克隆与肥城桃成熟有关的乙烯受体ETR1基因片段,优化ETR1的表达条件,获得ETR1重组蛋白,为进一步研究ETR1功能并改善肥城桃贮运性能奠定基础。以肥城桃成熟果实总RNA反转录cDNA为模板,经PCR扩增得到特异片段,将该片段连接到质粒,经双酶切后,连接至质粒并转染至表达载体,IPTG诱导,优化表达条件。并以cD-NA为模板,进行实时荧光定量PCR,测定外源NO对ETR1相对表达量的影响。序列分析结果表明,该序列与Gen-Bank中的AF124527的cDNA序列同源性为99%,氨基酸序列同源性为99%。优化蛋白表达条件为:IPTG最佳浓度为0.5 mmol/L,最适温度为30℃,最适诱导时...

克隆了与草莓成熟有关的乙烯受体Etr1基因片段,为进一步研究Etr1基因功能并通过基因技术改善草莓贮运性能奠定基础。以全明星草莓成熟果实中分离到得基因组DNA为模板,经PCR扩增到一条约600bp的特异片段,将该片段克隆到pEGM-T easy vector上经测序分析,基因全长617bp,编码205个氨基酸。序列分析结果表明,该序列与Chandler-Etr1的cDNA序列同源性98%,氨基酸序列同源性97%。

乙烯受体基因ETR1是乙烯信号转导过程中的关键调控基因。研究根据ETR1基因的保守序列设计引物,以西瓜(Citrullus lanatus(Thunb.)Matsum&Nadai var.lanatus)和黄瓜(Cucumis sativus L.)的基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得序列长度分别为1 633 bp和1 491 bp的基因片段CLETR1和CSETR1。序列分析表明,CLETR1和CSETR1与Genebank中收录的多条ETR1基因的核苷酸序列同源性在80%~98%,氨基酸序列同源性在75%~98%。西瓜和黄瓜ETR1基因片段的编码序列存在明显的单核苷酸变异,共23个核苷...

冬枣(Ziziphus jujuba‘Dongzao’)是我国的特色鲜食果品之一,果实富含维生素C和环磷酸腺苷等成分,具有较高的营养和药用价值。冬枣采后贮藏过程中极易失水、皱缩、酒软或霉烂等,致使其供应期甚短。乙烯的生理作用是由位于细胞内质网上乙烯受

为研究Cm-ETR2基因在甜瓜果实发育成熟过程中的作用机理,根据已报道的甜瓜(Cucumis melo)品种Cantalupensis的Cm-ETR2基因序列,设计特异性引物,通过RT-PCR技术从甜瓜品种河套蜜瓜(Cucumis melo L.cvHetao)成熟果实中克隆得到了乙烯受体基因Cm-ETR2 cDNA,序列分析显示,序列长度为2 304 bp,编码767个氨基酸。利用实时荧光定量RT-PCR方法,对其在河套蜜瓜果实发育成熟过程中的表达特性进行了分析,Cm-ETR2基因在15DAP至30DAP表达基本没有变化,35DAP表达量开始上升,上升趋势一直持续至45DAP,且45DAP表...

【目的】研究一氧化氮(NO)和乙烯处理对肥城桃内源乙烯生物合成的影响,并探讨NO与乙烯的拮抗作用。【方法】分别用10μl·L-1NO和1000μl·L-1外源乙烯、10μl·L-1NO和1000μl·L-1外源乙烯共同处理3种方式处理肥城桃果实,研究果实内源乙烯生物合成的变化。【结果】外源乙烯促进了肥城桃果实的内源乙烯生物合成;而NO通过显著降低果实中ACS和ACO的活性,明显抑制了肥城桃果实内源乙烯的生物合成。NO和外源乙烯共同处理的肥城桃果实内源乙烯生物合成低于外源乙烯单独处理而高于NO单独处理,表明NO对外源乙烯具有拮抗作用。【结论】NO抑制了果实内源乙烯的生物合成,且抑制了外源乙烯对果...

【目的】分析香蕉果实成熟及贮藏冷害下乙烯受体基因的表达特性,探讨热处理(38℃,3d)提高果实耐冷性与乙烯受体基因表达的关系。【方法】根据已报道的ETR基因的氨基酸保守序列设计引物,以香蕉果皮总RNA为模板,利用RT-PCR方法克隆香蕉的ETRcDNA,采用Northern杂交分析该基因的表达特征。【结果】香蕉果实在自然成熟进程中,两个基因在果皮和果肉中呈现不同的表达模式:果皮和果肉中Ma-ETR1的表达随果实成熟而逐渐减弱,而Ma-ERS3的表达仅在果实成熟后期略有增强;外源丙烯处理和38℃高温抑制果皮和果肉中Ma-ETR1的表达,却促进了Ma-ERS3的表达;低温促进果皮中Ma-ETR1和...

【目的】以桑品种‘嘉陵40号’的桑椹为试验材料,探究乙烯在桑椹发育进程中的作用和乙烯相关基因的表达模式,为今后有效开发桑椹的经济价值和通过分子生物学手段调控桑椹成熟期提供理论依据。【方法】桑盛花期后21天(21DAF)和26天(26DAF),分别用100 mg·L(-1)乙烯利喷洒桑椹表面,采摘后桑椹经0.5μL·L(-1)乙烯抑制剂1-MCP熏蒸处理,测定其花青素和总糖含量,并提取桑椹的总RNA及合成cDNA模板,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析乙烯生物合成基因MaACO2和MaACS3,乙

克隆了与草莓成熟有关的乙稀受体FaEtr2基因片段,为进一步研究FaEtr2基因功能并通过基因技术改善草莓贮运性能奠定基础。以千代田草莓成熟果实中分离到的基因组DNA为模板,经PCR扩增到1条约1.0 kb的特异片段,将该片段克隆到pGEM-T easy vector上经测序分析,基全长共1 049 bp,编号349个氨基酸残基。序列分析结果表明,该序列与Chandler-Etr2的cDNA序列同源性99%、氨基酸序列同源性为98%。

【目的】生长素几乎参与调控植物发育的各个方面。生长素信号转导存在由ABP1(auxin binding protein1)介导的途径,ABP1作为一种生长素快速响应蛋白参与调控果实发育等生理过程,其主要存在于正在发育的胚及胚的周围组织中。本文旨在研究ABP1是否参与桃果实发育过程,探讨其分布与表达特点,为进一步研究桃果实发育机制奠定理论基础。【方法】以‘24号’桃果实为研究对象,测定其生长曲线以确定果实发育的3个典型时期。分离不同发育时期的中果皮、内果皮和种子,切块后,一部分样品放入EDAC溶液抽真空后进行戊二醛和多聚甲醛固定,固定后的样品经脱水和浸蜡处理后用于石蜡切片;另一部分样品液氮速冻后...

【目的】研究乙烯(ETH)和1-甲基环丙烯(1-MCP)处理对菠萝蜜果实成熟过程中醇酰基转移酶(AAT)活性、Ahe AAT和AheERF1/2转录因子表达的影响,为进一步认识菠萝蜜果实AATs在酯类物质合成中的作用及其调控提供理论依据。【方法】以‘海大2号’菠萝蜜果实为试材,果实盛花期选择具有代表性、花期一致的果实挂牌,花后约150 d采收,选择大小和成熟度相同,且无病虫伤的果实,分成3组进行处理。第一组采用1 000 mg·L~(-1)ETH溶液浸泡2—3 min;第二组采用0.5 mg·L~(-1) 1-MCP熏蒸处理15 h;第三组作为对照组。在果实成熟过程中定期取样,每次取样3—5个果,测定AAT酶活性、AheAAT和AheERF表达等指标。【结果】通过测定AAT酶活性发现,ETH处理促进了果实的成熟衰老,提前了AAT活性高峰出现的时间,但是降低了酶活性。1-MCP处理抑制了果实成熟衰老,在贮藏前期抑制了AAT的活性,延迟了AAT活性高峰出现的时间,并显著降低了AAT的活性。对AheAAT序列分析发现,其全长1 380 bp,编码459个氨基酸。AheAAT具有酰基转移酶的保守结构域H-x-x-x-D和L-x-x-YYPLAGR活性位点基序,D(N) F(V) GWG附加基序,属于BAHD醇酰基转移酶家族,其氨基酸序列与苹果和梨的相似性最高。同时,从菠萝蜜果实中克隆获得2个ERF转录因子,分别命名为AheERF1/2,其中AheERF1全长648 bp,编码215个氨基酸,与苹果和菜豆的同源性最高;AheERF2全长657 bp,编码218个氨基酸,与苹果、番木瓜的同源性最高。AheERF1/2的氨基酸序列含有64/65个氨基酸残基组成的AP2/ERF保守序列,具有ERF家族转录因子的特征序列。ETH处理使果实中AheAAT表达高峰提前出现,并且下调了AheAAT的表达。ETH处理对AheERF1/2转录因子的影响与AheAAT相同,并且ETH降低了AheERF1/2转录因子与AheAAT的相关性。1-MCP处理延长了菠萝蜜果实的贮藏期。在1-MCP处理后的贮藏前期,AheAAT和AheERF1/2转录因子的表达呈现显著降低。当AheAAT和AheERF1/2转录因子出现表达高峰时,1-MCP下调了它们的表达。然而,1-MCP对AheERF1/2转录因子与AheAAT的相关性几乎无影响。【结论】ETH处理提前了AAT的活性高峰及AheAAT和AheERF1/2转录因子的表达高峰,降低了AAT的活性,下调了Ahe AAT和Ahe ERF1/2转录因子的表达,降低了Ahe AAT与Ahe ERF2转录因子的相关性。1-MCP处理在贮藏前期抑制了AAT的活性及Ahe AAT和Ahe ERF1/2转录因子的表达,在贮藏后期降低了AAT的活性,下调了Ahe AAT和Ahe ERF1/2转录因子的表达量。

目的探讨协同抑制番茄ACO1基因对果实成熟和病程相关蛋白基因表达、内源乙烯生物合成及果实耐贮性的影响。方法采用PCR或RT-PCR方法克隆了番茄ACC氧化酶1、ACC氧化酶3、EBF1、PR1、PR5以及NP24基因片段,并以此制备探针,以协同抑制ACO1的转基因番茄和野生型番茄为研究对象,进行Northern杂交,同时测定了伤害叶片和果实的乙烯释放量,并进行了果实贮藏试验等。结果Northern杂交结果表明,番茄ACO1基因表达被抑制后,与果实成熟相关基因LeACO3和LeEBF1,以及病程相关蛋白基因LePR1、LePR5和LeNP24的表达量急剧降低。乙烯释放量测定试验和果实贮藏试验结果...

[目的]制备乙烯应答基因HLS1多克隆抗体,在过表达植物中检测HLS1的积累,为深入研究HLS1响应乙烯信号通路的分子机制奠定基础。[方法]构建pET28a-HLS1c原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导获得重组蛋白HLS1c-His;镍柱亲和纯化重组蛋白后免疫家兔获得抗HLS1血清,利用抗原亲和纯化抗血清获得高纯度的HLS1多克隆抗体;用HLS1抗体和GFP抗体,检测原生质体瞬时转化体系中GFP-HLS1c融合蛋白的表达;用农杆菌蘸花法获得过表达GFP-HLS1g的转基因植物,用HLS1抗体和GFP抗体检测GFP-HLS1g融合蛋白的表达。[结果]成功构建了原核表达载体pET28a-HLS1c,并在大肠杆菌系统中诱导获得重组蛋白HLS1c-His,且多以包涵体形式存在。纯化的HLS1c-His多克隆抗体,能清晰检测到约80 ng原核表达的HLS1抗原。纯化的HLS1抗体不仅能检测到原生质体中瞬时表达的GFP-HLS1c融合蛋白,也能检测到过表达转基因植物株系中的GFP-HLS1g融合蛋白,并且与标签蛋白GFP对应抗体所检测到的特异性条带大小一致。[结论]成功制备了拟南芥HLS1蛋白多克隆抗体,为HLS1蛋白在植物发育中的功能研究奠定了基础。

生物体中接受蓝光信号的因子为蓝光受体蛋白。为了揭示蓝光受体蛋白在蛹虫草中的存在形式,将蛹虫草蓝光受体基因Cmwc-1和Cmwc-2的部分序列构建在原核表达载体p ET-41a(+)中,在大肠杆菌中进行表达。以所表达的融合蛋白作抗原制备抗体,并由Western Blotting对蛹虫草菌丝体和子实体分别进行分析检测。结果表明,获得了高效价的蛹虫草蓝光受体蛋白Cm WC-1和Cm WC-2的抗体。经过Western Blotting分析,在蛹虫草菌丝体和子实体中检测到Cm WC-1有42 ku (Cm WC1-42)和48 ku (Cm WC1-48) 2种蛋白质存在形式,其中在菌丝体中主要以Cm WC1-48为主,Cm WC1-42的相对量较少;而在子实体中主要以Cm WC1-42为主,没有检测到Cm WC1-48。在菌丝体和子实体中检测到Cm WC-2有相同的50 ku(Cm WC2-50)蛋白质存在形式。结果表明,在Cm WC-1和Cm WC-2复合物行使生物功能过程中,Cm WC-1在菌丝体和子实体中分别产生了差异性降解,而Cm WC-2维持稳定。

[目的]本文旨在研究不同肉质型桃果实在成熟过程中乙烯生物合成相关基因的表达及品质差异，为深入揭示果实软化机制及成熟度的准确判断提供理论依据。[方法]以软溶质型桃‘雨花露’‘霞晖5号’和‘奉化玉露’，硬溶质型桃‘霞晖6号’‘湖景蜜露’和‘霞晖8号’，Stonyhard型桃‘霞脆’‘华玉’和‘秦王’，不溶质型桃‘弗雷德里克’‘金童8号’和‘金童9号’的果实为试材，比较研究3个成熟度（七、八、九成熟）果实的乙烯释放规律，并利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术分析与乙烯生物合成相关的基因表达水平的差异。[结果]桃果实硬度随着成熟度的增加逐渐降低，七、八、九成熟果实呼吸速率始终保持在较高的水平，且九成熟果实呼吸速率均高于七、八成熟果实。RT-qPCR结果表明，随着成熟度的增加，溶质型桃果实的PpACS1基因表达与果实乙烯释放速率保持高度一致，且乙烯释放量较高的九成熟果实中PpACS1基因均具有较高表达丰度，而Stonyhard型桃PpaACS1基因表达水平极低；PpACS4基因在不同肉质型桃果实中随着成熟度的递增表达上调，且溶质型桃果实基因表达量显著高于Stonyhard型桃；PpACO1基因在不同肉质型桃果实中均有表达，其表达水平随着果实成熟度的递增有所差异，且果实基因的表达丰度主要集中在八成熟果实中；PpACS2、PpACS3、PpACS5基因在桃果实成熟过程中几乎不表达。[结论]溶质型（软溶质、硬溶质和不溶质）桃果实在成熟过程中主要通过调节与乙烯生物合成相关的PpACS1、PpACS4、PpACO1基因的表达水平，进而控制桃果实的成熟软化；Stonyhard型桃果实由于基因表达水平受抑制，果实在成熟过程中一直维持较高的硬度。