【目的】克隆与鉴定美洲斑潜蝇(Liriomyza sativae)气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)基因,并对其序列特征、表达情况、系统发育及蛋白功能进行研究,为深入研究美洲斑潜蝇嗅觉机制提供依据。【方法】通过PCR技术克隆美洲斑潜蝇OBP13编码区全长,用DNAMAN对其进行序列分析,用BLAST进行同源性比较,并使用MEGA6.0构建进化树,进行系统发育分析。通过实时定量PCR对OBP13在美洲斑潜蝇不同组织中的表达情况进行分析。构建原核表达载体,进行原核表达及蛋白

【目的】克隆斑翅果蝇(Drosophila suzukii)气味结合蛋白56h(odorant binding protein 56h,OBP56h)基因,诱导表达斑翅果蝇OBP56h重组蛋白(DsuzOBP56h),研究其与小分子化合物的结合特性。【方法】通过RT-PCR并设计特异性引物克隆斑翅果蝇OBP56h ORF全长,从NCBI数据库中下载相似度高的昆虫气味结合蛋白序列,进行序列比对和分析。以NdeⅠ和XhoⅠ为酶切位点,将OBP56h连入pET-30a(+)原核表达载体,将重组质粒转入BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞。扩大培养阳性菌株,并用IPTG诱导表达DsuzOBP56h重组蛋白。收集菌液,通过超声波破碎细胞得到蛋白,利用Ni-NTA柱纯化蛋白,进行Tris-HCl透析,用BCA法测定蛋白浓度。蛋白用50 mmol·L~(-1) Tris-HCl(pH 7.4)稀释至终浓度2μmol·L~(-1),配基用色谱级甲醇稀释至终浓度1 mmol·L~(-1),以4,4′-二苯胺基-1,1′-联萘-5,5′-二磺酸二钾盐(4,4′-dianilino-1,1′-binaphthyl-5,5′-disulfonicacid dipotassium salt,bis-ANS)荧光探针为报告子,利用荧光竞争结合试验检测DsuzOBP56h蛋白与18种候选小分子化合物配基的结合特性。【结果】克隆获得了斑翅果蝇OBP56h的ORF全长,共405 bp,N-端含有19个氨基酸组成的信号肽,具有6个保守半胱氨酸位点,符合OBP的典型特征,与其同属的黑腹果蝇OBP56h进化关系最近。成功连入pET-30a(+)表达载体,在1 mmol·L~(-1) IPTG、28℃条件下诱导DsuzOBP56h蛋白表达,并过柱纯化得到目的蛋白。荧光光谱试验显示,荧光探针bis-ANS与DsuzOBP56h的解离常数为0.9568μmol·L~(-1),适合作为本试验中竞争性荧光结合试验的报告子;进一步的荧光竞争结合试验表明,在18种候选配基中,苦味物质盐酸小蘖碱和香豆素与DsuzOBP56h的结合亲和性较强,解离常数分别为12.16和17.93μmol·L~(-1),柚皮素与DsuzOBP56h的解离常数为25.32μmol·L~(-1),草莓叶片产生的一种对斑翅果蝇具有吸引作用的挥发性气味物质β-环柠檬醛也能与DsuzOBP56h结合,其解离常数为31.37μmol·L~(-1)。【结论】斑翅果蝇气味结合蛋白OBP56h能与测试的多种植物苦味物质和挥发性气味物质结合,表明DsuzOBP56h很有可能参与斑翅果蝇对食物味觉和嗅觉的识别行为,研究结果可为理解斑翅果蝇的取食行为提供理论依据,并为开展斑翅果蝇的生态防控提供新思路。

【目的】克隆南瓜实蝇(Bactrocera tau)的气味结合蛋白(odorent binding proteins, OBPs)基因,并分析其相关生物学信息,为了解南瓜实蝇的嗅觉机制提供参考。【方法】基于南瓜实蝇转录组测序结果筛选获得OBPs基因并进行生物信息学分析,通过基因克隆测序验证鉴定OBPs基因,并采用sqRT-PCR检测OBPs在雌、雄虫不同组织中的分布情况。【结果】经PCR产物测序验证和BLAST比对后共鉴定得到6个南瓜实蝇OBPs基因,序列长度在498～955 bp,编码128～314 aa,预测分子量大小为14.67～36.24 kDa,等电点为4.69～8.16,且每个OBP序列的N端均具有16～26 aa组成的信号肽序列,属于1个Minus型和5个Classic型。不同类型的OBPs均具有各自典型保守的Cys位点。6个OBPs分化明显,序列相似度在30%～51%。系统进化树表明,6个OBPs与瓜实蝇(Zeugodacus cucurbitae)的OBPs亲缘关系较近,柑橘大实蝇(Bactrocera minax)次之。半定量RT-PCR检测显示,6个OBPs在雌、雄虫不同组织中均有表达,而OBP14在雄虫腹部不表达,OBP15在雌虫腹部不表达。【结论】上述研究结果为进一步研究南瓜实蝇嗅觉识别分子机制和引诱机制奠定了基础。

利用RT-PCR和RACE方法克隆获得瓜实蝇Bactrocera cucurbitae(Coquillett)普通气味结合蛋白(general odorant binding protein,GOBP)基因的cDNA全长序列,命名为BcucOBP。测序结果表明,BcucOBP开放阅读框全长447 bp,编码149个氨基酸。氨基酸序列比对及三维结构同源建模表明,此序列具有OBPs的典型特征,序列中具有6个保守的半胱氨酸和6个α螺旋区域。构建了重组表达载体pET28a(+)-BcucOBP,并转化大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE及Western blotting分析表明,在IPTG进...

【目的】研究中华蜜蜂(Apis cerana cerana)体外重组普通气味结合蛋白AcerASP2与不同气味信息的结合功能和模式。【方法】通过诱导条件的优化和纯化,在获得的重组AcerASP2蛋白基础上,研究竞争性荧光探针1-NPN及不同结构气味信息与蛋白的相互作用关系,并通过同源建模和分子对接解析蛋白与气味信息的结合模式和机理。【结果】通过条件摸索获得了可溶性表达的重组中蜂ASP2蛋白,荧光光谱分析1-NPN与AcerASP2的解离常数K1-NPN为7.38μmol.L-1,结合位点数n为1.0321。在7种气味信息中,4-烯丙基藜芦醚亲和力最强,其IC50和解离常数KD分别达到7.09和...

用药膜法(成虫)、浸叶法(幼虫)分别测定了南美斑潜蝇和美洲斑潜蝇实验种群及田间种群对Avermectin类农药的敏感性,并在1998年至2002年对昆明市官渡区南美斑潜蝇和元谋县美洲斑潜蝇田间种群进行了敏感性监测。结果表明,Avermectin类农药对斑潜蝇同一种群的成虫和幼虫的毒力不同,幼虫比成虫更为敏感;在云南省南美斑潜蝇的4个田间种群中,最为敏感的是云南省曲靖市蚕豆南美斑潜蝇种群,最具有耐药性的是昆明市北郊云南省农科院园艺所温室蔬菜南美斑潜蝇种群;1998年至2002年的田间监测结果表明,南美斑潜蝇和美洲斑潜蝇田间种群对1.8%爱福丁乳油的敏感性呈波形曲线变化,其中2000年官渡及元谋的...

通过药效试验对农保乐、农哈哈杀虫素、杀虫单、毒死蜱、功夫、灭扫利和万灵轮用在大田中防治香瓜上美洲斑潜蝇的效果和对天敌的影响进行了评价。结果表明：农保乐、农哈哈杀虫素、毒死蜱、功夫、灭扫利和万灵轮用处理的平均校正防治效果分别是９０．８９％、８９．８５％、８４．９５％、８４．３５％、７３．７６％和５６．７８％，防治收益分别为４３０６．４０、４２７１．１０、３７８３．８０、３７２２．２０、２２９４．６０和１３４６．２０元／ｈｍ２。同时，农保乐和农哈哈杀虫素对美洲斑潜蝇主要寄生天敌釉姬小蜂Ｃｈｒｙｓｏｃｈａｒｉｓｓｐ．、新釉姬小蜂Ｎｅｏｃｈｒｙｓｏｃｈａｒｉｓｓｐ．和潜蝇茧蜂Ｏｐｉｕｓｓｐ．较安全。

用功夫对美洲斑潜蝇 3龄幼虫进行抗性品系 (Cy -R)筛选 ,经 5 0代选育 ,抗性指数提高到 4 9.14倍。筛选前的LC50 值为 0 .0 15 2 g/L ,筛选后的LC50 值为 0 .2 5 0 6 g/L。敏感品系选育试验表明 ,经 10代筛选 ,抗性指数由筛选前的 5 .0 0倍降低至 1.0 0倍。对功夫产生抗性的品系对灭扫利和速灭杀丁有交互抗性 ,而对杀虫单、毒死蜱、害极灭无交互抗性 ,其抗性倍数分别为 6 .30倍、4 .0 7倍、1.4 1倍、1.35倍和 1.0 5倍

在室内和田间研究了美洲斑潜蝇对10个黄瓜品种的寄主选择性,结果表明该虫对黄瓜品种的选择差异性主要表现在叶片单位面积上取食点和产卵数的不同,而孵化率、化蛹率和羽化率在各品种间无差异。美洲斑潜蝇对津春4号黄瓜品种的选择性最强,对津杂4号的选择性最弱。经显微测量和电镜扫描可知,黄瓜叶片表皮毛的密度和长度与美洲斑潜蝇对其选择性强弱呈负相关,津杂4号叶片表皮毛的密度和平均长度分别是津春4号的2倍和3倍,表明黄瓜叶片表面物理性状特别是表皮毛的密度和长度在美洲斑潜蝇对各品种的选择性方面起主要作用。

采用３龄浸叶法在１９９６～１９９７年对广东省不同的用药水平地区植株上美洲斑潜蝇种群对毒死蜱、功夫、杀虫单及害极灭敏感性进行了监测。结果表明：以英德九龙地区作物上美洲斑潜蝇种群对药剂毒死蜱、功夫、杀虫单及害极灭最敏感，而惠州福田地区植株上美洲斑潜蝇种群对上述药剂相对较耐药。２年来不同地区的美洲斑潜蝇种群对害极灭、毒死蜱、杀虫单、功夫的敏感性变化不大，１９９７年１０月惠州福田地区种群对上述药剂的抗性指数分别为１．０８、１．５５、１．６３和５。拟除虫菊酯类农药功夫在惠州福田地区处于低抗水平。

从生活史、生活习性、发生与环境的关系、繁殖特征及种内竞争、空间分布格局及抽样技术、测报技 术、综合治理技术等方面综述了美洲斑潜蝇的研究进展,并对今后的研究趋势进行了展望。

　以单位叶面积取食点数、虫道数等为选择性指标,在室内和田间就美洲斑潜蝇对3种作物15个品种的选择性进行了研究。结果表明,美洲斑潜蝇对同种作物不同品种的选择性差异显著,其中对黄瓜品种夏丰1号,番茄品种L-402和菜豆品种地豆王2号选择性较强,对黄瓜品种西农58,番茄品种毛粉802和茸粉的多毛株型以及菜豆品种95-33架豆王选择性较弱;对不同作物的选择性差异亦显著,在苗期选择性由强到弱依次为菜豆>番茄(除多毛株型外)>黄瓜>番茄多毛株型,在成株期由强到弱依次为菜豆>黄瓜>番茄。

【目的】通过研究铜绿丽金龟(Anomala corpulenta)气味结合蛋白11(odorant binding protein 11,OBP11)与寄主植物挥发物的结合特性,探讨AcorOBP11的功能,为阐明铜绿丽金龟识别寄主植物的嗅觉分子机制打下基础。【方法】设计特异性引物,通过RT-PCR克隆AcorOBP11,分析其序列特征并与相似序列进行对比;将目的基因OBP11连入原核表达载体pET28a后,重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)。利用IPTG诱导AcorOBP11重组蛋白的表达,超声破碎菌体,取上清液过镍柱,利用重组肠激酶切除His标签后再次过镍柱纯化获得目的蛋白;纯化后的蛋白以1-NPN为荧光探针开展荧光竞争结合试验,测定AcorOBP11蛋白与37种寄主植物挥发物的结合特性;利用Modeller对AcorOBP11进行同源建模,以冈比亚按蚊气味结合蛋白AgamOBP48(PDB ID:4ij7)作为模板,获得其三维结构;利用Autodock半柔性对接将蛋白与化合物对接,模拟AcorOBP11与6种候选寄主植物挥发物的结合情况。【结果】克隆获得了AcorOBP11全长基因,开放阅读框共639 bp,N末端有17个氨基酸组成的信号肽,具有8个保守的半胱氨酸位点,属于Plus-C OBP亚家族,进化树结果表明其与HparOBP9进化关系最近。AcorOBP11成功连入pET28a表达载体,在0.25 mmol·L~(-1) IPTG、37℃条件下诱导表达,并通过两次镍柱纯化得到目的蛋白。竞争结合试验结果表明,AcorOBP11结合谱较广,对α-紫罗兰酮、异戊醛、丙烯酸-2-乙基己酯、乙酸龙脑酯、柠檬烯、反-2-己烯醛、2-乙基己醛、异戊酸等13种寄主植物挥发物有较好的结合能力。其中,与寄主植物挥发物α-紫罗兰酮结合能力最好,竞争解离常数为22.78μmol·L~(-1)。构建了AcorOBP11三维结构图并进行蛋白构象评估后,与6种化合物进行分子对接,结果表明AcorOBP11与α-紫罗兰酮结合自由能最低,为-24.74 kJ·mol~(-1),表明其与α-紫罗兰酮的结合能力最强,与荧光竞争结合结果一致;从对接图还可以看出,α-紫罗兰酮不仅与AcorOBP11在Cys163处形成氢键,而且其疏水端进入了蛋白的疏水腔,两个甲基与蛋白表面高度契合,因此,α-紫罗兰酮与蛋白间结合能力最强。【结论】AcorOBP11能够识别多种寄主植物挥发物,推测其在铜绿丽金龟成虫定位寄主植物中发挥重要作用,此研究结果为生态防控铜绿丽金龟提供了新思路。

【目的】利用昆虫的嗅觉识别机制,以化学感受蛋白作为潜在的靶标,干扰昆虫的寄主定位及交配等行为,用于害虫综合治理。【方法】克隆并纯化了1个新的苜蓿盲蝽化学感受蛋白Alin-CSP6,进行了113种气味化合物对Alin-CSP6的荧光竞争性结合试验,将荧光竞争结合试验筛选出强结合力的气味标样采用"Y"型嗅觉仪验证行为反应,并采用同源建模的方法构建Alin-CSP6的3D结构。【结果】Alin-CSP6具有较广谱的结合力,能够与醇、醛、酮、酯、萜、芳香族等多种化合物结合并表现较强的结合能力。其中,β-香茅醇(β-citronellol)、反式-2-己烯醛(trans-2-hexene aldehyd...

【目的】研究三叶草斑潜蝇(Liriomyza trifolii)卵密度和幼虫密度对其生长发育的影响,探索其种内竞争的密度效应;明确三叶草斑潜蝇与美洲斑潜蝇(L.sativae)在不同1龄幼虫密度下,各自幼虫对食物资源的竞争能力,探索两种斑潜蝇之间的种间竞争取代机制。【方法】在实验室饲养条件下,用针刺死三叶草斑潜蝇多余的卵和幼虫,使其形成不同的卵密度梯度和1龄幼虫密度梯度,再继续培养。根据相关文献判定昆虫各种致死因子是否存在密度依存性的方法,令N1为该因子作用前的虫口数,N2为该因子作用后的虫口数。以lgN1为因变量,lgN2为自变量,求回归系数,再以lgN1为自变量,lgN2为因变量,求回归系...