。结果显示,1)与对照组相比,L组奶牛乳腺上皮细胞的活性显著下降(P<0.05),而T组则显著升高(P<0.01)。2)L+T组细胞的超氧化物歧化酶(SOD)活性显著高于L组(P<0.01),而一氧化氮(NO)

【目的】硒(Se)能否通过Nod2/MAPK/mTOR途径调控金黄色葡萄球菌诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤,有待于进一步研究。因此本研究将探究硒对金黄色葡萄球菌(S. aureus)感染的奶牛乳腺上皮细胞(bMECs)Nod2/MAPK/mTORs信号通路中关键蛋白表达的影响,从而为阐明硒的免疫调控机制提供理论依据。【方法】首先将bMECs以106细胞/孔接种于6孔板中,当细胞超过80%的汇合度时,用含2、4和8μmol·L~(-1)浓度硒的培养基替换原来的培养基,继续孵育12 h,然后用PBS洗涤每孔3次,将S. aureus按MOI=1:1的比例加入6孔板中,继续培养0.5 h,然后收集bMECs细胞进行相关蛋白的检测。本试验共分3大组,即对照(Con)组(bMECs)、模型(Mod)组(bMECs+S. aureus)和试验组。其中试验组又分3个亚剂量组,即Low组(bMECs+2μmol·L~(-1) Se+S. aureus)、Mid组(bMECs+4μmol·L~(-1) Se+S. aureus)和Hig组(bMECs+8μmol·L~(-1) Se+S. aureus),每组设3个重复。利用BCA蛋白测定试剂盒对收集的bMECs细胞进行总蛋白提取。应用Western blotting技术检测bMECs中Nod2和RIP2蛋白表达水平及JNK,AKT和mTOR蛋白磷酸化水平。将蛋白样品加到10%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中,上样量为20μg/孔,之后将蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。将PVDF膜用5 mL 5%脱脂乳阻断2 h,脱脂乳脱脂后用TBST清洗后,分别用5 mL的Nod2、RIP2、JNK、AKT、mTOR和β-actin的一抗孵育过夜,回收一抗。之后在PVDF膜中分别加入5 mL上述蛋白的二抗,室温孵育2 h,回收二抗。PVDF用TBST洗涤5次,最后在暗室条件下进行化学显影。【结果】S. aureus能显著提高bMECs中Nod2和RIP2蛋白表达水平及JNK,AKT和mTOR蛋白磷酸化水平(P<0.01)。在培养基里添加2μmol·L~(-1)的硒可极显著抑制Nod2蛋白的表达(P<0.01),在培养基里添加8μmol·L~(-1)的硒可显著抑制Nod2的表达(P<0.05),而在培养基里添加8μmol·L~(-1)硒可显著抑制RIP2蛋白的表达(P<0.01)。在培养基里添加4μmol·L~(-1)的硒能显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平(P<0.05),在培养基里添加8μmol·L~(-1)的硒能显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平(P<0.01)。在培养基里添加4μmol·L~(-1)硒可极显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平(P<0.01),在培养基里添加8μmol·L~(-1)硒可显著抑制AKT蛋白的磷酸化水平(P<0.01)。在培养基里分别添加4μmol·L~(-1)和8μmol·L~(-1)硒均能显著抑制mTOR蛋白磷酸化水平(P

用过氧化氢(H2O2)建立体外奶牛乳腺上皮细胞的氧化应激损伤模型,研究不同质量浓度茶多酚对氧化应激所致奶牛乳腺上皮细胞损伤的影响。MTT法检测细胞存活率,比色法检测细胞培养液中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脱氢酶(LDH)活性,流式细胞术检测细胞凋亡情况,分光光度法检测天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的活性。结果显示:与H2O2损伤模型组相比,20～100μg.mL-1茶多酚处理组的奶牛乳腺上皮细胞存活率、SOD活性显著升高,而MDA含量、LDH与Caspase-3相对活性与细胞凋亡率均下降,其中以100μg.mL-1茶多酚处理组效果最显著,说明一定质...

[目的]本试验在已有研究血管紧张素系统(RAS)在乳腺中保护作用的基础上,对该家族的主要成员血管紧张素转换酶2(ACE2)在对抗高精料所致奶牛乳腺氧化应激、炎性损伤及细胞凋亡中的作用及机制进行了探讨。[方法]6头健康的泌乳期荷斯坦奶牛,随机分为对照组[m(精)∶m(粗)=4∶6]和高精料组[m(精)∶m(粗)=6∶4],采用单栏、定时、定量饲喂。饲喂20周后,活体取乳腺组织,进行如下试验:1)测定乳腺组织中氧化应激指标·OH水平及TNOS、SOD活性;2)ELISA法测定炎性指标TNFα、IL-1β和凋亡指标Caspase-3、Bax、Bcl-2;3)Western blot分析乳腺组织中ACE2和ACE蛋白的表达;ELISA法测定AngⅡ和Ang1-7的含量。[结果]高精料长期饲喂,奶牛乳腺组织中·OH自由基水平显著升高(P<0.05),SOD活性降低,TNOS活性降低显著(P<0.05);炎症因子TNF-α和IL-1β水平均显著升高(P<0.05);促凋亡蛋白Caspase-3和Bax水平显著升高(P<0.05),抑制凋亡蛋白Bcl-2水平显著降低(P<0.05);乳腺组织中AngⅡ浓度(P<0.05)和ACE蛋白表达水平极显著升高(P0.05),但Ang1-7浓度显著降低(P<0.05)。[结论]长期饲喂高精料可导致奶牛乳腺自由基激活、炎症因子释放、细胞凋亡,乳腺局部损伤。乳腺局部组织中RAS处于激活状态,2条轴互相拮抗,表现为AngⅡ水平升高,ACE2水平降低。

用细胞流式、台盼蓝染色、免疫组织化学等方法研究单一高温(40℃1 h)或连续高温(40℃1 h.d-1)3~7 d对乳腺上皮细胞细胞周期、凋亡及热休克蛋白(HSP70)表达的影响。结果表明:40℃1 h单一高温处理乳腺上皮细胞后24 h,G2比例极显著高于对照组(37℃)(P<0.05)。结果提示:高温诱...

[目的]研究产PV-杀白细胞素(Panton-Valentine leukocidin,PVL)金黄色葡萄球菌ATCC49775(产PVL标准菌株)、ΔPVL 49775(PVL基因缺失株)以及体外重组PVL(rPVL)对奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)内质网应激和自噬的影响,为系统阐述金黄色葡萄球菌及PVL对BMECs损伤的分子机制奠定基础。[方法]用感染复数(MOI)为30的金黄色葡萄球菌菌株ATCC49775和ΔPVL 49775感染BMECs,于感染后3和6 h取样;用100 ng/mL rPVL处理BMECs,于处理后1,3和6 h取样;以未处理的BMECs为对照(CK)。用免疫荧光法检测样品BMECs细胞的自噬体荧光强度;提取样品细胞的总蛋白,以GADPH为内参蛋白,采用Western blot法检测各处理组内质网应激相关蛋白(CHOP和GRP78)和自噬相关蛋白(LC3-Ⅱ、ATG5、Beclin1和p62)的相对表达量。[结果]ATCC49775、ΔPVL 49775感染后不同时间,BMECs自噬体荧光强度均极显著(P<0.01)高于CK,内质网应激相关蛋白(CHOP和GRP78)和自噬相关蛋白(LC3-Ⅱ、ATG5、Beclin1和p62)的表达水平也大多显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于CK;同一处理时间下,ATCC49775感染组自噬体荧光强度和相关蛋白表达水平均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于CK,内质网应激和自噬相关蛋白的表达水平大多极显著(P