[目的]本文旨在研究聚乙烯亚胺(PEI)配合灭活H5N1禽流感病毒口服免疫对鸡免疫反应和生长发育的影响。[方法]1日龄雏鸡35只,随机分成5组,每组7只。根据免疫方法分为口服生理盐水0.3 m L组(CK)、口服灭活禽流感病毒0.25 m L组(IAIV)、口服0.08 g聚乙烯亚胺配合0.25 m L灭活禽流感病毒组[IAIV+PEI(0.08)]、口服0.02 g聚乙烯亚胺配合0.25 m L灭活禽流感病毒组[IAIV+PEI(0.02)]和皮下注射灭活禽流感油乳佐剂疫苗组(i H)。分别在首次免疫后

［目的］本文旨在解决传统慢病毒生产方法中存在的实际操作复杂或成本高等问题，提高慢病毒生产效率。［方法］使用了以聚乙烯亚胺（ＰＥＩ）为转染介质，以聚乙二醇６０００（ＰＥＧ６０００）为离心浓缩介质的慢病毒生产方法，并对浓缩后的慢病毒进行滴度测定。还对可能影响慢病毒滴度的几个关键因素——转染初始细胞数、Ｎ／Ｐ值、转染质粒ＤＮＡ量、佐剂的选择等的作用进行了分析。［结果］在使用１５ ｃｍ培养皿生产慢病毒的条件下，转染质粒ＤＮＡ总量１０．５μＧ，Ｎ／Ｐ＝２０，ＰＥＩ浓储液Ｐ Ｈ值为７．０～９．０，转染时２９３Ｔ细胞数（０．５～２）×１０７时，可以获得较好的慢病毒滴度。［结论］ＰＥＩ作为一种新的转染试剂，可．．．

【目的】研究抗禽流感病毒免疫的分子机制,发现新的抗禽流感病毒免疫相关基因,为抗禽流感转基因育种的研究奠定基础。【方法】随机选取40只30日龄AA白羽肉鸡,其中20只鸡注射禽流感H5亚型禽流感灭活疫苗,另20只未注射疫苗鸡作为对照,在注射后第9天取脾脏保存在液氮中。应用mRNA差异显示技术,结合反向northerndot blot鉴定技术,来筛选注射疫苗组和未注射疫苗组的差异表达基因。【结果】筛选出13条差异表达EST,其中未注射疫苗组4条,注射组9条表达量增高。应用BLAST工具将EST对核酸数据库nr和dbEST中所有序列进行了同源性分析。DD3、DD4、DD6、DD9、DD11、DD12与...

为探讨鸭源禽流感灭活抗原与佐剂配合饮水免疫雏鸭的效果,应用鸭源禽流感灭活抗原与复合黏膜免疫佐剂(CpG和/或葡萄糖)饮水免疫雏鸭,检测消化道(主要是咽和小肠)抗体分泌细胞的变化。首先分别从鸭的胆汁和血清中粗提免疫球蛋白A(IgA)和IgG,经纯化后制备了兔抗鸭IgA和IgG,然后应用免疫组化技术显示鸭消化道IgA和IgG分泌细胞。试验结果表明:用禽流感灭活抗原配合CpG和/或葡萄糖饮水免疫后3、5和7周,消化道黏膜局部IgA分泌细胞面积均显著或极显著增加(P<0.05或P<0.01),IgG分泌细胞(除首免后第3和7周小肠外)极显著升高(P<0.01)。而单独用禽流感灭活抗原和用葡萄糖配合禽流...

对主要用于我国高致病性禽流感防控的重组禽流感病毒H5亚型灭活疫苗的种类和使用情况,以及国内高致病禽流感流行株的主要分支情况作一介绍。随着病毒抗原性的不断变异,疫苗毒株也需随之进行更换,因此必须使用匹配相应分支的疫苗才能取得理想的防控效果。目前国内重组禽流感病毒H5亚型灭活疫苗的生产现状是共有10家生产企业,其中2个厂家采用悬浮细胞工艺生产,其余8个厂家均采用鸡胚工艺进行疫苗生产。笔者根据企业上报的产品批签发报告情况,以2016年至2017年农业部规定的高致病性禽流感强制免疫疫苗重组禽流感病毒H5亚型三价灭活疫苗(Re-6株+Re-7株+Re-8株)为例,着重从疫苗的安全性和效力两方面对4家重组禽流感灭活疫苗生产企业共计488批次产品的批签发检验数据进行了质量分析。从Re-6株、Re-7株、Re-8株不同组分效价的比较可以看出,所有批次疫苗抗体效价几何平均滴度(GMT)至少高于国家标准1个滴度以上,而Re-6株和Re-8株组分抗体效价(GMT)高于国家标准2个滴度以上。虽然产品的效价都超过了国家标准,但抗体水平还是参差不齐,较高产品的3个组分抗体效价(GMT)比较低的要高出1.5个滴度以上。各生产企业产品批间差异较大,这虽有生产工艺不断成熟和优化的因素,但对于相近批次产品批间差异出现较大差异,则说明企业生产工艺并不十分稳定。4个企业在2017年生产的疫苗各组分抗体效价GMT整体水平均比2016年有所提高,说明生产工艺的不断成熟和优化,企业对产品质量的进一步严格把关。我国禽流感病毒灭活疫苗含有的甲醛和细菌内毒素是造成疫苗副反应的直接原因,因此通过生产工艺改进,降低疫苗中甲醛和细菌内毒素的含量,可以降低疫苗的副反应。核酸疫苗是当前禽流感疫苗研究发展的前沿技术,是现阶段禽流感疫苗硏制中最具理想前景的疫苗,也是禽流感疫苗研究的一大热点。另外,具有交叉保护性的广谱免疫原性的通用疫苗可以有效的解决抗原漂移这一难题,是现阶段流感疫苗研究的一个重要研究方向。

分别在禽流感灭活抗原(H5N2)中添加黏膜免疫佐剂CpG(CpG佐剂组)和重组IL-2(IL佐剂组),经过鼻腔免疫鸡群后研究呼吸道各段抗体分泌细胞的分布和数量变化。结果发现:在鼻腔免疫后第3周和第5周CpG佐剂组肺单位视野中IgA分泌细胞面积显著高于对照组(生理盐水)(P<0.05),CpG佐剂组和IL佐剂组肺和气管、气管叉单位视野中IgG分泌细胞面积和数量均显著或极显著高于对照组(P<0.05或P<0.01);免疫后第5周和第7周CpG佐剂组气管和气管叉单位视野中IgA分泌细胞面积显著高于对照组(P<0.05)。免疫后第7周2个试验组气管叉中IgG分泌细胞数量极显著高于对照组(P<0.01)...

【目的】结合胶体金免疫层析技术建立一种适合养鸡业基层生产人员使用的便捷的快速诊断禽流感病毒感染鸡群的方法。【方法】将含禽流感病毒非结构基因ns1的表达载体KG-NS1转化入BL21(DE3)感受态细胞,筛选阳性克隆进行诱导表达,表达产物用GST亲和层析柱进行纯化和Western-blot分析;以NS1重组蛋白为诊断抗原,抗鸡IgFc的单抗标记的胶体金为示踪物,结合免疫层析技术,组装禽流感病毒NS1抗体的免疫胶体金鉴别诊断试纸条,评价其灵敏度和特异性,并对试验感染和临床采集的血样进行检测。【结果】NS1重组蛋白分子量约为52kD,具有免疫学活性。在25min内用肉眼观察到禽流感病毒感染鸡血清和N...

选择40头新生犊牛,按出生日期随机分为试验组和对照组,每组各20头,试验组犊牛精料按40g·t(-1)的比例添加牛至(Origanum vulgare)精油,旨在研究天然添加剂牛至精油对新生犊牛生长发育和血液免疫的影响。从犊牛出生到70日龄,跟踪研究了两组犊牛生长性能和血液免疫指标。结果表明,随着犊牛生长、发育时间的增加,试验组犊牛体重、体高、体长、胸围、腹围、管围、血清总蛋白、免疫球蛋白G、免疫球蛋白A、免疫球蛋白M以及平均采食量均极显著高于对照组(P<0.01),且试验组犊牛腹泻次数极显著降低(P<0

乙烯是迄今为止所发现的 5大类植物激素之一 ,它广泛存在于植物体中 ,对植物的生长发育 ,特别是植物的成熟和衰老起着十分重要的调节作用。研究还发现 ,乙烯参与逆境条件 (热害、冷害、旱害、涝害、盐害、紫外线和重金属离子等 )下植物的胁迫反应 ,影响到植物体内一系列胁迫反应的开始和植物抗性的变化。近年来又发现乙烯参与植物的抗病反应 ,尤其是转反义乙烯形成酶基因植物的抗病性研究倍受重视。人们虽然在转反义乙烯形成酶基因植物的抗病性方面做了大量的工作 ,积累了相当多的资料 ,发现植物的抗病性与乙烯密切相关 ,但由于该研究尚处在初期 ,研究还不系统 ,乙烯在植物抗病反应中的作用机理也不十分清楚 ,因此需...

【目的】表达欧亚类禽型(eurasian avian-like,EA)H1N1猪流感病毒(SIV)的血凝素(HA)蛋白,并对其免疫原性进行测定。【方法】利用RT-PCR技术扩增病毒A/swine/Zhejiang/245/2013(H1N1)(ZJ245)的HA基因,将其克隆至真核表达载体pCAGGS中,获得重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245),将其转染293T细胞,采用间接免疫荧光(IFA)检测和Western blot检测HA蛋白在体外的表达;将重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)经肌肉注射途径、以100μg/只剂量免疫16只6周龄BALB/c小鼠(I组和II组),间隔3周后进行加强免疫(二免);同等数量的小鼠以相同方式注射100μL无菌PBS作为非免疫对照组(III组和IV组)。首免和二免每周采血,分别采用血凝抑制(HI)试验和病毒中和(VN)试验两种方法测定不同类型的血清抗体效价;二免2周后,其中两组小鼠(I组和III组)用50μL(106.0EID50)的ZJ245病毒经滴鼻感染途径进行攻毒,另外两组(II组和IV组)用A/swine/Heilongjiang/44/2009(H1N1)(HLJ44)病毒进行攻毒。攻毒后14 d内每天观察小鼠的临床症状、统计发病与死亡情况,且每天称量小鼠体重,在体重下降比率超过25%时判定为小鼠死亡。攻毒后第3天,每组随机剖杀3只小鼠,分别采集脑、鼻甲、肺、脾和肾等脏器,匀浆处理后通过接种10日龄的非免疫鸡胚测定脏器的病毒含量。通过小鼠体重变化以及脏器滴定的病毒含量评估重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)的免疫保护效果。【结果】经酶切鉴定和测序验证表明ZJ245的HA基因的已正确克隆至真核表达质粒p CAGGS中获得重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245),经体外转染293T细胞后,IFA和Western blot证实了病毒的HA蛋白能够正确表达,并具有良好的生物学活性;小鼠的免疫与攻毒试验结果表明,重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)首免后一周可检测到针对同源病毒ZJ245的低水平HI和VN抗体,加强免疫后抗体水平明显升高,HI抗体达到76.88、VN抗体达到152.5;同时针对异源病毒HLJ44也产生了较低水平的HI和VN抗体。106.0 EID50的同源病毒ZJ245攻毒时,与非免疫组小鼠相对比,重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)的免疫完全阻止了因病毒攻击而导致的小鼠体重下降以及肺脏和鼻甲内病毒的复制;106.0 EID50的异源病毒HLJ44攻毒时,相比非免疫组小鼠,质粒免疫组小鼠体重的下降比率、以及肺脏和鼻甲内的病毒滴度均显著降低(P<0.05)。【结论】重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)能够有效表达病毒HA蛋白,免疫后可使小鼠获得完全抵抗ZJ245感染及部分抵御HLJ44感染的免疫保护力,表明重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)具有良好的免疫原性。

为了解湖北鸡源禽流感病毒的遗传进化和氨基酸变异情况,将分离到的2株禽流感病毒进行全基因组测序及遗传进化分析。利用RT-PCR扩增流感病毒基因组片段,PCR扩增流感病毒片段、克隆至pMD18-T载体,并对序列特征进行生物信息学分析。结果表明:分离到的2株病毒高度同源,其HA和NA基因属于Y280谱系,PB1、PA、NP和NS基因属于SHF98-like谱系,PB2和M基因属于G1-like谱系;HA裂解位点均为-RSSR↓GLF-,具有低致病性流感病毒的分子特征;在HA蛋白上比当前流行株Y280多了一个潜在糖基化位点313(NCS);在234位点(对应H3编号中的226)产生了从Q到L的突变;在M2蛋白的31位点均产生了从S到N的突变。该2株H9N2亚型流感病毒为Y280谱系的病毒,这提示湖北地区可能也流行Y280-like分支禽流感病毒,虽然属于低致病性禽流感病毒(Low pathogenic AIV,LPAIV),但具有感染哺乳动物的潜在风险。

为调查我国多个省份鸡群中发生一种以眼睑肿胀出血、呼吸道症状、产蛋鸡产蛋率急性下降为特征的传染性疾病的致病病原，本研究对发病鸡群进行流行病学调查，病原分离鉴定，病毒全基因序列分析，并对分离病毒进行了动物回归试验。结果表明：1）该病自2021年12月首先发现于广东省某三黄鸡群，随后陆续在福建、安徽、江苏、河南等多个省份鸡群中发生，鸡群发病率高，后期易继发感染细菌，死亡率1%～10%;2）实验室初步诊断为H3N8亚型禽流感；3）全基因组序列分析表明，该病毒为新型禽流感病毒，系欧亚禽分支H3基因、北美禽分支N8基因与G57基因型H9N2病毒内部基因组成的三源重排病毒；4）新型H3N8病毒对SPF鸡高度易感，感染鸡表现为眼睑肿胀出血，轻微呼吸道症状；病理变化为哈德氏腺黏膜坏死，鼻甲、气管纤毛上皮细胞坏死，黏膜下层炎性细胞浸润，肺脏支气管肺炎；病毒可通过口咽和泄殖腔排毒，排毒时间为5～7d；病毒在鼻甲、气管和肺脏中可高效复制，并且可以在哈德氏腺等肺外脏器复制。综上，新型三源重排H3N8禽流感病毒对鸡高度适应，对呼吸系统致病性较强，应尽快开展系统的流行病学监测，及早对病毒的源头及传播途径进行防控，力争将这种新型病毒消灭在流行早期阶段。

新型禽流感病毒对家禽养殖业可造成严重经济损失，及时发现和阻断其传播具有重要意义。2022—2023年，本实验室在我国发病鸡群中监测到新型H3N3亚型禽流感病毒的出现和传播。本研究对发病鸡群开展了临床发病情况调查，对分离病毒进行了全基因组演化分析，并对分离的代表性病毒进行了鸡致病性以及空气传播性试验。结果表明：1)H3N3最早于2022年12月在华东地区发生产蛋下降的蛋鸡群出现，随后陆续在华东、华北、东北等多个地区的鸡群中监测到，发病群体主要为产蛋鸡，鸡群发病率高，死亡率低(1%～5%),主要引起产蛋率急性下降(10%～40%)。2)病毒全基因组序列分析显示，H3N3病毒为新型重排病毒，由鸡群中流行的H3N8病毒与H10N3病毒重排产生，6个内部基因来源于H9N2病毒。3)与H3N8病毒类似，新型H3N3病毒对鸡群高度易感，可在鸡鼻甲、气管、肺等呼吸器官中高效复制并排毒，引起呼吸系统严重病理损伤。4)空气传播性结果表明，新型H3N3病毒可在鸡群之间空气传播，而H3N8病毒不能在鸡群间空气传播。综上，新型H3N3禽流感病毒对鸡具有较强的致病性和传播性，有可能成为新的优势流行病毒，对我国家禽养殖业威胁较大，需要开展进一步的防控研究。

【目的】验证斑鸠对H9N2亚型禽流感病毒的易感性,测定斑鸠呼吸道上皮细胞表面流感病毒受体的类型和分布。【方法】以5×104EID50/只的剂量经滴鼻、点眼途径感染A/Chicken/Beijing/2/2009(H9N2)亚型禽流感病毒,共感染8只斑鸠和8只SPF鸡,对试验斑鸠和SPF鸡进行临床症状、大体病变、组织学病变的观察及病毒抗原的定位、病毒分离和感染抗体的测定。【结果】攻毒后5d,斑鸠和SPF鸡未见异常临床表现和大体病变,病理组织学检查发现斑鸠的喉头、气管上段、中段和下段上皮细胞均有不同程度的脱落;在斑鸠的喉头、气管上段、中段和下段上皮细胞的胞浆内检测到了大量阳性流感病毒蛋白颗粒;斑鸠...

以H5N1亚型禽流感病毒接种鸡胚 ,收取鸡胚液为抗原研制了禽流感灭活疫苗 ,并对制苗抗原以及疫苗的物理性状、安全性、免疫效力、免疫剂量和保护期等进行了试验。结果表明 ,获得了较高效价的制苗抗原 ,灭活前后HA分别为 2 10 0～ 11 0 和 2 9 0～ 10 0 。试制疫苗物理性状符合要求 ,安全性良好。试验鸡在免疫 14d后血清抗体达到2 7 5,2 10d血清HI抗体仍维持在 2 5 0 左右 ;免疫后 18d使用高致病性H5亚型禽流感病毒攻毒 ,获得 10 0 %的保护。分别使用 0 1,0 3和 0 5mL免疫鸡 ,发现 0 3～ 0 5mL剂量组免疫后血清抗体达到...