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[期刊] 华北农学报
[作者]
王宪军 向华 张旭梅 任玉鹏 朱江江
旨在探究羊口疮病毒ORFV118蛋白对山羊睾丸支持细胞周期、凋亡以及诱导机体免疫应答相关的4种细胞因子(IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α)表达水平的影响。在ORFV118基因克隆基础上，成功构建真核表达载体pEGFP-ORFV118;将pEGFP-ORFV118转染山羊睾丸支持细胞，Western Blot鉴定ORFV118蛋白表达的正确性；流式细胞仪检测ORFV118基因对细胞周期及凋亡的影响；RT-qPCR检测细胞周期相关基因CDK2和P21、凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Caspase3、Caspase7、P53和BCL2L11的mRNA的表达水平，并利用RT-qPCR和ELISA方法检测免疫相关的细胞因子表达的变化。结果显示，成功扩增ORFV118基因，全长为309 bp。ORFV118蛋白的表达阻滞了细胞的DNA合成期(S期),促进了DNA合成后期(G2/M期)且下调基因CDK2的mRNA表达水平；可抑制细胞的凋亡作用，且下调促凋亡基因Caspase3、Caspase7、SOCS2的mRNA表达水平；对细胞因子IL-1β和IFN-γ呈不同程度的抑制作用，而对IL-6和TNF-α呈促进作用。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
杨柳 许国洋 牟豪 白运川 余远迪
以提取羊口疮痂皮中病毒的DNA为模板，用PCR扩增羊口疮病毒(ORFV)的059基因序列，并进行基因克隆、测序鉴定和生物信息学分析；优化合成059基因编码序列，连接载体pET42a(+)，转化Escherichiacoli BL21(DE3)；用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导阳性克隆菌，采用免疫印迹检测表达的F1L蛋白，并以His柱纯化蛋白、梯度法复性及Bradford法测定蛋白浓度；将BHK21细胞铺于12孔板中培养至单层，分别作F1L蛋白、山羊痘病毒(GTPV)、先蛋白后病毒、蛋白和病毒混液4种方式孵育，利用荧光定量PCR测定孵育至1.0、6.0h的细胞黏附GTPV的量，研究ORFV F1L蛋白对GTPV黏附BHK21细胞的影响。结果表明：成功获得了ORFV重庆石柱分离株(ORFV–CQsz)的059基因编码序列，其编码的F1L蛋白包含1个结合细胞表面硫酸乙酰肝素受体的结构域，显示出肝素结合活性；该蛋白羧基端有2个跨膜区，不利于蛋白质的表达，但优化DNA序列构建的重组质粒菌，经IPTG诱导后获得对F1L蛋白的高效表达；免疫印迹显示F1L蛋白对ORFV抗体有较好的反应原性；Bradford法测定的纯化复性的F1L蛋白质量浓度为1.06mg/m L；荧光定量PCR检测数据显示，不同孵育处理下GTPV黏附细胞的拷贝数不同，表明F1L蛋白对GTPV黏附BHK21细胞呈现一定的干扰作用，能降低病毒黏附到细胞的拷贝数。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
杨柳 许国洋 牟豪 白运川 余远迪
以提取羊口疮痂皮中病毒的DNA为模板，用PCR扩增羊口疮病毒(ORFV)的059基因序列，并进行基因克隆、测序鉴定和生物信息学分析；优化合成059基因编码序列，连接载体pET42a(+)，转化Escherichiacoli BL21(DE3)；用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导阳性克隆菌，采用免疫印迹检测表达的F1L蛋白，并以His柱纯化蛋白、梯度法复性及Bradford法测定蛋白浓度；将BHK21细胞铺于12孔板中培养至单层，分别作F1L蛋白、山羊痘病毒(GTPV)、先蛋白后病毒、蛋白和病毒混液4种方式孵育，利用荧光定量PCR测定孵育至1.0、6.0h的细胞黏附GTPV的量，研究ORFV F1L蛋白对GTPV黏附BHK21细胞的影响。结果表明：成功获得了ORFV重庆石柱分离株(ORFV–CQsz)的059基因编码序列，其编码的F1L蛋白包含1个结合细胞表面硫酸乙酰肝素受体的结构域，显示出肝素结合活性；该蛋白羧基端有2个跨膜区，不利于蛋白质的表达，但优化DNA序列构建的重组质粒菌，经IPTG诱导后获得对F1L蛋白的高效表达；免疫印迹显示F1L蛋白对ORFV抗体有较好的反应原性；Bradford法测定的纯化复性的F1L蛋白质量浓度为1.06mg/m L；荧光定量PCR检测数据显示，不同孵育处理下GTPV黏附细胞的拷贝数不同，表明F1L蛋白对GTPV黏附BHK21细胞呈现一定的干扰作用，能降低病毒黏附到细胞的拷贝数。
[期刊] 华北农学报
[作者]
庞峰 龙琴琴 梁绍波
旨在对羊口疮病毒(ORFV)ORFV113蛋白进行转录动力学分析、真核表达及亚细胞定位研究。使用DNAStar软件对ORFV-JS株ORFV113基因进行序列比对分析；在阿糖胞苷(Arac)存在(Arac+)或不存在(Arac-)的情况下，于ORFV感染Hela细胞后多个时间点(2,4,6,12,24 h)收获细胞，提取细胞总RNA,逆转录PCR(RT-PCR)扩增ORFV113基因，确定ORFV113的动态转录水平；以ORFV-JS株基因组为模板，PCR扩增ORFV113基因，将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中，构建pEGFP-ORFV113重组质粒，经酶切、测序鉴定正确后，使用脂质体Lipofectamine 3000瞬时转染pEGFP-N1质粒和pEGFP-ORFV113重组质粒至HEK293细胞，通过Western Blotting鉴定ORFV113-EGFP融合蛋白的表达；将pEGFP-N1质粒和pEGFP-ORFV113重组质粒瞬时转染Hela细胞，24 h后使用Hoechst 33342对细胞核染色，倒置荧光显微镜下观察ORFV113蛋白的亚细胞定位。结果表明，ORFV-JS株ORFV113基因全长627 bp,在ORFV毒株中高度保守，属于ORFV早期基因；成功构建了pEGFP-ORFV113重组质粒，ORFV113-EGFP融合蛋白在HEK293细胞中成功表达，大小为60～70 ku,比预测分子量大10～20 ku,预示ORFV113蛋白发生了翻译后修饰；亚细胞定位研究表明，ORFV113蛋白主要定位在Hela细胞的胞质中。综上，本研究成功地对ORFV113蛋白进行了转录动力学分析、真核表达及亚细胞定位。
[期刊] 华北农学报
[作者]
杨迪 黄玲巍 杨雅雯 乔自林 王家敏
表皮生长因子受体（EGFR）在许多实体肿瘤中过度表达，建立稳定过表达犬EGFR蛋白的MDCK细胞株，有利于为研究犬或人类肿瘤疾病提供良好的细胞模型和研究基础。首先制备目的片段以构建EGFR基因过表达载体，与慢病毒包装载体共同转染至293T细胞中，48 h后提取上清液经纯化获得EGFR基因过表达慢病毒液。将其转染至MDCK细胞中，经嘌呤霉素筛选和单细胞克隆后观察感染效率，RT-qPCR和Western Blot、间接免疫荧光分别检测基因及蛋白的表达，建立EGFR蛋白过表达MDCK细胞株。使用流式细胞仪分别检测过表达及对照细胞株的细胞凋亡和细胞周期。犬EGFR基因位于18号染色体，由编码跨膜糖蛋白的30个外显子组成。经反应体系，PCR产物交换入线性化表达载体，获得了阳性转化子8个，大小为738 bp。所获EGFR基因过表达慢病毒滴度为3.5×108 TU/mL。转染MDCK细胞后在荧光显微镜下观察荧光效果显著，经检测EGFR基因及其蛋白在细胞中的表达量显著升高。间接免疫荧光试验显示，EGFR在细胞中表达明显增强。过表达细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率显著上升，且在G2/M期发生阻滞。成功建立一株稳定的犬EGFR过表达MDCK细胞株，犬EGFR的过表达催化了细胞分裂，使DNA复制加快，同时刺激了细胞凋亡。
关键词：
犬肾细胞系 表皮生长因子受体 慢病毒载体
[期刊] 西南农业学报
[作者]
王帅 贾琦珍 陈根元 王连群 张玲
研究小花棘豆中毒对家兔睾丸生精细胞凋亡的影响,进一步探讨小花棘豆的中毒机理。将24只雄性家兔随机分为对照组和试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组,试验组分别按照Ⅰ组15%(苦马豆素含量30 mg/kg)、Ⅱ组30%(苦马豆素含量60 mg/kg)、Ⅲ组45%(苦马豆素含量90 mg/kg)的比例添加小花棘豆,对照组仅饲喂苜蓿干草,试验期70 d。分别于攻毒后第14、35、70天每次每组随机采集2只家兔的睾丸,通过TUNEL法定位,Hoechst 33258荧光染色细胞核,流式细胞仪测定细胞凋亡率和细胞周期。从第35天开始,试
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
王霞 邬静
以原代分离培养仔猪睾丸支持细胞为模型,经含不同浓度(0、2.5、5、10、20、40、80、160μmol/L)乙酸棉酚或40μmol/L乙酸棉酚加800μmol/L的乙酰半胱氨酸(NAC)的培养基培养24 h后,检测细胞增殖率、细胞内活性氧(ROS)水平和丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性、培养基中乳酸脱氢酶(LDH)活性及细胞凋亡情况,研究棉酚对仔猪睾丸支持细胞的氧化应激及细胞凋亡的影响。结果显示:棉酚呈浓度依赖性抑制仔猪睾丸支持细胞增殖率,棉酚浓度大于等于10μmol/L时,细胞增殖率极显著降低;棉酚造成细胞内ROS水平显著升高、SOD活性显著降低、MDA含量升高及培养基中LDH活性升高;NAC显著抑制棉酚诱导的细胞内ROS水平升高、细胞增殖抑制及细胞凋亡。表明棉酚能诱导仔猪睾丸支持细胞凋亡,这可能与过量ROS生成而造成细胞氧化应激有关。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
梁亚冰 张琪 常嵘 童德文 许信刚
【目的】克隆及真核表达猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)陕西分离株的3a和3b基因,研究表达蛋白在细胞中的分布及其对细胞周期的影响。【方法】利用软件Primer 5.0参照Genbank公布的序列设计两对分别针对TGEV非结构蛋白基因3a和3b的特异性引物。采用RT-PCR方法从TGEV陕西分离株克隆3a和3b基因,再将其与真核表达载体p EGFP-N1连接,构建真核表达质粒p3a-EGFP-N1和p3b-EGFP-N1。利用脂质体转染法将重组质粒转染猪小肠黏膜上皮细胞(intestinal epithelial cells,...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
池雪林 曾显成 黄小红 罗树红 汪世华
通过透射电子显微技术对羊口疮病毒(ORFV)YX强毒株感染羊胚胎鼻甲细胞(OFTu)的细胞超微结构和病毒形态发生学进行研究.结果显示,成熟的病毒粒子呈椭圆形,有囊膜,大小约为150 nm×250 nm,可见两面凹陷呈哑铃形的核酸芯髓和2个侧小体结构.病毒在胞浆中复制,在高尔基体形成囊膜,最后病毒粒子通过细胞膜出芽和细胞裂解方式释放病毒粒子.感染细胞超微结构主要表现为:内质网扩张呈囊、池内分离;线粒体增生、嵴肿胀、变暗、模糊不清,最后空泡化;高尔基体出芽、扩张;细胞核溶解呈早期凋亡现象,胞浆出芽,最后整个细胞裂解、破碎.
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
冯楠楠 王冰洁 朱启航 郑王龙 邹辉 顾建红 袁燕 刘学忠 刘宗平 卞建春
[目的]探究磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/m TOR)信号通路在玉米赤霉烯酮(ZEA)诱导睾丸支持细胞(SC)自噬及影响SC细胞周期分布中的作用,揭示ZEA对雄性生殖毒性的机制。[方法]以Wistar大鼠原代睾丸支持细胞为材料,利用Western blot、流式细胞术和免疫荧光技术等方法检测PI3K/Akt/m TOR信号通路在ZEA对SC自噬及细胞周期分布的影响。[结果]随着ZEA浓度升高,PI3K/Akt/m TOR信号通路关键蛋白磷酸化水平显著或极显著下降(P<0.05或P<0.01);加入PI3K抑制剂LY294002后,微管相关蛋白1轻链3(LC3)的荧光信号强度显著增强,荧光聚点更加明显(P<0.05或P<0.05或P<0.05),且细胞周期关键激酶Cdc2的活性显著增加(P
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
陈秀霞 邓益锋 周振雷 朱捷 李晓兰 陈金丽 陶庆树 侯加法
为探讨雌激素和雄激素对鸡胚额骨成骨细胞(OB)增殖、凋亡、细胞周期及其受体mRNA转录的影响,用雌激素(17β雌二醇)和雄激素(十一酸睾酮)单独以及联合处理鸡胚额骨成骨细胞,MTT法测定细胞增殖率,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期的变化,荧光定量PCR检测成骨细胞中雌激素受体(ER)及雄激素受体(AR)mRNA的转录。结果显示:一定浓度的雌激素或雄激素在24h内均能促进成骨细胞的增殖,促进成骨细胞的细胞周期进程,但对细胞凋亡无明显作用。雌激素单独或联合雄激素作用能上调ERmRNA的转录,对ARmRNA的转录无明显作用。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘丽华 沈卫德 李兵 王文兵
【目的】研究家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nucleopolyhedroviruses,BmNPV)对家蚕卵巢细胞系(BmN)细胞周期及细胞周期蛋白基因转录水平的影响。【方法】用BmNPV感染家蚕BmN细胞,分别在病毒感染后的不同时间(12,24,36,48h),应用实时荧光定量PCR方法检测细胞周期蛋白基因CyclinA、CyclinB、CyclinE的表达情况,用流式细胞仪检测细胞周期的变化。【结果】BmNPV感染24h后,BmN细胞出现明显感染症状,变为圆形;48h后细胞核内出现多角体。随着感染时间的延长,CyclinA、CyclinB、CyclinE基因表达量均下降,分别...
关键词：
BmNPV Cyclin基因 细胞周期
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
王菊花 刘丹丹 刘琦 王佳明 董静 周杰 薛秀恒
为探究在体外培养过程中山羊睾丸支持细胞(GSCs)存在的氧化应激问题,采用2步酶消化法分离和纯化GSCs,通过形态学观察、MTT法、油红染色和流式细胞鉴定细胞活度和纯度,再用不同浓度的H2O2处理GSCs,研究GSCs的活性、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性及其DNA指数(DI)的变化。结果表明:GSCs形态为多角形状;在培养至第5天时GSCs活性最强;油红O染色鉴定多数细胞胞质含有红色的脂滴;GATA4阳性细胞率达到88.27±3.29%;添加50μmol/L H2O2组细胞存活率与对照组相比差异不显著(P>0.05),其它各组均显著低于对照组(P0.05),而其他各组均与对照组有显著差异(P
关键词：
山羊 支持细胞 分离和培养 氧化应激
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
韩乐 张国敏 杨花 庞静 万永杰 姚晓磊 王锋 张艳丽
[目的]本试验旨在建立一个实时追踪山羊细胞自噬发生状况的工具,以探讨细胞自噬对睾丸支持细胞(SC)和生殖细胞的影响。[方法]通过PCR法扩增mCherry-EGFP-LC3基因序列1 884 bp,将其导入真核表达载体pEX-3中,得到重组质粒pmCherry-EGFP-LC3;将pmCherry-EGFP-LC3及对照质粒p EX-3分别转染体外分离培养的山羊SC,饥饿处理12 h后用荧光显微镜观察融合蛋白在细胞中的表达,用RT-qPCR和Western blot检测细胞中自噬相关基因和蛋白表达变化,用
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
周波 洪海燕 旭日干 夏国良
选用磷酸二酯酶3(PDE3)特异性抑制剂Milrinone和PDE4特异性抑制剂Rolipram以及细胞周期蛋白依赖性激酶(cdk)抑制剂Roscovitine(ROSC)对绵羊卵丘卵母细胞复合物(COCs)的体外自发成熟进行研究,拟建立一种模拟体内卵泡环境的绵羊卵母细胞体外培养模型。以M 199为基础培养液,绵羊COCs在含有5 0 μmol/L的Milrinone、Rolipram、ROSC或不含上述任何抑制剂的培养液中分别培养2 4h。COCs在含有5 0 μmol/LROSC的培养液中培养2 4h ,转移到含有2 0IU/LFSH的培养液继续培养2 4h检查核相。结果表明:COCs在M...
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