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[期刊] 中国农业科学
[作者]
张承启 王晓妍 陈莉
【目的】Abp1作为肌动蛋白结合蛋白家族成员之一,在各种真核生物肌动蛋白骨架形成过程中具有核心作用。本研究旨在分析禾谷镰孢(Fusarium graminearum)中肌动蛋白结合蛋白FgAbp1在生长发育、对新型杀菌剂氰烯菌酯敏感性以及毒素体形成等生物学过程中的功能。【方法】利用融合PCR和酵母空隙修复技术分别构建FgAbp1基因敲除打靶片段和融合荧光蛋白载体,再通过聚乙二醇介导的原生质体转化的方法获取基因缺失突变体ΔFgAbp1和荧光标记菌株。观察比较野生型PH-1、突变体ΔFgAbp1和回补体ΔFgAbp1-C的菌丝生长、有性生殖以及无性繁殖,并测定基因敲除突变体ΔFgAbp1对杀菌剂氰烯菌酯的敏感性。通过融合绿色荧光蛋白,明确FgAbp1在菌丝中的分布情况;利用透射电子显微镜观察分析FgAbp1对细胞中液泡/囊泡形态的影响。在非产毒环境和诱导产毒条件下,通过双荧光共定位分析FgAbp1在禾谷镰孢毒素体形成过程中的作用。【结果】禾谷镰孢中,FgAbp1主要呈颗粒状定位于近细胞膜处。在MM培养基中,基因敲除突变体ΔFgAbp1的生长速率与野生型相比降低了15%,但在营养丰富的CM中ΔFgAbp1的生长速率却减慢了38%。突变体ΔFgAbp1在无性繁殖以及有性生殖过程中相较野生型没有明显缺陷。然而在0.5μg·mL~(-1)氰烯菌酯的作用下,ΔFgAbp1的菌丝生长完全受到抑制,并且分生孢子萌发率显著下降。此外,敲除基因FgAbp1导致细胞中液泡不能正常形成且囊泡增多。在非产毒条件下,FgAbp1与DON毒素合成关键酶Tri1共定位于囊泡中;在诱导产毒条件下,FgAbp1与Tri1则共定位于毒素体中。此外,敲除基因FgAbp1会导致毒素体不能正常形成。【结论】肌动蛋白结合蛋白FgAbp1在禾谷镰孢营养生长、发育、氰烯菌酯敏感性以及毒素体形成过程中发挥着重要作用。
关键词：
禾谷镰孢 FgAbp1 氰烯菌酯 毒素体
[期刊] 中国农业科学
[作者]
宫安东 雷银玉 吴楠楠 刘景榕 宋梦鸽 张艺美 杨光 杨鹏
【背景】禾谷镰孢（Fusarium graminearum）是引起小麦赤霉病（Fusarium head blight）的主要病原真菌，侵染后导致作物品质和产量下降，同时产生多种真菌毒素，严重危害粮食生产和人类健康。氧酰基载体蛋白还原酶（3-oxoacyl ACP reductase,OAR1）催化羧酰基载体蛋白还原成氧酰基载体蛋白，在脂肪酸的生物合成过程中具有重要作用。【目的】构建FgOAR1基因缺失突变体，研究其表型、显微结构、孢子产量、有性生殖和致病力等的变化，探究FgOAR1的生物学功能，揭示其对禾谷镰孢生长、发育和致病的影响，为新型抑菌作用靶点的筛选及小麦赤霉病的防控提供科学依据。【方法】以禾谷镰孢野生型菌株PH-1为材料，应用Split-Marker基因敲除技术，构建FgOAR1基因缺失突变体（ΔFgOAR1),Gap-repair技术获得缺失基因的回补突变体（ΔFgOAR1-C）；将PH-1、ΔFgOAR1和ΔFgOAR1-C菌株分别接种到常规培养基，观察菌落表型变化并测定脂肪酸含量差异；接种到含刚果红（Congo-Red）、SDS、NaCl和H_2O_2的压力筛选培养基中，观察菌丝在压力培养条件下的生长状况；接种CMC培养基，比较分生孢子产量差异；接种胡萝卜培养基，观察有性生殖及孢子性状；分别进行小麦胚芽鞘和穗部接种，统计发病率和毒素产量，比较突变体与野生型菌株的致病力差异。【结果】与野生型PH-1菌株相比，在PDA、YEG和CM培养基中ΔFgOAR1突变体未呈现明显表型变化，在0.7 mol·L~(-1) NaCl、0.03%H_2O_2、0.01%SDS和300μg·m L~(-1)Congo-Red等压力培养条件下，突变体菌落直径显著低于野生型PH-1，表明FgOAR1与禾谷镰孢细胞膜和细胞壁的合成相关；ΔFgOAR1突变体在液体培养基中的分生孢子产量（8.1×10~5个/mL）显著低于PH-1(1.26×10~6个/mL），接种小麦胚芽鞘和麦穗后，ΔFgOAR1突变体的致病力显著低于野生型菌株PH-1。【结论】禾谷镰孢中FgOAR1参与脂肪酸的生物合成，对细胞膜合成具有重要作用，该基因缺失导致突变体抗逆性降低，分生孢子产量下降，且致病力显著降低，FgOAR1对禾谷镰孢的生长、发育和致病具有重要作用。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
黄绍兴 刘俊君 阎隆飞 彭学贤
从豌豆幼苗及开花植株各器官提取总RNA，以豌豆肌动蛋白基因（PEAC1）为探针，鉴定肌动蛋白基因在不同器官的表达。Northern和Dotblot结果表明，肌动蛋白基因在豌豆中的表达具有发育阶段特异性，它倾向于在豌豆5天苗的芽和2天苗的报中特异表达。
[期刊] 华北农学报
[作者]
范小平 范博红 李学宝 杨维才 徐子勤
运用农杆菌介导法将肌动蛋白RNAi表达载体PBI121-GhACT1转化棉花,经胚胎发生获得再生植株。非转化组培再生苗作为对照。以NPTII制备探针,Southern杂交结果表明,获得8个独立遗传转化系,其中3个系有2个拷贝插入;其余6个系为多拷贝。显微镜下观察开花后第5天的幼胚珠孔端,对照纤维长度约是RNAi载体转基因的3~5倍。成熟后绒长F测验结果表明,RNAi载体转化株与对照差异显著,RNAi转基因植株的绒长显著短于对照。说明GhACT1基因对纤维有延缓和抑制作用,并且主要作用于纤维发育早期。
关键词：
RNAi表达载体 肌动蛋白 转化 绒长
[期刊] 中国水产科学
[作者]
李建林 俞菊华 唐永凯 曹丽萍 吴婷婷
采用RT-PCR和RACE法,从黄鳝(MonopterusalbusZuieuw)肝脏中分离和克隆黄鳝β-肌动蛋白(actin)基因。该基因cDNA全长1765bp[不包括poly(A)],5'端非翻译区12bp,3'端非翻译区有625bp[不包含poly(A)],阅读框(Openreadingframe,ORF)1128bp,翻译成375个氨基酸,蛋白质分子量41 77kD。将所得序列与各科鱼、蛙、鸡、牛、鼠、人等的β-肌动蛋白基因序列同源性分析显示,核苷酸序列具有68%～95%的相似性,氨基酸序列具有97%～100%相似性,显示该基因在生物进化过程中的保守;系统发育分析表明黄鳝β-肌动蛋白...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
邓治 刘向红 李德军
为探寻肌动蛋白解聚因子（ａｃｔｉｎ ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，ａｄｆ）在调控肌动蛋白解聚和聚合平衡过程中发挥的作用，从橡胶树中获得了Ｈｂ ａｄｆ基因组序列，经测定，该序列长２ ２５８ ｂｐ，含有２个内含子和３个外显子，在裂殖酵母中过表达Ｈｂ ａｄｆ，获得相对分子质量约３８ ０００的融合蛋白。对裂殖酵母细胞形态进行观察，发现诱导表达Ｈｂ ａｄｆ的酵母细胞长度显著增加，双核和多核比例达６７％。实时荧光定量ｐｃｒ结果表明，Ｈｂ ａｄｆ的表达受３％Ｋｉ处理调控，在橡胶树不同死皮阶段和不同排胶时间段的表达存在变化，说明Ｈｂ ａｄｆ可能参与了橡胶树排胶和死皮的过程。
[期刊] 华北农学报
[作者]
王芳 汤璧蔚 董乐 刘宝 黄慧 黄苹苹 张立群 栾芙蓉
为探讨蓖麻肌动蛋白(Actin)基因(RcActin)是否可作为蓖麻基因表达研究中的内参基因。以蓖麻生长根为试验材料,根据GenBank中公布的RcActin全长cDNA序列(登录号:XM_002522148.3)设计合成特异性引物,经PCR扩增获得RcActin的编码序列(CDS),并将其插入原核表达载体pET32a(+)中。重组表达载体pET32a(+)-RcActin转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达融合6个组氨酸标签的目的蛋白,表达蛋白经钴离子螯合磁珠纯化后,采用Western Blot验证,结果表明,pET32a(+)-RcActin可诱导表达分子量约为61.46 ku的融合蛋白His-RcActin。用纯化的His-RcActin免疫BALB/c小鼠,经细胞融合及筛选获得9株能分泌抗蓖麻RcActin蛋白质单克隆抗体(Monoclonal antibody, McAb)的杂交瘤细胞株。利用阳性杂交瘤细胞株刺激小鼠,取腹水,采用间接ELISA方法测定,结果表明,5株阳性单克隆细胞株腹水效价达到1∶1 000 000及以上。用蛋白A/G亲和层析法纯化His-RcActin McAb;采用间接ELISA方法对纯化McAb的特异性进行测定,3株阳性细胞株能分泌针对RcActin的特异性McAb;通过抗体亚类鉴定试剂盒鉴定纯化McAb的亚型,结果表明,3株阳性细胞株分泌的McAb亚类均为IgG1。采用间接ELISA方法对3株阳性细胞株分泌McAb的稳定性进行鉴定,获得1株在体外传19代或液氮冻存4个月后、能稳定分泌McAb的阳性细胞株。采用Western Blot和间接ELISA方法对从该细胞株中纯化的McAb的特异性、效价进行验证,结果表明,获得的McAb具有针对RcActin的特异性且效价为1∶512 000。以制备的McAb为一抗,利用Western Blot方法分析RcActin在正常水肥管理且时空一致条件下的蓖麻8个组织中的表达量,结果表明,蓖麻不同组织中RcActin的含量存在显著性差异(P<0.05)。RcActin表达研究为蓖麻功能基因表达分析中内参基因的筛选提供了一定的理论依据。
[期刊] 水产学报
[作者]
杜雪莉 周利亘 王锡昌 熊何健 苏文金 曹敏杰
采用Sephacryl S-400凝胶过滤柱层析和电洗脱等纯化方法,首次从黄鳍鲷骨骼肌中分离纯化到伴肌动蛋白,并制备了特异性多克隆抗体。多克隆抗体经Protein A-Sepharose亲和层析柱纯化得到高纯度免疫球蛋白G(IgG)。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫斑点印迹(Dot-Blot)和免疫印迹(Western-Blot)等方法对纯化的伴肌动蛋白及其多克隆抗体进行分析鉴定,并研究了不同贮藏条件下伴肌动蛋白的变化情况。SDS-PAGE结果显示本研究从黄鳍鲷骨骼肌中分离纯化了高纯度伴肌动蛋白;Dot-Blot检测结果显示兔抗黄鳍鲷伴肌动蛋白多克隆抗体效价为5×104;Wes...
关键词：
黄鳍鲷 伴肌动蛋白 纯化 抗体
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
曹晓风 赵武玲 吴玮 阎隆飞
高等植物细胞内含有肌动蛋白 ,但含量较低 ,难于提取及进行进一步研究。我们用 PCR的方法扩增肌动蛋白 c DNA,并克隆到表达质粒 p Trp His,然后转化大肠杆菌 DH5α;在 IPTG诱导下 ,肌动蛋白表达在包涵体中 ,在没有 IPTG诱导时 ,肌动蛋白表达在胞液中
关键词：
肌动蛋白 基因表达 包涵体
[期刊] 西南农业学报
[作者]
蒲芝雨 杨玉菊 张安勉 赵平 丁勇
【目的】研究樟叶越桔肌动蛋白Actin7基因的组织表达特征。【方法】在樟叶越桔三代转录组数据库的基础上，应用PCR技术成功克隆VdActin7基因cDNA和DNA序列。进一步利用qRT-PCR技术检测并分析VdActin7基因在樟叶越桔幼嫩叶片、成熟叶片、花芽、花、绿色果实、红色果实、绿色果梗和红色果梗等组织中的表达情况。【结果】获得VdActin7基因DNA序列1657 bp, cDNA序列1387 bp。VdActin7基因含有3个内含子，分别为93 bp的intron1、89 bp的intron2和88 bp的intron3,完整开放阅读框长1134 bp,编码377个氨基酸，理论分子量为41.70 KD,等电点为5.31,无信号肽和跨膜结构，属于稳定亲水性蛋白。系统进化树分析发现，VdActin7蛋白与同为越橘属的兔眼越橘(Vaccinium ashei)Actin7亲缘关系最近。VdActin7基因密码子偏好性分析显示，总GC含量和同义密码子第三位核苷酸含量(GC3s)分别为48.2%和44.1%,有效密码子数(ENC)为49.28%,高频密码子共有31个。VdActin7与枣树(Ziziphus jujuba)ZjActin7基因相似，均对CUU偏好性最强，GUU次之，但VdActin对CUU的偏好性(3.43)明显强于ZjActin7(2.57)。qRT-PCR结果显示，VdActin7基因表达呈现明显的组织特异性，在嫩叶中高表达，在成熟叶和果梗中表达量较低，而在果实中检测不到表达量或不表达，暗示VdActin7基因可能在嫩叶的发育过程中发挥重要作用。【结论】本文首次报道了樟叶越桔Actin7基因序列及序列特征，并发现VdActin7基因具有组织表达特异性，为进一步研究VdActin7基因功能、表达调控及作用机制奠定了基础。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张然然 王全坡 陈辉
【目的】获得华山松大小蠹β-肌动蛋白基因序列,探讨其作为内参基因的可行性。【方法】通过比对其他昆虫β-肌动蛋白的氨基酸序列设计简并引物,用PCR的方法获得华山松大小蠹β-肌动蛋白基因片段,进一步通过RT-PCR和qRT-PCR的方法,研究β-肌动蛋白基因在华山松大小蠹不同发育阶段和成虫不同组织的表达情况。【结果】获得了1 461bp的华山松大小蠹β-肌动蛋白基因cDNA序列,与其他昆虫肌动蛋白基因核苷酸序列的相似性在86%以上,且该基因在华山松大小蠹幼虫、蛹、成虫3个发育阶段以及成虫的头、胸、腹、足、翅等组织中表达稳定,且表达量无明显差异。【结论】成功获得了华山松大小蠹β-肌动蛋白基因片段,且...
[期刊] 水产学报
[作者]
张志峰 茅云翔 潘洁 汪小龙 包振民
从皱纹盘鲍雌性个体的足部肌肉提取总ＤＮＡ后，通过聚合酶连式反应（ＰＣＲ）技术扩增得到一个扩增产 物。经克隆、筛选、确定重组子产物。测序得到了长度为５１１ｂｐ的启动子片段。分析测序结果发现，皱纹盘鲍 肌动蛋白基因启动子ＤＮＡ序列与目前已知的红鲍相应序列的相似度为９５％；ＯＣ碱基含量为３８．９３％，较红 鲍的低（５９．２％）；所得序列含有高度保守的基本表达调控元件，即一个ＣＡＡＴ框和四个：ＴＡＴＡ框。
关键词：
皱纹盘鲍 肌动蛋白基因 启动子 序列分析
[期刊] 中国水产科学
[作者]
张殿昌 邵艳卿 苏天凤 江世贵
鲮(Cirrhinus molitorella)是华南地区重要的淡水养殖品种之一,但是鲮生长速度慢,且不耐低温,是目前鲮养殖产业所面临的主要问题。作为利用转基因技术培育快速生长鲮新品系研究工作的一部分,本实验利用PCR和一种新的染色体步移方法克隆了鲮β-肌动蛋白(β-actin)基因启动子和全基因组DNA序列。鲮β-actin基因长4 351 bp,由6个外显子和5个内含子组成。鲮β-actin基因启动子区域包含1个TATA盒,1个CCAAT盒,2个CArG调控元件和1个CRE调控元件,并且鲮β-actin基因内含子1中也含有一个CArG调控元件。这些结构特征说明本研究所克隆的鲮β-actin...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
张聪 徐建强 于俊杰 陈长军 王建新 周明国
分别扩增了禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)对多菌灵(MBC)敏感菌株(MBCS)的β1-微管蛋白基因(β1-S)和β2-微管蛋白基因(β2-S),及多菌灵中抗菌株(MBCMR)和高抗菌株(MBCHR)的β2-微管蛋白基因(β2-MR和β2-HR),测序正确后连接到pET32a(+)原核表达载体上,转化至大肠杆菌Rosepta感受态中,经IPTG(1 mmol.L-1)诱导,得到了N末端融合6×His纯化标签的表达产物。SDS-PAGE电泳分析表明:在大肠杆菌中表达了相对分子质量约68×103的蛋白,和预测蛋白大小一致,表达的产物主要以包涵体的形式存在。表达的蛋白经HisT...
[期刊] 华北农学报
[作者]
张少斌 刘曦 赵依诗 汪澈 刘国琴
以培养3～4 d的豌豆幼苗为试验材料,以18S rRNA基因为内参基因,豌豆幼肌动蛋白异型体PEAcII基因为检测基因,在PEG6000模拟水分亏缺条件下,采用半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)体系检测肌动蛋白异型体PEAcII基因在豌豆幼苗中的表达情况。在正常供水条件下,PEAcII在处理的第8 h表达量最高,水分胁迫下,PEA-cII基因在处理的0.5 h表达量下降,在处理的1 h时表达量最高,而后下降。无论是正常供水还是水分胁迫条件下,PEAcII基因的表达都是一个动态变化的过程。试验结果表明,肌动蛋白异型体PEAcII表达量的高低可能与豌豆幼苗适应水分亏缺的生理过程有关,这对于...
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